人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

このモデルの全体的な目標は、臨床的に関連する神経外傷表現型を 96 ウェル形式で作成し、複数の実験条件下で受けた損傷を効率的かつ同時に比較できるようにすることです。このモデルの主な目的は、ヒト誘発多能性幹細胞由来ニューロンを用いて、神経外傷におけるハイコンテント表現型創薬スクリーニングを可能にすることです。このモデルで使用されているプレートは、業界標準の96ウェルプレートの形状を保持しており、ロボットアームや自動顕微鏡などの既存のハイコンテントスクリーニング機械との互換性を維持しています。

まず、底なしの96ウェルプレートの底面を上にして、200ワットのプラズマクリーナーの中を60秒間高出力で置きます。次に、プレートを脱イオン水に新たに調製した1.5%APTESの200ミリリットルに入れ、底を下にしてドラフトに20分間入れます。インキュベーション開始から10分後、鉗子を使用して、プラズマ処理されたシリコンメンブレンを7.5 x 11 cmのパーチメント紙の長方形の上に置き、7.5 x 11.05 cmのアルミニウムスラブをプレート製造クランプの下部に位置合わせします。

次に、鉗子を使用して、シリコンメンブレンとパーチメント紙をアルミニウムスラブに位置合わせします。コーティング期間の終わりに、底なしプレートをAPTESバスから取り出し、余分な溶液を振り落とします。底なしプレートを2つの連続した200ミリリットルの脱イオン水浴に5秒間浸し、余分な水を振り落とします。

圧縮空気で完全に乾燥させた後、底なしプレートをプレート製造クランプの上部に置き、クランプを静かに閉じて底なしプレートとシリコーンを一緒に押します。圧子ブロックの位置を合わせるには、ステージクランプを使用して、ライブフィードのあるカメラの下のストレッチデバイスのステージにプレートを固定し、デバイスにドームライトを置きます。損傷装置に接続されたコンピュータで機器制御ソフトウェアを起動し、起動ウィンドウをクリックしてin-vitro神経外傷プロジェクトを実行します。

プロジェクトウィンドウで、Motion ControlとPosition Trackerのバーチャルインストゥルメントをダブルクリックします。負傷デバイスを囲むケージを閉じ、モーションコントロール仮想計器の矢印をクリックして計器を実行します。下部付近をクリックしてステージを圧子との接触から2ミリメートル以内まで下げてから、[停止]をクリックして仮想計測器を停止します。

プロジェクト ウィンドウで [Axis One] を右クリックし、[Interactive Test Panel] をクリックします。表示されるウィンドウの「目標位置」フィールドに500単位を入力して、ステップサイズを50マイクロメートルに設定します。次に、プレートが最初に圧子に接触するまで[Go]を繰り返しクリックし、カメラに表示されるライブ画像で接触を確認します。

垂直ステージの位置は、インタラクティブテストパネルウィンドウの左上に表示されます。すべてのウェルが圧子に接触するまでプレートをさらに下げ、必要に応じてカメラとステージを動かしてプレート全体を表示します。すべてのポストが接触しているときに報告された垂直ステージの位置に注意し、インタラクティブテストパネルを閉じます。

次に、モーションコントロール仮想計測器を実行し、[上部]をクリックしてステージを上げ、ステージが所定の位置にあるときに停止ボタンを使用して仮想計測器を停止します。ドアを開いてデバイスを無効にし、最初に接触したコーナーのセスネジを緩めてコーナーを下げ、反対側のネジを締めて最後に接触したコーナーを上げます。プレートがすべての圧子に同時に接触するまで、ブロックを下げ、観察し、調整を繰り返します。

圧子ブロックの慎重な位置合わせは、プレートのすべてのウェルで均一な損傷を達成するために重要です。ドアを開けてデバイスを再度非アクティブにし、タイダウンネジを圧子ブロックの穴に挿入します。次に、ネジを所定の位置に締め、プレートが接触したときにインタラクティブテストパネルによって報告されたステージ位置に注意してください。

プレートを伸ばすには、位置チェック仮想器の「File Path」フィールドのファイル名を一意のファイル名に変更し、「Run」矢印をクリックします。インデントの深さとデュレーション、および移動コントロールパネルのバーチャルインストゥルメントの「Injury」フィールドと「Injury Duration」フィールドを設定します。プレートをゼロの位置にして、移動コントロールパネルの仮想計測器を実行し、[負傷]をクリックしてプレートをインデントします。

「トップ」をクリックしてステージを上に移動し、プレートがトップの位置にあるときに「ストップ」をクリックし、ドアを開いて負傷装置を無効にします。次に、ポジショントラッカー仮想計測器に表示されたステージの変位履歴を調べて、指定した最大変位が適用されたことを確認し、データを適切なスプレッドシートプログラムにエクスポートします。シリコンメンブレンの伸びを評価するには、プラズマ処理後、プレートを柔らかい表面に置き、小さな突起を油性マーカーペンのインクでスタンプにプライミングします。

テストする最初のウェルにスタンプを挿入し、タップしてインクの転写が良好であることを確認します。すべてのウェルがスタンプされたら、レンズを最小番号のFストップに設定して、傷害装置の上のブームスタンドにハイスピードカメラを置き、視野に3×4のグリッドに12個の圧子が含まれるようにします。ゼロポイントの位置にある場所で、カメラソフトウェアの録画ボタンを1回クリックしてトリガーインを読み取り、明るい拡散アキシャルライトをオンにします。

次に、示したようにプレートをインデントし、軸方向のライトをオフにします。細胞培養を損傷するには、血漿処理プレートの各ウェルに100マイクロリットルのラミニン処理されたヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロンを追加し、プレートを室温で15分間プレート底に付着させてから、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。2〜3日間の培養後、プレートを損傷装置ステージに固定し、蓋の位置を調整して、培養物を周囲の空気にさらさないようにプレートを固定します。

次に、プレートをゼロ点位置にして、先ほど示したようにプレートをインデントします。最適な無傷の培養物は、5つ以上の細胞の塊がほとんどなく、神経突起は個別で、長く、細く、湾曲しており、ビーズはほとんどまたはまったくありません。理想的な条件下では、培養物の生存率はメーカーのデータシートに指定されている生存率に近づくべきであり、シリコーン上の培養物は、従来の硬性培養基質上で維持されているものと類似している必要があります。

細胞密度を増加させると、培養で形成される塊の数とサイズが増加しますが、ラミニン濃度を増加させると、通常、この影響が打ち消されます。57%ピーク株で損傷した培養では、損傷の4時間後に神経突起が短縮または欠落し、一部の培養細胞には、残りの生存細胞によって凝集が示されたビーズがあります。特に、高用量のラミニン処理は、高用量のラミニン処理培養物における神経突起長および細胞生存率の増加によって証明されるように、濃度依存的に細胞培養物への損傷の重症度を軽減する。

この手順を試みる際には、リードタイムを考慮することが重要です。例えば、膜の解毒には3日かかり、製造されたプレートは使用前に一晩硬化させる必要があります。傷害装置には、その動きを駆動するための強力なボイスコイルが含まれており、アクティブなときは常にデバイスから離れ、ステージが移動の頂点にあるときにのみデバイスの電源を切る必要があることを忘れないでください。