Name: アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ前立腺内注射法によるマウス同種同系正位腫瘍モデルの構築。去勢抵抗性前立腺癌の発生機構と治療応答を再現性高く評価する手法を確立し、がん免疫研究に有用なプラットフォームを提供します。

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この作品は、国立衛生研究所健康補助金 Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898)、Sarki Abdulkadir (NCI R01 CA167966、NCI R01 CA123484 NCI P50 CA180995)、ジョナサン ・ アンカー (NCI F30 CA203472) によって支えられました。

すべてのこのプロトコルに記載されている動物のプロシージャが倫理規程と適切な大学機関動物ケアの承認および使用委員会 (IACUC) に準拠して実行されます。
1. 手術材料やがん細胞の調製
<ol><li>前にオートクレーブ ミクロ解剖はさみ、グレーフェ ピンセット、グレーフェ組織鉗子針縫合カッター ホルダー外科の日とカーテンの適切な番号。酸化エチレンガス (図 1) で 50 μ L のシリンジと 28 ゲージ針を消毒します。</li>
	<li>手術、Myc キャップ細胞 10% 牛胎児血清 (FBS) と 37 ° C 5% CO2インキュベーターで 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) 補われる RPMI で 10 cm 皿の前日。発光や蛍光腫瘍監視、適切なベクトルで 293 t 細胞を transfect、その後 0.45 μ m のフィルター レンチ31Myc キャップ セルを変換します。100% 伝達積極性を持つ安定したセルラインを生成するセルを並べ替えます。 注: は、無菌条件の下ですべての組織培養を行い、すべての細胞が無料のマイコ プラズマであることを確認します。Myc キャップ32, 本研究で利用したマウスの前立腺癌細胞株は、ホタルのルシフェラーゼと mCherry の両方を安定して表現する導入です。C mycから分離した Myc キャップ セル行 iss-強制こんにち myc マウス、およびこれらの細胞含む増幅アンドロゲン受容体 (AR)、アンドロゲン依存性32と33マウス去勢後 CRPC 腫瘍を形成します。本研究ではすべてのマウスは、6-8 週齢雄/ニュージャージー州 FVB マウスです。代替マウス前立腺癌細胞は、マウスで適切な遺伝的背景と同様、ひと前立腺癌細胞株またはプライマリ患者由来の前立腺癌細胞のマウスで使用できます。最適な注入あたりの細胞数は、代替細胞の経験的に決定する必要があります。さらに、mCherry の代替として GFP、ポジトロン断層法 (PET)、磁気共鳴画像 (MRI) やコンピューター断層撮影 (CT) を含む腫瘍を可視化する画像診断の代替を利用できます。</li>
	<li>手術前に、の晩は、雪解けへの 4 ° C でマトリゲル基底膜マトリックスおよびフェノールレッド フリーの氷を配置します。</li>
	<li>手術の日、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗ったと 0.25% トリプシン-EDTA をデタッチによって細胞を収集します。10 %fbs と 1 %rpmi とトリプシンを中和する P/s.</li>
	<li>5 分間 400 x g で細胞を遠心します。</li>
	<li>FBS または P/S なし RPMI 10 mL でセルを洗浄して</li>
	<li>セルをカウントし、6.67x107セル/mL (1 × 106セル/15 μ L) の濃度で PBS で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>最終濃度 1 × 106セル/30 μ L で 1:1 PBS/マトリゲル細胞懸濁液を作成するマトリゲルの等しいボリュームを追加し、凝固を防ぐために注射まで氷の上細胞を保ちます。 注: は、マトリゲルに細胞懸濁液を準備する 3 h 内イントラ前立腺注射を実行します。以上 5 マウスに前立腺内注射を実行している場合は、新鮮なマトリゲル細胞懸濁液を準備する上記の手順を繰り返します。</li>
</ol>2. 術前マウス作製
注: 家のマウス大学動物施設における少なくとも 1 週間手術前に十分な適応を可能にし、動物のストレスを最小限に抑える。手順 2.1 2.6 は、外科医の助手によって実行されます。すべての後の手術の手順は、無菌手技と滅菌手袋と手術器具を使用して外科医によって実行されます。
<ol><li>イソフルラン (商工会議所経由で誘導の 2-5%、鼻の円錐形によってメンテナンスのための 1-3%) を持つマウスを麻酔します。つま先ピンチ反射の消失、完全な誘導を確認します。</li>
	<li>マウスの重量を量るし、管理鎮痛ブプレノルフィンの少なくとも 0.05 mg/kg 皮下 注: マウス重量 ≥20 g は成功した前立腺内注入に最適です。</li>
	<li>角膜の乾燥を防ぐために両方の目に、眼軟膏に潤滑します。</li>
	<li>腹部からのすべての毛を剃る。</li>
	<li>腹部を手術時手洗い滅菌アルコール ワイプに続いて滅菌非付着パッドを使用しての円形のアプリケーションの 3 つのラウンドで滅菌します。乾燥する腹部を許可します。 注: 外科プロシージャの残りの部分、滅菌手袋、手術器械だけ連絡することが滅菌マウス腹部。</li>
	<li>きれいな手術顕微鏡の目的の下で直接加熱パッドできれいな表面の上に仰臥位のマウスを転送します。</li>
	<li>滅菌ドレープとマウスを小さな穴を腹部の上にカットでカバーします。</li>
</ol>3. 内前立腺注入
注: 無菌条件の下ですべての手術手順に従います。顕微鏡やマウス配置のいずれかを調整する非滅菌の他のオブジェクトは外科医の助手によって行う必要があります。
<ol><li>実行、陰茎や包皮腺 (図 1) に優れた腹部の正中線に沿って外側の皮膚の約 1 cm 切開します。</li>
	<li>外側の腹部の皮膚と内側の腹部の筋肉間の結合組織の層間ハサミを開くを区切ります。</li>
	<li>腸や膀胱 (図 1) を刺さないように筋肉を高めるために鉗子を使用しながら内側の腹部の筋肉のような切開を実行します。</li>
	<li>二国間の精嚢 (図 1 a白) の 1 つを見つける/前立腺前葉 (図 1 aブラック)、しばしば後部, 側の, と膀胱 (図 1 a黄色)、しかしこれにわずかに優れているがマウスの間に異なる場合があります。.前立腺前葉は、半透明と白の精液小胞の小彎側に接続されています。</li>
	<li>グレーフェ組織鉗子を使用して組織に精嚢 (図 1E) 穴をあけることがなく張力を作成する精嚢の先端をゆっくりと上げてください。</li>
	<li>セルがペレットが、異邦人のピペッティング (外科医の助手によって実行されます)、Myc キャップ マトリゲル ソリューションをミックスとゆっくりと気泡を避けるために針に 30 μ L (1 x 10 の6セル) を吸引します。</li>
	<li>前立腺前葉の長い軸に平行に、針の傾斜面を慎重に挿入します。ゆっくりと、葉に 30 μ L を注入し、(図 1 f) の漏れを防ぐために針をゆっくりと上げます。前立腺前葉 (図 1) の充血によって十分な注入を確認します。</li>
	<li>精嚢と約 30 のマウス外挿入された前立腺葉を慎重に保持、葉の内で部分的に固めるにマトリゲルを許可する s。この時間の間に挿入された前立腺葉で押すことがなく非同所性同種腫瘍の開発を防ぐためにアプリケーターの先端滅菌ポリエステルを使用腹部の携帯ソリューション漏洩を収集します。</li>
	<li>耳たぶを圧迫せず腹部に精嚢と前立腺注入の葉に戻ります慎重に。任意の外部組織を交換してください。</li>
	<li>5-0 vicryl 吸収逆カット針縫合糸と内側の腹部の筋肉を閉じるに連続縫合を実行します。</li>
	<li>縫合 4-0 ナイロン モノフィラメント非吸収性逆カット針縫合糸と外側の腹部の皮膚を閉じますを実行します。 注: 滅菌 9 mm ステープルは、外側の腹部の皮膚を閉じるにも使用できます。ただし、縫合糸と対照をなして、彼らは信号のイメージング、後続発光と蛍光腫瘍を妨げます。</li>
	<li>(オープン外科医助手) 滅菌エタノール ワイプときれいにすべてのツール、次のマウスを使用する前に乾燥するためのツールの 30 s. ガラス ビーズ滅菌器で配置。</li>
	<li>残マトリゲルによる目詰まりを防ぐために注射器や針 (オープン外科医助手) 滅菌生理食塩水をフラッシュします。 注: 外科医助手が表示されますすべての操作、注射前に Myc キャップ マトリゲル溶液を混合するすべての非無菌マウスの術前準備およびマウスの術後ケアを実行します。マウスの前立腺内の各プロシージャが 20-30 分必要になりますので、時間を最小限に抑える外科医助手として外科医が現在のマウスを縫合、次のマウスを準備を開始できます。</li>
</ol>4. 術後マウス ケア
<ol><li>鎮痛剤メロキシカムの 1 mg/kg の管理すぐにサウスカロライナ、24 h、および手術後 48 時間。</li>
	<li>加熱パッドの上半分に配置ない寝具ケージ内回復するマウスを許可します。彼らを取り戻すまで通常の機動性と、活動後、ケージの床の上に食べ物ときれいなケージでそれらを置く手術後、少なくとも 30 分間マウスを監視します。</li>
	<li>さらに手術後適切な創傷治癒、体重、グルーミング、および歩行の毎日マウスを監視します。戦いのすべての証拠に個々 のケージに別のマウス。</li>
	<li>手術後 14 日以内の任意の残りの縫合糸を削除します。</li>
</ol>5. 発光腫瘍イメージング
<ol><li>滅菌フィルター Na+または K+の製造元によって説明し、光から保護として D-ルシフェリンを準備します。</li>
	<li>ルシフェリンの体重の 10 μ L/g とマウスの腹腔内ベンゼン挿入します。</li>
	<li>34,35と前述したように、少なくとも 10 分後、IVIS スペクトル イメージング システム、画像マウス。</li>
	<li>上記34,35として生活のイメージ ソフトウェアを使用して画像を分析します。 注: IVIS 画像解析は正常前立腺内注入と実験群間で腫瘍量を正常化する初期の腫瘍の開発を判断するのに役立ちます。ただし、発光や蛍光信号の強さに応じて彩度はで実際の腫瘍の大きさの増加にもかかわらずイメージ定量化、高原を引き起こす可能性があります。したがって、腫瘍の成長の後の段階で IVIS イメージング有用かもしれない画像飽和後治療の成功時に腫瘍サイズの減少ではなくサイズの増加を決定します。</li>
</ol>6. 腫瘍、腫瘍の分析のコレクション生存エンドポイント
<ol><li>腫瘍症例の分析を収集し場合、人道的安楽死によって CO2の露出とセカンダリの頚部転位または方法承認 IACUC によってマウスそして腹部から腫瘍を解剖します。腫瘍は前立腺にあるがんをする必要があります。 注: 腫瘍前腹壁に添付または腹部全体シードを示し貧しいまたは漏れ前立腺内注入、同所性同種腫瘍と考えはないです。</li>
	<li>腫瘍の重量を量る。</li>
	<li>腫瘍体積として π/6 × L × W × H を計算 (L = 腫瘍、W の長い軸の長さ = 垂直幅、H = 垂直高さ)。</li>
	<li>腫瘍の組織学 (10% 中性緩衝ホルマリンで修正) によって分析することができます, フローサイトメトリー (単一細胞懸濁液を作成)、タンパク質 (組織ライセート RIPA バッファーの準備)、または RNA (RNAlater ですぐに場所組織)。</li>
	<li>免疫学的解析、また前立腺腫瘍排水傍大動脈のリンパ節 (図 1 b、オレンジ) と脾臓を収集します。 注: 次の生存のためのマウス、このモデルのエンドポイントが出血腹部腹水36の外観として定義や歩行やグルーミング、立毛37を減少しました。生存時間解析のマウスは前と術後鎮痛法 (プロトコル手順 2.2 4.1) を受け定期的に監視する必要があります。マウスは、すべての戦いが発生し、上記のエンドポイント情報のいずれかの出現に人道的に安楽死する必要がある場合、個々 のケージに区切る必要があります。</li>
</ol>7. 手術去勢 CRPC をモデル化する
<ol><li>上記を実行、CRPC をモデリングする前立腺内注入プロトコル (プロトコルの手順 1-5)。</li>
	<li>少なくとも一週間後、腫瘍の開発の後前述38経由で焼灼、外科的去勢を実行します。</li>
	<li>生物発光イメージングによる腫瘍縮小および再発を監視します。去勢後、腫瘍の回帰が 3 日以内に発生して再発は CRPC を表す約 30 日間内で行われます。</li>
</ol>

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本稿では外科内前立腺癌細胞の注射を実行するプロトコルの概要を説明します。我々 はアンドロゲン依存性とMYC過剰発現を利用 (ひと前立腺癌39の 80-90% を発現増加見て) マウスの前立腺癌細胞株、Myc キャップ、もともとこんにち Myc マウス32 から分離されました。、33。この細胞株はルシフェラーゼと非侵襲的体内の生物発光と蛍光腫瘍イメージングのための mCherry の両方をそれぞれ表現する導入安定。さらに、外科的去勢は腫瘍の回帰とその後の再発につながる、アンドロゲン依存性腫瘍の開発後も行った。したがって、我々 は免疫ホストの同所性同種アンドロゲン依存性前立腺癌と CRPC の両方をモデル化する詳細を提供します。
マウスの前立腺前葉に myc キャップ細胞を注入しました。マウス前立腺前立腺の前方、腹側、背側に葉から成り、ひと前立腺周辺ゾーン、経過のゾーン、および単一の葉40内中央のゾーンで構成されています。先行研究解剖学的および組織学的に比較しているひと末梢に背マウス葉中ゾーン、前立腺癌41の大半の人間の中央ゾーン42, , マウス葉サイト43より最新かつ包括的な分析は前頭葉と背外側の葉が前葉と比較すると、密接に関連遺伝子発現パターンを表示することを示しています。44はさらに、前立腺癌の開発は宝石40前頭葉で観察されているし、前立腺内のプロシージャの前葉は最小量の漏れでがん細胞のソリューションに必要な量の注入、変動。
サウスカロライナおよびトランスジェニック宝石を使用して癌モデル複数の欠陥と限界があります。人工 TME で栽培皮下腫瘍差分レスポンス同じ細胞およびひと疾患20,21,22から同所性同種腫瘍とは対照的に、化学療法があります。これは皮下腫瘍、抗血管新生療法18,19への差動応答によって代表されるよう変更された血管起因する可能性があります。それどころか、同所性同種腫瘍は適切な TME、ドレインのリンパ節と血管系を開発し、マウス細胞株、またそれにより腫瘍免疫と免疫療法への応答の分析を可能に実行することができます。
トランスジェニック宝石開発腫瘍免疫ホストの適切な TME はまだこれらのモデルは通常29単一または少数の遺伝子変異と腫瘍を開発することによって人間の癌を単純化します。Myc キャップと他の前立腺癌細胞株の解析では、彼らは多くの大きい体コピー数変化とやあ Myc マウスとされた派生29の他の宝石からの腫瘍よりも染色体の変化含まれていることを明らかにしました。さらに、宝石は、コストの増加とマウス繁殖の十分な力の実験を実行するために必要な時間によって制限されます。同所性同種腫瘍モデルでは、これらの制限を克服できます。人間とマウスの前立腺癌細胞株はひと疾患29に関連する多くの遺伝子を含むし、人間癌のようなまた個々 のセル30間偉大な異質性を示します。同所性同種マウス同系腫瘍免疫学的分析を可能にする同所性同種しながら人間の異種腫瘍ひと細胞治療の解析できます。最後とは異なり、注射、腫瘍の成長を監視できるように生物発光・蛍光イメージング分子式の正規化, 実験群間で腫瘍の負担する前に行を変更することができますセルの宝石と治療とに対応を監視します。外科的去勢後の CRPC 再発と腫瘍の回帰に従ってください。
このプロトコルの重要なステップは、検索および他の組織の損傷や細胞の 30 μ L の成功した前立腺内注入を実行する精嚢に穴をあけることがなく精嚢と前立腺添付前葉を外在化懸濁液の漏れと腹部全体の非直交異方性腫瘍の開発を防ぐために任意の漏れを正しく収集なし。前立腺内注入の主要な制限はマウス腫瘍の可変性を最小限に抑えるために必要な技術的なスキルを達成します。これは CRPC は、外科的去勢の追加の変数を持つのモデリングに特に重要です。Prostatically 内注入および去勢マウスも従わなければなりません密接に回復と有害事象のため彼らは 2 つの主要な生存の手術を受けていると。別の制限は、各前立腺内注入の時間です。これは削減することができますに低 20 分として、外科医としてアシスタントを準備できます次のマウスと現在のマウスは縫合されています。最後に、同所性同種 Myc キャップ腫瘍は積極的な高速成長し、原発腫瘍のため (と早くも 35 日) 約 46 日に生存エンドポイントに到達腫瘍大量。遅い腫瘍開発や長期的な治療を必要とする研究は、初期注入細胞数と治療療法の経験的最適化する必要があります。皮下腫瘍や宝石の制限と対照をなして同所性同種腫瘍モデルの上記の制限のすべてを克服することができます、およびプロトコルの追加変更は個々 の実験的ニーズに基づいて行うことができます。
として、同所性同種腫瘍モデルは生体外での使用を含む-処理された細胞、これらの細胞は研究のニーズに応じて変更できます。ここでは、ルシフェラーゼと生体内で腫瘍を監視するための mCherry を安定して表現するこれらの細胞を変更しました。腫瘍のサプレッサー PTEN、同所性同種腫瘍 (レビューで原稿) として速く育つより積極的な臨床的に関連したセルラインを生成するための CRISPR Cas9 ノックアウトも行ってきました。同所性同種腫瘍モデルでは、アンドロゲン依存性前立腺癌と CRPC とイメージ投射様相やノックダウンまたは過剰の選択遺伝子を表現する可能性の両方を勉強することの利点と、このプロトコルは、すべての貴重なリソースとして機能します。前立腺癌の研究。

前立腺癌は、最高率 (161,360 男性) を持ち、2017年1で (84,590 男性) の第 3 最も男性のがんによる死亡を引き起こすと推定されます。診断時に、前立腺の腫瘍でありアンドロゲン非依存、手術前立腺摘除術、放射線療法、および/またはアンドロゲン除去療法 (ADT) によって扱われるがそれぞれの治療は複数の主要な合併症と合併症の2に関連付けられています。,3,4,5,6,7,8,9,10. 去勢抵抗性前立腺癌 (CRPC) として ADT 後腫瘍退縮、にもかかわらずほぼすべての腫瘍が再発します。この段階で承認された治療法は、ドセタキセル、シプロイセル T 免疫療法と抗アンドロゲンの低分子 enzalutamide、abiraterone、まだ個々 の療法は 5.2 ヶ月11,以上の生存延長効果を付与12,13,14,15,16,17します。 したがって、前立腺癌のすべての段階で、男性は必要改良された治療法の選択肢とする最適な前臨床疾患モデリングは重要な合併症の管理。
正しい手順で前立腺癌細胞株は、同系や異種同所性同種腫瘍の開発につながる、マウス前立腺に外科的注入できます。同所性同種腫瘍モデルはすべて腫瘍生物学と創薬開発研究、臨床的に代表的な腫瘍微小環境 (TME) と腫瘍の開発を可能にするに最適です。先行研究は、皮下皮下腫瘍ある変更された腫瘍血管系、抗血管新生療法18,19に差分なり臨床的に正確な応答につながることを示しています。さらに、複数の研究はそれがあったかどうかに応じて、同じセル行の治療に複数の化学療法の増加又は減少の有効性投与皮下またはがん、後者の最高表現人間で見られるものを観察しています。がん20,21,22。さらに、sc のモデルではなく大腸癌同所性モデルにのみ腫瘍生成でした転移23を誘導するために必要な正しい分解酵素。最後に、免疫療法が癌治療の最前線に出てくるにつれ、彼らは前立腺癌24,25、正確な TME と同系の前臨床モデルの重要な利点を提供するためにまだ持っている、特にとして、免疫ホストのドレインのリンパ節は重要です。
腫瘍部位に基づいてこれらの矛盾した結果の責任多くの要因があります。異なる TME と癌細胞は別の組織に固有の内皮にさらされている、血管新生、腫瘍開発26,27に影響することを変更します。正しい TME と同所性同種腫瘍臨床的に関連する薬物送達、低酸素状態、抗血管新生治療28の評価を可能にします。遺伝子組み換えモデル (宝石) は長いが必要、正確な TME が含まれて繁殖、高コストとはしばしば時間単一または少数の遺伝子ノックアウトまたは臨床的に関連するレベルを超えて過剰発現の操作に基づいています。対照的に、人間の腫瘍のような同所性同種腫瘍で使用されている人間またはマウスの前立腺癌細胞株、単一細胞内および細胞29,30間異質性を表示するためにより遺伝的に複雑です。また宝石とは異なり同所性同種癌細胞イメージ投射様相を表現するように設計したり増加または、関心との in vitroとin vivoの実験結果の他の分子の減らされたレベルを直接比較することができます。同所性同種腫瘍は、プライマリ患者由来の細胞から形作ることができます。ここでは、直交異方性アンドロゲン依存性腫瘍を形成し、去勢後、同所性同種 CRPC として再発前立腺癌細胞の内前立腺注射を実行するための方法論を報告します。

<table><tbody><tr><td>Myc-CaP細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td><td>使用前にマイコプラズマフリーとして確認</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Graege鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Graefe組織鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar針ホルダー(縫合カッター付き)</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>50 マイクロ;L シリンジ 705 RN SYR</td><td>ハミルトン</td><td>7637-01</td><td>エチレンオキシドガスによる滅菌</td></tr><tr><td>28ゲージ ニードル スモールハブ RN</td><td>ハミルトン</td><td>7803-02</td><td>ポイントスタイル 4、角度 45°C;、長さ 0.75 インチ。エチレンオキシドガスによる滅菌</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>18875-093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>ペンシルリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス、フェノールレッドフリー、LDEVフリー</td><td>コーニング</td><td>356237</td>氷<td>上で4°Cで解凍します。C 使用前に一晩</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>11695-0500-2</td><td>ノースウェスタン大学比較医学センター(CCM)から取得</td></tr><tr><td>26 5/8ゲージシリンジ</td><td>BD</td><td>309597</td><td>メロキシカムおよびブプレノルフィン注射用</td></tr><tr><td>水酸化ブプレノルフィン 0.3 mg/mL</td><td></td><td>12496-0757-5</td><td>ノースウェスタン大学CCM</td></tr><tr><td>眼科から入手した規制物質軟膏潤滑</td><td>アクロン</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン外科用スクラブ (ポビドンヨード、7.5%)</td> <td>パデュー製品</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>滅菌非接着パッド</td><td>ムーアメディカル</td><td>10775</td><td></td></tr><tr><td>滅菌アルコールワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡 ステミ DV4</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ポリエステル先端アプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>25-806 1PD</td><td></td></tr><tr><td>5-0 ビクリル 吸収性逆切断針 縫合糸</td><td>縫合</td>糸 <td>J493G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 ナイロン モンフィラメント 非吸収性逆切断針縫合糸</td><td>縫合</td>糸 <td>699H</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水 0.9% 塩化ナトリウム</td><td>ホスピーラ</td><td>0409-4888-02</td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム(Eloxiject) 5 mg/mL</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>11695-6925-1</td><td>ノースウェスタン大学から取得 CCM</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン ホタル、ナトリウム塩一水和物</td><td>ゴールドバイオ</td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS スペクトラムイメージングシステム</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauery 手術用ペン</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon;抗体 (クローン 2GV6)</td><td>ベンタナ</td><td>790-4341</td><td></td></tr><tr><td>キャリパー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>アンドロゲン受容体抗体</td><td>サーモサイエンティフィ</td>ック <td>RB-9030-P1</td><td>1:500 染色希釈</td></tr><tr><td>シナプトフィジン抗体 (クローン Z66)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>18-0130</td><td>1:200 染色希釈</td></tr></tbody></table>

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

皮下の両方上の複数の利点を有するトランスジェニック遺伝子組み換えマウス モデルと、同所性同種腫瘍モデルは前臨床前立腺癌研究のための貴重なツールです。皮下腫瘍とは異なり同所性同種腫瘍は臨床的により正確な血管、腫瘍微小環境、複数の治療の反応を含まれています。対照的に遺伝子組み換えマウスのモデル、モデル低コストで実行できるし、短い時間、非常に複雑な異機種混在のマウスやひとがん細胞株の使用を伴う直交異方性にむしろその 1 つの遺伝子の変異とこれらのセル行することがでく遺伝子組み換え、イメージング エージェントを表現するような。ここでは、外科的マウスの前立腺前葉にルシフェラーゼを mCherry 発現マウスの前立腺癌細胞株を注入するためのプロトコルを提案する.これらのマウスでは、同所性同種腫瘍生体内非侵襲的監視され腫瘍体積、重量、マウスの生存、免疫の浸透をさらに分析を開発しました。さらに、同所性同種担癌マウス外科的去勢、即時腫瘍の回帰とその後の再発につながる、去勢抵抗性前立腺癌を表します。技術的なスキルは、この手順を実行する必要がある両方のアンドロゲン依存性や去勢抵抗性前立腺癌のこの同系同所性同種モデルはフィールドのすべての捜査に大いに役立つ。

本稿では、我々 手術を注射したマウス前立腺癌細胞株、Myc-キャップ (図 1 a)、前立腺前葉に臨床的に関連する TME と正しい同所性同種前立腺の腫瘍の開発につながる前立腺排出リンパ節 (図 1 b)。ミクロ解剖はさみ、グレーフェ鉗子、グレーフェ組織鉗子、縫合糸カッターと針ホルダー、50 μ L のシリンジを用いた 28 ゲージ針 (図 1) が実施されました。包皮腺 (図 1) の上約 1 cm 正中腹部切開、1 つ精嚢と前立腺添付前葉に位置していた、(図 1E) で外部化を実行する後と 30 μ L (1 x 10 の6セル) の1:1 PBS/マトリゲル細胞懸濁液は、前立腺 (図 1 階) として最初に葉の充血と漏れ (図 1) の欠如によって検証されますに注入されました。
同所性同種腫瘍の成長を監視するには、私たち安定発現するホタルのルシフェラーゼと mCherry を表現する Myc キャップ細胞腫瘍非侵襲体内の発光 (図 2 a) および蛍光 (図が続くことを可能にします。2 b)、それぞれ。このイメージングの制限の 1 つは、信号の強さに応じてを腫瘍のサイズが増加を続けながらに飽和定量化をイメージングがあります、です。したがって、高い信号強度と、この生体内イメージングは当初実験的グループ間で腫瘍量を正規化、および実験的治療後腫瘍サイズの減少の後で決定により便利。MRI や PET、CT. 小動物などの他のイメージ投射様相も利用できます。
同所性同種腫瘍は前立腺内注入 (図 3 a) 後 30 日目に腹部から切除した.同所性同種腫瘍前立腺前葉のサイトに置く必要があります。腫瘍、腹部全体の固まりまたは前方の腹部壁に接続されている不適切な前立腺内注入し、リークを示します。適切な技術と腫瘍体積 (図 3 b) と重量 (図 3) が比較的小さい標準エラーを記録できます。ただし、観察、小規模および大規模な腫瘍塊といくつかの変動があります。したがって、前処理イメージング定量化実験腕の間腫瘍負荷を均等化するための最初の使用は、すべての実験のため重要です。さらに、これらのマウスのがん細胞は、免疫の/ニュージャージー州 FVB マウスに注入したと、TME は CD3 T 細胞 (図 3 D) (または他の免疫細胞型) の免疫組織染色 (IHC) (またはフローサイトメトリーまたは他の技術) によって分析できます。最後に、このモデルは (図 3E) 大きな原発腫瘍質量原因出血腹部腹水36として客観的生存エンドポイントを提供および/または歩行やグルーミング、立毛37を減少しました。時折、死は、尿の出力をブロック腫瘍の成長によって引き起こされる可能性があります。
最後に、このモデルは、アンドロゲン依存性前立腺癌と CRPC、後者の予後不良を与えるし、新規治療法の選択肢が必要な研究に利用できます。後同所性同種腫瘍開発、マウス外科的去勢、前述38として。これは、主要な生存術は、回復や有害事象の合併症を監視するため細心の注意を与えられなければなりません。去勢後、3 日以内 CRPC (図 4 a) を表す約 30 日後以降腫瘍再発が続く強い抗腫瘍が観察されました。CRPC 腫瘍郭清をすることができます組織学的分析し、AR の高レベルを維持し、神経内分泌マーカー、シナプトフィジン (図 4 b) に負の値が任意の神経内分泌分化を表示されません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg"> 図 1: 前立腺前葉、ドレイン リンパ節、前立腺内の細胞注射の代表的な手法です。(A)右前前立腺葉の画像 (黒、*)、右精嚢 (白)、右睾丸と脂肪パッド (緑) と膀胱 (黄色)、 (B)両側前立腺排水傍大動脈リンパ節 (オレンジ)、 (C)を添付ミクロ解剖はさみ、グレーフェ鉗子、グレーフェ組織鉗子、縫合糸カッターと針ホルダー、28 ゲージ針 (左右から)、 (D)正中切開、 (E)精嚢と前立腺前葉 50 μ L のシリンジ外部化、 (F)、 (G)前立腺前葉の充血の前立腺内注入<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg"> 図 2: In vivo発光と蛍光腫瘍イメージングします。(A)ルシフェラーゼと(B) mCherry-表現する IVIS スペクトル イメージング システムを用いた同所性同種 Myc キャップ腫瘍をイメージしました。生物発光の全光束 (光子/s) によって定量化を行った。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg"> 図 3: 腫瘍体積、重量、免疫の浸潤、および生存のための組織学の同所性同種腫瘍解析します。同所性同種腫瘍が前立腺内注入後 30 日目に解剖し、 (A)総イメージング、 (B)腫瘍体積 (π/6 × L × W × H;L 腫瘍、W の長い軸の長さを = = 垂直幅、H = 垂直高さ)、 (C)腫瘍重量、 (D) CD3 IHC (スケールバー = 100 μ m)、および出血性の腹部の外観として目的のエンドポイントとの(E)存続腹水。(B)平均の平均 ± 標準誤差として表されるデータ。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg"> 図 4: アンドロゲン依存性前立腺癌と CRPC の両方をモデルにその後外科的去勢と前立腺内注射。(A)発光前と後の去勢 (Cx) で同所性同種ルシフェラーゼを表現する腫瘍を有するマウスをイメージしましたし、 (B)は、CRPC を再発した腫瘍を切除した (黒 = 同所性同種前立腺腫瘍; 黄色 = 膀胱)、H によって分析 &amp;E、AR IHC とシナプトフィジン IHC (積極的なマウス コントロール) と (スケールバー = 50 μ m)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルの目的は、その後去勢と、前立腺癌細胞の前立腺内注入を示すことです。同所性同種アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の前臨床モデルは臨床的に関連する腫瘍微小環境と免疫ホストのコンテキストで疾病研究にとって重要です。

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

この手順の全体的な目標は、マウスがん細胞の前立腺内注射を実施して、アンドロゲン依存性および去勢抵抗性前立腺がんの両方をモデル化できる同系同所性腫瘍の形成を誘導することです。この方法は、前立腺がんの発症を促進するものや、これらの腫瘍を排除するのに最も効果的な治療法など、前立腺がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、同所性腫瘍が遺伝的により複雑であり、臨床的に代表的な腫瘍微小環境で発生し、注射前に遺伝子組み換えができることである。この技術の意味は、同所性腫瘍がヒト患者で観察されるのと同様の方法で治療に反応するため、ヒト前立腺がんの治療にまで及びます。つま先をつまんでも反応がないことを確認した後、マウスの目に軟膏を塗り、腹部の毛皮をすべて剃ります。露出した皮膚を滅菌した非粘着性パッドを使用して3ラウンドの外科用スクラブで滅菌し、続いて滅菌アルコールワイプを使用します。皮膚が乾いたら、マウスを仰臥位にして、清潔な手術用顕微鏡の対物レンズの真下にある加熱パッドの上の清潔な表面に置きます。そして、腹部に小さな穴が開けられた滅菌ドレープで動物を覆います。陰茎と包皮よりも上の腹部の正中線に沿って、外側の皮膚と内側の腹部の筋肉組織に1センチメートルの切開を行います。両側の精嚢と付着した前立腺前立腺葉の1つを見つけます 通常は後方、外側、および膀胱よりわずかに優れている アシスタントに依頼して、MIC-CAP Mtrigelがん細胞溶液を穏やかなピペッティングで混合し、50マイクロリットルの注射器に取り付けられた28ゲージの針に30マイクロリットルの細胞をゆっくりと吸引します。次に、Graefe Tissue Forcepsを使用して、1つの精嚢の先端を静かに上げて、小胞に穴を開けずに組織に張力をかけ、前立腺葉の長軸に平行な針の斜角を慎重に挿入します。細胞の全量をローブにゆっくりと注入し、続いて針をゆっくりと引っ込めて漏れを防ぎます。成功した注射は、前立腺葉の充血によって明らかになります。精嚢と注入した前立腺葉をマウスの外側に約30秒間慎重かつ着実に維持し、マトリゲルが葉内で部分的に固化できるようにします。.滅菌ポリエステル製の先端付きアプリケーターを使用して、腹部に漏れた細胞溶液を収集し、非同所性腫瘍の発生を防ぎます。正確な人工装具内注射は、非同所性腫瘍の発生に重要です。精嚢に穴を開けないように細心の注意を払い、がん細胞懸濁液をゆっくりと注入し、細胞の漏れを収集することで、この手順の成功率が向上します。次に、精嚢と注射された葉を、葉に圧力をかけずに腹部にそっと戻し、外部化された組織を交換します。5-0ビクリル吸収性逆切断針縫合糸を使用して、連続縫合で内側の腹部の筋肉組織を閉じ、続いて4-0ナイロンモノフィラメント非吸収性逆切断針縫合糸を使用して中断縫合で外側の腹部皮膚を閉じます。次に、術後鎮痛剤を投与し、マウスを寝具のないケージに半分置き、完全に回復するまで監視しながら加熱パッドに置きます。Myc-CaP細胞のホタルルシフェラーゼおよびmCherry発現のための安定トランスフェクションにより、前立腺腫瘍に続いて非侵襲的なin vivo生物発光および蛍光を照射することができます。ここでは、前立腺内注射後 30 日目に腹部から解剖された代表的な腫瘍を示します。適切な技術を使用すれば、腫瘍の体積と重量を比較的小さな標準誤差で記録できますが、小さな腫瘍塊と大きな腫瘍塊の間で多少のばらつきが予想されます。前立腺内に注入されたマウスがん細胞は、腫瘍浸潤性CD3陽性T細胞または他の目的の免疫細胞の存在について、免疫組織化学によっても分析できます。さらに、このモデルは、原発腫瘍の大きな塊が出血性腹部腹水を引き起こし、および/または歩行グルーミングおよび/または立毛の減少を引き起こすため、客観的な生存エンドポイントを提供します。前立腺内注射の3日後に去勢すると、腫瘍の退縮が強く、その後、去勢抵抗性前立腺がんを代表する約30日後に腫瘍が再発します。去勢抵抗性前立腺がん腫瘍の解剖および組織学的解析では、腫瘍は高いアンドロゲン受容体レベルを維持し、神経内分泌マーカーであるシナプトフィジンに対して陰性であるため、神経内分泌分化は明らかになりません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば20〜30分で完了できます。この手順を試みる際には、術前と術後の鎮痛薬を投与し、滅菌技術を使用し、外科助手の助けを借りてすべての手術を行うことを忘れないでください。この手順に続いて、免疫組織化学、フローサイトメトリー、腫瘍の体積と重量の評価、動物の生存率などの他の方法を実行して、免疫療法やその他の実験的セラピュータへの反応に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、最終的な外科的去勢と腫瘍の退縮および再発分析のために、マウスの前立腺葉に前立腺がん細胞を注入する方法を十分に理解しているはずです。がん細胞を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に正しい個人用保護具を着用するなどの予防措置が必要であることを忘れないでください。

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