Name: 人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ 96ウェル形式の高速ストレッチ損傷法で、ヒトiPS細胞由来神経細胞を用いた神経外傷のin vitroモデル構築と高コンテンツスクリーニングによる創薬応用。

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この作品は、一部健康の国民の協会 (R21NS098129) からの助成金によってサポートされます。SueSan 陳、ジョナサン ・ タン、コートニー ノースパーク、市貝 Ng 風水元 Bu、デザインと高速撮像実験でこの原稿に記載の間に使用されるライトをサポートする体制を構築から優秀なテクニカル サポートを確認したいと思います.

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著者が明らかに何もありません。

一貫性のある取得するキー、biofidelic このモデルで表現は、一貫性のある biofidelic 機械侮辱が適用されます。このモデルは、10-15 ms 死体実験12,13によると人間の頭部の影響のパルスの期間に類似している限り短い期間のパルスを生成できます。この侮辱の一貫性は、圧子ブロックとプレートの配置と、圧子押込みの一貫性のある潤滑によって異なります。圧子ブロックも揃っていれば、傾向に無い適用ひずみ行または列 (図 2)。潤滑剤の薄層は通常厚い層より少ない摩擦を作成し、粘性グリース、シリコーンをファウルして顕微鏡の中に光の通過を妨げるために推奨されません。実際のステージの変位振幅が大幅に低下する変位振幅と多くの圧子を使用すると、所定の段階の変位振幅は大きい (> 3 mm)。ただし、実際の変位は大きな振幅で変位よりも小さいが、繰り返し (図 2 b) が残っています。したがって、大規模な実際の変位振幅は、所定の目的の値を超える値を入力することによって確実に得られます。変位振幅のピーク膜ひずみ病理を引き起こす力学的侮辱を直接測定するため簡単に記録されたプロキシだからこそ問題します。したがって、膜段階の変位から歪を求める手順は重要です。プレートと圧子押込み、たとえば異なる場合の相互作用に影響を与えるシステムが変更される場合は、いずれかの主要なこのプロセスを繰り返す必要があります直径圧子押込み、異なる圧子材料またはコーティング、シリコーンの種類底板が使用されます。各実験の開始時に、圧子ブロックを再編成し、ゼロの位置を決定するプロセスを繰り返す必要があります。伸縮装置の概略は図 1に示します。デバイスを再現するための CAD モデルは、補足資料として提供されます: ' 傷害デバイス - 完全なアセンブリ - 汎用 3 D。ステップ ';材料提供の関連法案として補足表 1: カスタム内蔵デバイス - BOM.xlsx。また補足テーブル 2 96 ウェル プレート _loader - のピン配置配線 Diagram.xlsxシステムのさまざまなコンポーネントを接続するケーブルの接続を記述するを参照してください。'Interconnector_circuit_board.dip' では、ケーブルを配線基板について説明します。
その旅行の中央付近の段階でデバイスが無効になった場合、ステージはバネ式だから、電源が切断された後に移動します。電源が回復すると、フィード バック ループは最後の知られている所定の位置と実際の位置との間の大きな違いを検出します。これはこれは、デバイスが無効にされた位置に突然移動する段階になります。この突然の動きは休んで、旅行の上部に位置、無動力で場合にのみデバイスを無効にする注意する必要がありますので、エンコーダーの出力でエラーが発生します。
作製クランプにより、最適な接合方法でプレートのボディとシリコンの下部をもたらす設計されています。このため、補足のファイルで説明する設計の 3 つの特徴がある「プレス金型 - 汎用 3 d。ステップ '。まず、クランプ プレート体ホルダーは、シリコーンの下部に平行です。これは正しくビルドされている場合、最初のセットアップ後の調整は不要です。第二に、クランプの発泡ゴムの層は、完全に剛体システムと無限の締め金で止める力をゼロの締付け力から急激な増加を経験する理論的にクランプを閉じたときプレートの下のコンプライアンスの少量を提供します。クロスバーの位置とクランプのセット スクリューは、クランプの 2 つの側の間の距離を微調整できるように調整できます。
ひずみ特性実験中に井戸の底にドットの明るく、白い背景を提供するためにあらゆる努力をすべきであります。良いコントラスト、これらの画像が容易になります大実験を分析人間のオペレーターの退屈になることができるドットの幅と高さを測定するプロセスを自動化します。96 ウェル プレートで井戸の底の高速ビデオ撮影は、井戸の壁が影を落とす傾向があるために、課題を提示します。ドーム ライトやカメラの視線に沿ってイメージを隠すことがなく照らすことができる拡散の軸光の使用には、影や従来光源と起こる鏡面反射がなくなります。明るい照明は、短い露光時間で取得する画像をことができますので、明るいの使用可能な光源を使用ください。短い露光時間では、モーション ブラーを最小限に抑えます。びまん性軸光発光ダイオード (Led) をアップグレードにより高速ビデオ集録中に露出時間の短縮ができます。Led でアップグレードできるびまん性軸光を開く株式 Led を取り外し、取付 4 ハイパワー LED アレイ バック ウィンドウ Led ホルダーを使用して、定電流電源に接続して、再組み立てびまん性軸光 (のテーブルを参照する材料カタログ番号のため)。Led のアップグレードの欠点は、過熱の危険があるためよりも数秒受動的冷却 Led を維持できないことです。したがって、別の光は、後ブロックとカメラ調整の配置に必要です。
膜にスタンプ ドットの膨張を測定することにより膜ひずみを定量化の提案手法は比較的粗さが、それは複数の井戸に堅牢な方法でスケール アップすることができます。ウェルの底全体の歪場はデジタル画像相関法を使用して詳細に特徴付けられます。この手法では、井戸のベースの上に細かいまだら模様を噴霧し、それをイメージング変形中に高速です。商用ソフトウェアは、斑点状のパターンの進化を追跡することによってイメージの各ポイントでひずみを定量化する使用できます。
このプロトコルは、hiPSCNs の多面的、臨床的に関連する、ストレッチ損傷表現型を作り出します。細胞死、神経変性および神経突起ビーズは人間の TBI のすべてのよくとり上げられる後遺症と動物モデル15。このモデルで成功への鍵はの確立と健全な文化を維持します。一般的に言えば、従来の硬質プレートを開発した細胞培養のプロトコルは伸縮性平板培養の価値が出発点です。ただし、問題のセルがシリコンを異なる応答可能性があります可能性は常に考慮されなければなりません。これは特に、hiPSCNs 培養条件に非常に敏感であります。セル密度とラミニン濃度を最適化するいくつかの例は、代表結果] セクション (図 3図 4) に提供されます。プラズマ処理とシリコーンの活性化は不可欠です。シリコーンは、疎水性とたがわず。自然の状態ではラミニンや細胞接着を促進するために使用される他の分子にそれバインドできません。プラズマ処理は、表面の親水性をレンダリングし、反応性基を公開します。これらの変更により、シリコーンに結合し、細胞接着を促進する接着分子です。プラズマ処理効果は、表面は、液体に浸漬しない限り、そしてできるだけ早く活性表面を乾燥を含む手順を実行する必要があります数分消費電力に注意してくださいすることが重要です。プラズマ処理の効果を着用しているかどうか確認する簡単な方法は、表面に水の滴を配置することです。未処理のシリコンをプラズマ処理シリコンをに広がっていくに対しを液滴のビーズします。昔は hiPSCNs と (材料の表を参照)、製造元は、細胞懸濁液ではなく、塗装の前処理でラミニンの追加をお勧めします。このプロトコルは、正常にこのアプローチに組み込まれています。セグメンテーション、理論的で実現できるオープン ソース ソフトウェアまたは汎用のプログラミング言語、これらのツールと能力の高い良い結果を取得する必要です。神経突起がよくとても痩せているので、バック グラウンド信号から区別することは困難です。したがって、可能な場合のセグメンテーションとニューロンの定量化のための専用モジュールと高コンテンツ顕微鏡社配布商用ソフトウェア ツールの使用を勧めます。市販のソフトウェアであっても精度を視覚的に検証するセグメンテーションのイメージをエクスポートすることをお勧めします。
従来、硬質板の使用と比較して伸縮性のプレートでの作業に関連付けられているいくつかの制限があります。伸縮性プレート空気目的で通常どおりイメージを作成することができます。ただし、浸漬の目的の画像は非常に難しい。レンズのオイルは、シリコーンを恐れがあります。さらに、それを上向きに移動すると、目的はシリコン膜に圧力をかけます。この圧力は垂直方向に焦点に、サンプルを持参して困難に膜を転置します。現在のプレートを製造に使用シリコーン膜は、約 250 μ m 厚いです。この厚さは、多くの高出力、浸漬の目的の焦点距離を超えています。顕微鏡に必要な平坦度を達成するためにクランプする前に完全に平ら、膜をレイアウトする特別な注意が必要です。オート フォーカス システムは、ある程度完成したプレートの平坦度の偏差を補正できます。平坦性を確保するためプレート上部に接着する前に、プロトコルの将来のバージョンは膜を緊張事前可能性があります。プレート トップ14にシリコン膜を接着するための接着剤フリー手順は、現在のプロトコルの重要な強さと見なされます。不均一接着層の厚さによる平坦性接着剤として任意の偏差から神経毒性のリスクがなくなります。
多電極アレイは、hiPSCNs での実験の成熟度と機能を評価するために使用されます。残念ながら、これらのシステムは、細胞培養基材は堅いので、このモデルと互換性があります。伸縮性マルチ電極アレイを作成、このところだけで実証されている単一のよくがフォーマット16,17することが可能です。圧子押込み削除できるように個別に圧子ブロックからいくつかの井戸がインデントされないとシャムスとして使用できるように注意してください。圧子を削除するインデントを防ぐことができますが、ステージを移動しながら井戸内の流体のまだ慣性があるので機械的負荷に完全に排除していません。決して流体運動の病理学的影響を測定する段階運動の対象となったプレートで井戸にこれらの井戸を比較する価値があります。また、ブロックに圧子押込みの配列は対称 (前面から背面に左右対称、左右に) をする必要があります。この予防措置により、ステージが横傾斜しないし、自分の立場でバインドする棒を引き起こすので、プレートがインデント時に均等にロードされています。
頭部外傷の治療のイノベーションへの主な課題は、複雑さと状態の不均一性があります。外傷は、同時に中枢神経系のあらゆるセルの種類にマルチ モーダル ストレスを適用します。ニューロンは、商用ベンダーから広く利用可能今確実にひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) から生成されています。この分野で技術革新が進行してすぐに、アストロ サイト18とミクログリア19など他の神経細胞の種類、また hiPSCs から派生しています。それはやがて体外トラウマにし培養異なったセルタイプ外傷後通信する方法を理解するこれらの細胞型のそれぞれの細胞の自律的応答を分離することが可能。この方法では、徹底的に人間システムの理解を底から臨床的課題を再現が可能それ最終的にあります。このアプローチは、齧歯動物モデルに依存する従来のアプローチとは異なる、この壊滅的な一般的な難治性の条件の最初の治療につながる知見を生成する可能性があります。

TBI は、毎年1約 52,000 人が死亡と 275,000 入院の原因と死亡率および罹患率、米国での主要な原因です。単一の成功2TBI の治療薬候補の 30 以上の臨床試験を行っています。この制服の障害は、人間固有のプロセスが一般的に使用される臨床齧歯動物モデルにみられる病態から人間の TBI を分離することを示唆しています。
HiPSCNs の出現は、人間の in vitroモデルで頭部外傷を勉強する機会を作成しています。薬剤のスクリーニングの hiPSCN ベースのモデルでは、齧歯動物細胞を用いたモデルよりも臨床成功のより正確な予測の結果を提供可能性があります。また、hiPSCNs は分離し、病理学3に個々 の人間の遺伝的変異の影響を検討する遺伝子操作できます。
本稿で説明する方法は、hiPSCN ベースの疾患頭部外傷にモデリングのユニークな利点をもたらす設計されています。頭部外傷のストレッチ損傷モデル体外は、よく確立された4,5,6主齧歯動物細胞とひと神経癌細胞株です。これらのモデルのほとんどは、空気圧シリコン膜を読み込むことによってストレッチを生成します。この方法は単一の井戸のフォーマットに有効であるが、ウェル フォーマット7までスケールすることは困難証明されています。結果としてはストレッチ傷ついた神経を治療するためにエージェントの高スループット画面はありませんでした。
このモデルの硬質の圧子を下から押込みによる膜が広がっています。この方法は、単一の井戸系8,9,10で臨床的に関連する病理体外生成する繰り返し示されています。私たちの最近の仕事は、簡単にスケール アップ 96 ウェル形式のドメインを閉じる頭部衝撃イベント12,13時間である数十ミリ秒11、パルス持続時間を維持しながら示しています。
要約すると、この体外損傷モデルの主な利点は 96-well フォーマット、hiPSCNs の使用および侮辱の臨床的に関連した時間領域。

<table><tbody><tr><td>.010 "シリコーンシート</td><td>Specialty Manufacturing、Inc</td> <td>#70P001200010</td><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)シート</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>#12-565-600</td><td>底なし96ウェルプレート</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリック プラズマ</td> <td>#PDC-001-HC(</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピル) トリエトキシシラン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>#440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>パーチメント紙</td><td>レイノルズ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ドームライト</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>ドームライト電源</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>アキシャル拡散照明ユニット&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>拡散アキシャルライト</td></tr><tr><td>ハイパワーLEDアレイ&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>ハイパワーLEDアレイ&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>LEDホルダー</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>LEDホルダー&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>LED電源</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>定電流電源&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>FastCam Viewerソフトウェア&nbsp;</td><td>フォトロン</td><td></td><td>カメラ softeware Fastcam</td></tr><tr><td>Mini UX50</td><td>フォトロン</td><td>N/A</td><td>ハイスピードカメラ</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>ハイスピードカメラ</td></tr><tr><td>レンズ 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td> <td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell のメディア</td><td>セルラーダイナミクスインターナショナル</td> <td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>iCellサプリメント</td><td>Cellular Dynamics International</td> <td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>カルセインAM</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>ボイスコイルアクチュエータ&nbsp;</td><td>BEIキムコ</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>光学式リニアエンコーダ&nbsp;</td><td>レニ</td><td>ショーT1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>サーボドライブ</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コントローラ</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9024 Real Time PowerPCコントローラ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cRIOシャーシ</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td>デジタル入力モジュール</td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>データ集録シャーシ</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>計測器制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

外傷性脳損傷 (TBI) は、高い罹患率と死亡率の主要な臨床的課題です。前臨床研究の数十年にもかかわらず、TBI の実績のある治療法を開発されているはありません。既存の前臨床モデルを補完するために意図した頭部外傷の臨床研究の手法を提案する.ひと誘導多能性幹細胞由来神経細胞 (hiPSCNs) を使用して人間の病態を紹介します。それは読み込みパルスを実現臨床のローディング期間と同様の期間閉鎖頭部衝撃損傷。高スループット実験を容易にし、高価な細胞と培養試薬の効率的な使用は、96 ウェル形式を採用しています。シリコーン膜は神経毒性の未硬化樹脂を削除する最初扱われ伸縮 96 ウェルのプレートを作成する商業の 96 ウェル プレート体とそれから結ばれる。カスタム デバイスは、機械的に井戸に培養細胞を傷つける軸ひずみを誘導下から井戸の底の一部またはすべてのインデントを設定する使用されます。インデントの深さと機械的ひずみとの関係は、インデントの中にも底の高速度撮影を用いて経験的決定されます。HiPSCNs を含むセルは、従来の細胞培養のプロトコルの変更されたバージョンを使用してこれらのシリコーンの膜に培養することができます。培養細胞の蛍光顕微鏡画像が取得され、各ウェルに損傷のレベルを定量化する半自動化された方法で損傷後分析します。提示されたモデルは hiPSCNs 用に最適化されたが、理論的には他の細胞型に適用することができます。

担架装置です (図 2 a) パルスの振幅に応じてパルス持続時間の短い 10-15 ms パルスパワー ステージを動かすことができます。パルス振幅は脈拍の持続期間は約 1 によって異なりますが、再現性の高い繰り返しの ms。実際のパルス振幅は所定のパルス振幅から逸脱した井戸の多数が読み込まれ、所定の振幅が高い場合 (図 2B参照)。ステージ移動の振幅が 3 ミリメートルを超えて増加する、実際の変位振幅ますます下回る変位振幅 (図 2B参照)。投稿ブロックの慎重に位置合わせは、行または列 (図 2) にわたって膜ひずみにおける傾向を排除します。52 井戸インデントを段階変位振幅 (3.3 mm 実際の変位振幅) を規定する 3.5 ミリメートル、すべての井戸の位置間で平均ラグランジュのひずみは 0.451 (すべての場所のための手段の標準偏差 = 0.051, 標準偏差の意味すべての場所 = 0.065、n = 5 測定ウェルあたり)。これらの結果は、それらのいくつかされているが、既に報告された11完全を期すのためここで掲載されています。
最適な無傷の文化があれば、いくつかの以上 5 細胞の塊があります。神経突起は、個々、長い、細い、緊張やビーズ (図 3 a) の気配がほとんど、あるいはまったく曲線になります。理想的な条件の下で文化の生存率必要があります密接に製造元のデータ シート (通常 60-70%) で指定された生存率のアプローチし、シリコンを文化従来硬質文化基板上 (に維持されているもののようになります図 3B)。神経突起は、低消費電力の明視野顕微鏡に表示できない場合があります。ラミニン濃度と細胞密度の両方ベースライン時と損傷後の文化に影響を与えます。細胞密度が増加数と文化で形成される塊のサイズ。しばしばラミニン濃度を増加させると、この効果 (図 3 a) が抑制されます。しかし、増加、ラミニン濃度あまり鈍化傷害 (図 4) に文化の感度。無傷のカルチャ最適ラミニン濃度は 50 μ G/ml のラミニン (図 3)、しかし、ラミニン (図 4) の 10 μ G/ml で偽とストレッチの負傷者集団間の最適な分離が得られました。ラミニン濃度が高い短時間ポイント (図 4) での負傷も長い時間ポイント (例えば、7 日間) で細胞生存率を改善する文化の感受性の低下。要約すると、各実験のシナリオのラミニン濃度を最適化する価値があります。
膜ひずみ、受傷後イメージング時点、ラミニン濃度および細胞密度セルごと神経突起の長さに非常に有意な主効果を発揮 ( ANOVA, &lt; 0.001)。セルごとの突起の長さ膜ひずみの影響は受傷後撮像時間ポイントとラミニン濃度と統計上極めて重要な相互作用をあった ( ANOVA, &lt; 0.001) とセルとの統計的に有意な相互作用密度 ( ANOVA, &lt; 0.05)。同様に、膜ひずみ、受傷後の時点をイメージング細胞の密度、およびラミニン濃度のすべてがセル実行可能性の高い統計学的に有意な主効果を発揮 ( ANOVA, &lt; 0.001)。細胞の膜ひずみの影響は受傷後のイメージング時点で統計上極めて重要な相互作用 ( ANOVA, &lt; 0.001) と細胞密度(ANOVA,統計的に有意な相互作用&lt; 0.05)。これらの結果は、タイミング、細胞密度、およびラミニン濃度がそれぞれ慎重に最適化する必要がありますので応用侮辱と実験結果との関係に重要な影響を出すことを証明します。
低細胞の生存率と発育を妨げられた神経突起の成長と一緒に、ビーズの突起を示す不適切から生じる有毒な培養条件準備シリコーン。スキップまたは水浸漬または乾燥オーブンを短縮吸収エタノールを残したり水膜、それぞれ、メディアに拡散し、細胞のストレスします。よく負傷した文化はセル実行可能性、短縮または行方不明の神経突起、ビーズの突起、緊張やテンションに見える突起が減少します。傷害は、よく分散した前怪我をした培養細胞の凝集を引き起こす可能性があります。大きな塊は、形態素解析を混同することができます。形態素解析などの顕著な変化が発生するが、細胞がまだいくつかの突起に存在するよう傷害レベルを調整する必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> 図 1: A ラベル損傷デバイスの概略図。(A) トップビュー、等角図法 (B)、(C) 正面、(D) 右側面図。スケール バーは、三面 (A、B、および D) に適用されます。<a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> 図 2: 機械の侮辱のキネマティック。(A) 段階の変位履歴 (所定振幅は凡例に表示) 所定振幅の範囲で 5 パルス以上井戸が読み込まれていないとき。(B) ステージ移動履歴 (所定振幅は凡例に表示) 所定振幅の範囲で 10 パルス以上 52 井戸がいつ読み込まれるか。(C) 3.3 mm の段階の変位振幅の各ウェルに、平均化ひずみ (n = 5 測定好評につき、平均ウェルあたり標準エラー 0.029 を =)。C4 F4 と C9 f9 キーは伸縮制御井戸であることに注意してください。この図は、シャーマンらから変更されています。11<a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> 図 3: 文化の最適化条件シリコーン。(A) セル密度とラミニン濃度シリコンを hiPSCN 文化を様々 なエフェクト。細胞密度の増加、ラミニン濃度の減少と増加を凝集します。セル密度とラミニン濃度は、単分散の文化を達成するために最適化されなければなりません。単分散の文化は、定量化の中に人工物を発生しにくく。神経突起の可視化を最適化するためにダイナミック レンジを調整されて ことに注意してください。結果として、多くの明るい相馬が飽和状態します。このプレゼンテーション多くの調光器の突起をほとんど目に見えないレンダリングする相馬に関してダイナミック レンジの最適化の代替にお勧めします。赤色の四角形で強調表示された条件はストレッチ損傷実験体外に最適とみなされました。(B) 従来のリジッド基板上の文化にシリコン膜上の文化のよう最適な条件の下で。左側のパネルは、33,750 セル/cm2 (細胞培養基材は培養治療環状オレフィン共重合体)、従来の硬質の 96 ウェル プレートでラミニンの 3.3 μ g/ml で培養した hiPSCNs を示しています。右側のパネルは、(A) から赤で記載されているパネルを再現します。スケール バー = 100 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> 図 4: 損傷表現型とそのラミニン濃度依存します。(A) 健康的な文化は、10 μ G/ml ラミニンと 67,500 セル/cm2を使ってします。神経突起はないビーズと長いです。いくつか死んで核, といくつかの塊があります。(B) 文化 57% ピークひずみと負傷し 4 h 突起を短縮後のイメージを作成または行方不明、同じ培養条件を使用して、いくつかビーズ (矢印によって示されます) があります。カルセイン AM 陽性細胞は数が少ないともっとカルセイン AM 負の核 (つまり、死んでいる) があります。傷害は、存続の細胞の中で群生していることを増加しています。(C) 損傷後 4 h、セルごとの突起の長さはラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下します。(D) 受傷後 4 h、ラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下する細胞。(E) 外傷後 24 h、セルごとの突起の長さはラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下します。(F) 外傷後 24 h、ラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下する細胞生存率。(n = 4 バー、あたりは誤差範囲、± 1 標準偏差、スケールバー = 100 μ m)。歪みの値、シャーマンらによって事前パブリケーションからのデータを使用して段階の変位からみた11<a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1: 技術、圧子の描画します。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足表 1: カスタム内蔵デバイス。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
配線図補足テーブル 2:96 よくプレート ローダー ピンアウト。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 1: 損傷デバイスのコンピューター援用設計図面。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 2: プレート作製クランプのコンピューター援用設計図面。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 3: スタンプ幾何学、3 D プリンターでの使用に適した 3 D 表現します。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 4: motion_control.vi のサブ Vi である MuStLiMo_si_initialize.vi のサブ Vi。ダイアログ ボックスでエントリをモーションのパラメーターに変換します。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 5: motion_control.vi のサブ Vi である複数ストレート ライン Moves_simplified.vi のサブ Vi。ダイアログ ボックスでエントリをモーションのパラメーターに変換します。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 6: position_tracker.vi のサブ Vi。カウンター トラック変位入力リニアエンコーダーから。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 7: LabVIEW プロジェクトのベースします。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 8: デバイスを移動レベル VI をトップします。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 9: motion_control.vi のサブ Vi。プレートを伸ばす急速な変位を実行します。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 10: motion_control.vi のサブ Vi。ステージに移動遅い変位を実行します。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 11: motion_control.vi のサブ Vi。Motion_control.vi コントロール パネルの (通常アンダー サンプルされる) 変位履歴をプロットします。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 12: 変位履歴を記録レベル VI をトップします。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 13: motion_control.vi と position_tracker.vi の間の通信が含まれています Variable2 です。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 14: プリント基板の回路図です。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足コード ファイル 15: プリント回路基板のレイアウト。<a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

ここで外傷に影響を与えるに関連するタイム スケール上の 96 ウェル形式でストレッチ損傷の人間の in vitroモデルの手法を提案します。力学的侮辱、培養し細胞を傷つける、イメージングと傷害を定量化する高の内容分析を定量化伸縮性のプレートを製造するためのメソッドが含まれます。

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

このモデルの全体的な目標は、臨床的に関連する神経外傷表現型を 96 ウェル形式で作成し、複数の実験条件下で受けた損傷を効率的かつ同時に比較できるようにすることです。このモデルの主な目的は、ヒト誘発多能性幹細胞由来ニューロンを用いて、神経外傷におけるハイコンテント表現型創薬スクリーニングを可能にすることです。このモデルで使用されているプレートは、業界標準の96ウェルプレートの形状を保持しており、ロボットアームや自動顕微鏡などの既存のハイコンテントスクリーニング機械との互換性を維持しています。まず、底なしの96ウェルプレートの底面を上にして、200ワットのプラズマクリーナーの中を60秒間高出力で置きます。次に、プレートを脱イオン水に新たに調製した1.5%APTESの200ミリリットルに入れ、底を下にしてドラフトに20分間入れます。インキュベーション開始から10分後、鉗子を使用して、プラズマ処理されたシリコンメンブレンを7.5 x 11 cmのパーチメント紙の長方形の上に置き、7.5 x 11.05 cmのアルミニウムスラブをプレート製造クランプの下部に位置合わせします。次に、鉗子を使用して、シリコンメンブレンとパーチメント紙をアルミニウムスラブに位置合わせします。コーティング期間の終わりに、底なしプレートをAPTESバスから取り出し、余分な溶液を振り落とします。底なしプレートを2つの連続した200ミリリットルの脱イオン水浴に5秒間浸し、余分な水を振り落とします。圧縮空気で完全に乾燥させた後、底なしプレートをプレート製造クランプの上部に置き、クランプを静かに閉じて底なしプレートとシリコーンを一緒に押します。圧子ブロックの位置を合わせるには、ステージクランプを使用して、ライブフィードのあるカメラの下のストレッチデバイスのステージにプレートを固定し、デバイスにドームライトを置きます。損傷装置に接続されたコンピュータで機器制御ソフトウェアを起動し、起動ウィンドウをクリックしてin-vitro神経外傷プロジェクトを実行します。プロジェクトウィンドウで、Motion ControlとPosition Trackerのバーチャルインストゥルメントをダブルクリックします。負傷デバイスを囲むケージを閉じ、モーションコントロール仮想計器の矢印をクリックして計器を実行します。下部付近をクリックしてステージを圧子との接触から2ミリメートル以内まで下げてから、[停止]をクリックして仮想計測器を停止します。プロジェクト ウィンドウで [Axis One] を右クリックし、[Interactive Test Panel] をクリックします。表示されるウィンドウの「目標位置」フィールドに500単位を入力して、ステップサイズを50マイクロメートルに設定します。次に、プレートが最初に圧子に接触するまで[Go]を繰り返しクリックし、カメラに表示されるライブ画像で接触を確認します。垂直ステージの位置は、インタラクティブテストパネルウィンドウの左上に表示されます。すべてのウェルが圧子に接触するまでプレートをさらに下げ、必要に応じてカメラとステージを動かしてプレート全体を表示します。すべてのポストが接触しているときに報告された垂直ステージの位置に注意し、インタラクティブテストパネルを閉じます。次に、モーションコントロール仮想計測器を実行し、[上部]をクリックしてステージを上げ、ステージが所定の位置にあるときに停止ボタンを使用して仮想計測器を停止します。ドアを開いてデバイスを無効にし、最初に接触したコーナーのセスネジを緩めてコーナーを下げ、反対側のネジを締めて最後に接触したコーナーを上げます。プレートがすべての圧子に同時に接触するまで、ブロックを下げ、観察し、調整を繰り返します。圧子ブロックの慎重な位置合わせは、プレートのすべてのウェルで均一な損傷を達成するために重要です。ドアを開けてデバイスを再度非アクティブにし、タイダウンネジを圧子ブロックの穴に挿入します。次に、ネジを所定の位置に締め、プレートが接触したときにインタラクティブテストパネルによって報告されたステージ位置に注意してください。プレートを伸ばすには、位置チェック仮想器の「File Path」フィールドのファイル名を一意のファイル名に変更し、「Run」矢印をクリックします。インデントの深さとデュレーション、および移動コントロールパネルのバーチャルインストゥルメントの「Injury」フィールドと「Injury Duration」フィールドを設定します。プレートをゼロの位置にして、移動コントロールパネルの仮想計測器を実行し、[負傷]をクリックしてプレートをインデントします。「トップ」をクリックしてステージを上に移動し、プレートがトップの位置にあるときに「ストップ」をクリックし、ドアを開いて負傷装置を無効にします。次に、ポジショントラッカー仮想計測器に表示されたステージの変位履歴を調べて、指定した最大変位が適用されたことを確認し、データを適切なスプレッドシートプログラムにエクスポートします。シリコンメンブレンの伸びを評価するには、プラズマ処理後、プレートを柔らかい表面に置き、小さな突起を油性マーカーペンのインクでスタンプにプライミングします。テストする最初のウェルにスタンプを挿入し、タップしてインクの転写が良好であることを確認します。すべてのウェルがスタンプされたら、レンズを最小番号のFストップに設定して、傷害装置の上のブームスタンドにハイスピードカメラを置き、視野に3×4のグリッドに12個の圧子が含まれるようにします。ゼロポイントの位置にある場所で、カメラソフトウェアの録画ボタンを1回クリックしてトリガーインを読み取り、明るい拡散アキシャルライトをオンにします。次に、示したようにプレートをインデントし、軸方向のライトをオフにします。細胞培養を損傷するには、血漿処理プレートの各ウェルに100マイクロリットルのラミニン処理されたヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロンを追加し、プレートを室温で15分間プレート底に付着させてから、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。2〜3日間の培養後、プレートを損傷装置ステージに固定し、蓋の位置を調整して、培養物を周囲の空気にさらさないようにプレートを固定します。次に、プレートをゼロ点位置にして、先ほど示したようにプレートをインデントします。最適な無傷の培養物は、5つ以上の細胞の塊がほとんどなく、神経突起は個別で、長く、細く、湾曲しており、ビーズはほとんどまたはまったくありません。理想的な条件下では、培養物の生存率はメーカーのデータシートに指定されている生存率に近づくべきであり、シリコーン上の培養物は、従来の硬性培養基質上で維持されているものと類似している必要があります。細胞密度を増加させると、培養で形成される塊の数とサイズが増加しますが、ラミニン濃度を増加させると、通常、この影響が打ち消されます。57%ピーク株で損傷した培養では、損傷の4時間後に神経突起が短縮または欠落し、一部の培養細胞には、残りの生存細胞によって凝集が示されたビーズがあります。特に、高用量のラミニン処理は、高用量のラミニン処理培養物における神経突起長および細胞生存率の増加によって証明されるように、濃度依存的に細胞培養物への損傷の重症度を軽減する。この手順を試みる際には、リードタイムを考慮することが重要です。例えば、膜の解毒には3日かかり、製造されたプレートは使用前に一晩硬化させる必要があります。傷害装置には、その動きを駆動するための強力なボイスコイルが含まれており、アクティブなときは常にデバイスから離れ、ステージが移動の頂点にあるときにのみデバイスの電源を切る必要があることを忘れないでください。

method-for-high-speed-stretch-injury-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

このビデオは、ヒトが誘導した多能性幹細胞(hiPSC)から興奮性皮質ニューロンを生成する方法を示しています。ドキシサイクリン誘導により、hiPSCは神経特異的な転写因子であるニューロゲニン-2を過剰発現します。このプロセスは、特定の培地を使用し、アストロサイトと共培養することにより、シナプス結合を持つニューロンへのhiPSCの分化を促進します。...

ヒト人工多能性幹細胞の微小電極アレイ上のニューロンへの分化

このビデオでは、ヒトiPS細胞を運動ニューロンに分化させる過程を紹介しています。その根拠は、特定の転写因子を発現するように遺伝子改変されたiPS細胞を利用することにあります。この抗生物質をドキシサイクリンを含む培地で培養すると、転写因子の発現が引き起こされ、運動ニューロン前駆細胞へのiPS細胞の分化が促進されます。最終的に、前駆細胞をニューロン培地で培養して、成熟した機能的な運動ニューロンを生成します。...

人工ヒト人工多能性幹細胞の機能的運動ニューロンへの分化

このビデオは、ヒトが誘導した多能性幹細胞由来ニューロン(hiPSCN)に伸張損傷を誘発するプロセスを示しています。細胞は、シリコンメンブレンが付着した底なしのマルチウェルプレートで採取されます。制御された機械的ストレスが膜に加えられ、細胞骨格の破壊と細胞膜の損傷を誘発し、細胞に伸張損傷の表現型を誘導します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける伸張損傷のin vitroモデル

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

私たちは、興奮性皮質ニューロン12に人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の、迅速な再現性、および効率的な分化を説明以前に公開されたプロトコルを変更して実施します。具体的には、私たちの修飾は、神経細胞の密度の制御を可能にし、ネットワークレベルでの電気生理学的特性を測定するために微小電極アレイ上で使用します。...

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。...

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。...

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

プロトコルを提案ここで各体節の誘導体 (筋節、椎板、皮膚分節、syndetome)...

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。...

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム

学ぶ 96ウェル形式の高速ストレッチ損傷法で、ヒトiPS細胞由来神経細胞を用いた神経外傷のin vitroモデル構築と高コンテンツスクリーニングによる創薬応用。

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

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