Name: ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学ぶペリサイトを組み込んだビーズアッセイによる血管新生の異種細胞相互作用解析法。内皮細胞とペリサイトの相互作用をin vitroで再現し、増殖・移動・吻合の各段階を統合して研究できます。

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有用な議論、夫妻ビクトリア Bautch とジョシュア ブーシェに感謝し、標準的なビーズの最適化に関するアドバイス発芽アッセイ条件と発芽の試金のプロトコルを汚します。S.H.A. だったから国立科学研究所の一般医療下での補助金によって一部にはサポート 5T32 GM007092 賞を受賞します。

<ol><li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li>
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<li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+angiogenesis+and+its+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Basic+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li>
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<li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
</ol>

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このプロトコルは、複雑なステージと徹底解明研究を実施する遺伝とイメージングの方法を採用する研究者を有効にすることによって血管新生を発芽の血液細胞間相互作用を特徴付けるための方法を示します。分析を実行すると、そのビーズの内皮塗着効率の間に起こるビーズ撹拌手順が不可欠です。貧しい内皮コーティングはビーズ ゲル注入前に次の朝のゴルフ ボールのような粗面を有し、代わりに完全に滑らかな表示に表示されない場合は、明らかになります。ビーズが十分に精力的に内皮細胞にビード表面の最大の露出を許可するチューブの攪拌により各撹拌ステップ中に再停止されるが、それがないので積極的に既に内皮細胞を引き起こすように注意してください。ビーズから分離することに接続されています。
ペリサイトをアッセイに追加すると、1 周に 5 の内皮細胞の比率が維持されることが不可欠です。ペリサイトの過剰にはびこるしてアッセイ中血管内皮細胞集団を追い抜くし、ペリサイトの欠乏を引き起こす血管のカバレッジが不足。適切な細胞密度を維持、血管周皮細胞貧しいカバレッジはまだ観察されるペリサイトの攪拌時間は変更する必要があります。携帯電話番号を...

血管新生は適切な胚形成、創傷治癒に不可欠ながん進行1冠動脈疾患を含む多くの疾患で重要な役割を果たします。2,3は、小説、効果的な治療法の開発のために重要な血管新生がどのように通常の開発時に発生して、それは病理学的コンテキストの再アクティブ化方法のより良い理解を持っていることです。良い運転して血管新生の分子機構を特徴と新しい発見をする研究者を許可する重要な段階と生体内の血管新生に関与する細胞の種類を再現忠実の in vitroモデルが必要内皮の規則。
中津とヒューズは、血管新生を発芽の多くの知られていた段階を経るを示している発芽ビーズ アッセイを最適化しています。4,5ここで紹介した方法の目的は、アッセイに perictyes を組み込むことで中津とヒューズを最適化壁画発芽血管内皮細胞のパラクリンおよび juxtracrine の役割に組み込むことができるアッセイに構築するには新規血管新生研究。ペリサイトは、細胞を維持する彼らの血管基底膜に埋め込まれているため内皮細胞に物理的に接触の近くにその役割で定義されている壁画のセルです。6ペリサイトおよび内皮細胞の複雑なクロス話-従事ノッチを含む経路のシグナルを介したシグナリング、Ang Tie2、PDGFRβ、TGFRβ、および他の多くの。7,8マウス モデルこれらのシグナル伝達経路の欠乏を示す悪い血管リモデリングにつながる胚の血管と血管系の機能不全を開発の貧しい周報道。7また、病的血管新生におけるペリサイトの役割は重要ですが、しばしば感謝です。たとえば、腫瘍血管の特徴にある血管より未熟な漏れ、貧しい周報道による機能不全。9それが劇的にペリサイトの有無は、腫瘍の血管の表現型に影響を与えるし、抗血管新生および抗腫瘍療法への応答の重要な仲介者は、提案されています。9このように、生体外の試金のペリサイトの役割を含むは内皮規制の重要なメカニズムをより完全にキャプチャするためのキーです。
現在、血管新生の研究に採用多くの体外と体外の試金が、それぞれに考慮する欠点があります。内皮細胞増殖や血管内皮移動分析など、いくつかは過度に簡略化し、焦点組織培養プラスチックの分離設定では 1 つの血管内皮機能に。10他のアッセイが発生する詳細 3 次元 (3 D) の設定でなどマトリゲル管形成アッセイ、10しかし、これらの試はまだ単純化移行・ デ ・ ノボ血管を形成する内皮細胞の機能に重点既存の血管から発芽するのではなく、構造体。さらに、これらのアッセイのどれもは壁画のセルの種類を組み込みません。前のヴィヴォモデル リング大動脈アッセイなどペリサイト ホスト器官に存在を組み込むことがありますが、これらのモデルの遺伝子操作はのノックアウト、トランスジェニック マウス モデルの生成の必要性のためにより挑戦的、関心の経路。発芽アッセイ ビーズは、内皮発芽、増殖、移行、および 3 D マトリックスでも吻合と内腔形成をモデル化するので最適です。4アッセイは内皮細胞またはより制御された設定でペリサイトの直接遺伝的変更を許可しながら、発芽の多くの異なる段階の機構の評価のために忠実にできます。発芽のビーズを含むフィブリン血栓とが簡単固定、染色、発芽; のさまざまな段階でイメージこれらもやしは、発芽のリアルタイム イメージングを実行するライブ イメージングの商工会議所にも配置できます。ここで紹介する方法は、深さの表現型解析における血管新生の基本的なメカニズムと血管新生中に活性化経路を徹底的に分析研究に最適です。

<table><tbody><tr><td>滅菌ピペットチップ</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>HUVEC Media</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11095114</td><td>10T1/2 Media</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>NHLF Media</td></tr><tr><td>組織培養グレード PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>マグネシウムとカルシウムを含まない</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>10T 1/2 および NHLF</td></tr><tr><td>Customs siRNA</td><td>を持ち</td>上げるため Sigma <td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>10T1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 3マイクロキャリアビーズ</td><td>Sigma</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>組織培養コーティングされた6cmおよび10cmプレート</td><td>ウ</td>シ血漿からのコーニング<td></td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ</td><td>t9549</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>シグマ</td><td>a3428</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン丸底チューブ</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーターとフード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェルガラス底板</td><td>MatTek</td><td>P24G1.513F</td><td>ガラス底板は、芽を画像化する場合にのみ必要です。そうでない場合は、組織培養プラスチックも許容されます。</td></tr><tr><td>滅菌ろ過装置</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

血管新生は既存の血管から新しい血管の成長を胚形成と開発、創傷治癒、腫瘍の成長と転移を含む多くの生物的プロセスと眼と心血管疾患の重要なコンポーネントです。要約血管新生学効果の in vitroモデルは、適切にこのプロセスを研究し、新しい治療戦略のための最終的にターゲットすることができます調節機構が必要です。ビーズ血管新生アッセイは、以前内皮発芽の複数の段階を要約する実証されている体外。しかし、この試金の制限が無い体内の血管内皮-キーを内皮細胞の分子と表現の規制である壁画細胞の相互作用,機能します。ここに与えられたプロトコル ビーズ血管新生アッセイに壁細胞の混入のための方法論を提示し、発芽の培養中に血管内皮細胞と血管の緊密な関連を示します。プロトコルでは、効果的なサイレンシング機構研究の内皮細胞で siRNA を用いた遺伝子のための方法論についても詳しく説明します。完全に、このプロトコルは提供の in vitroアッセイをより適切に発芽して、血管新生に関与するさまざまな細胞タイプをモデル化し、治療評価の新規発見より生理学的関連性の高いプラットフォームを提供します血管新生の調節機構。

このプロトコルは、2 つのセル型in vitro でのタイトな協会と、ペリサイトの存在が発芽 (図 1 a, B) の発生を補完します。プロトコルも効果的なサイレンシング (例えばRNA 干渉経由) (具体的には血管内皮細胞の VEGFA) またはペリサイトの PDGFRβ など7,12のセル型の興味の遺伝子の中に有効にアッセイを阻害アッセイにおける発芽表現型に変換できます。このプロトコルを用いた研究者が分析を実行する標準的な血管内皮細胞だけ発芽血管機能のペリサイトのユニークな貢献をより徹底的に調査する周コーティング発芽アッセイに平行に奨励表現型が研究されています。
このプロトコルで記述されている条件に準拠し...

新規体外ビーズ アッセイをこのプロトコルより適切に体内の血管を組み込むことによって血管新生を萌芽の過程をモデル化します。この変更により、血管内皮細胞と血管新生に重要な壁画と有性の細胞間相互作用をより忠実に再現するビーズ アッセイ。

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

このアッセイの全体的な目標は、in vivoでの血管新生の複雑さをカプセル化するin vitroで異型細胞相互作用を組み込むことです。この方法は、血管新生における周皮細胞内皮細胞相互作用の重要性に関する血管生物学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、増殖、遊走、吻合など、発芽血管新生のさまざまな段階を統合しながら、内皮細胞の周皮細胞相互作用の研究を可能にすることです。まず、マイクロキャリアビーズをPBS中の1ミリリットルあたり10〜4ビーズの濃度の6倍で再構成し、続いてマイクロキャリアビーズ懸濁液のオートクレーブ滅菌を行う。次に、1ミリリットルの完全培地を適切な数の丸底蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)チューブに分注し、室温冷却されたオートクレーブ滅菌マイクロキャリアビーズ懸濁液20マイクロリットルを各チューブに加えます。各チューブに1ミリリットルの細胞を追加します。チューブを攪拌し、20分ごとに穏やかに攪拌しながら、チューブを摂氏37度で2時間半から3時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞を室温で5分間ビーズに休ませ、細胞とビーズがチューブの底に沈殿するのを待ちます。次に、P1000ピペットを使用して、各チューブから0.5ミリリットルの培地を、10から5番目の周皮細胞の2倍と0.5ミリリットルの完全な培地に交換します。細胞ビーズ懸濁液を撹拌し、ビーズが合計4時間攪拌されるまで、20分ごとに穏やかに攪拌しながら細胞を摂氏37度のインキュベーターに戻します。インキュベーションの終わりに、最後にもう一度チューブを静かに攪拌し、すぐに各チューブから2ミリリットルの全量の溶液を個々の6センチメートルプレートに移します。次に、各プレートにさらに3ミリリットルの完全培地を加え、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、マイクロキャリアコーティングビーズの皿を顕微鏡で20倍に拡大して調べ、すべてのビーズが内皮細胞によって十分にコーティングされていることを確認してください。プレートを層流フードに移し、P1000ピペットを使用してコーティングされたビーズ溶液を激しく吸引および分注し、細胞をプレートの底部から分離し、上清を個々のチューブに移します。ビーズがチューブの底に3分間沈殿するのを待ちます。次に、P1000ピペットを使用して、ビーズクラスターを乱さずにできるだけ多くの上清を除去します。チューブあたり1ミリリットルの完全培地にビーズを再懸濁し、ビーズが30〜60秒間沈殿するのを待ちます。P1000ピペットを使用して上清を再度吸引し、ビーズ懸濁液から浮遊する内皮細胞を新鮮な完全培地でさらに2回洗います。3回目の洗浄後、ビーズを2.5ミリリットルのフィブリノーゲン溶液に再懸濁します。ウェルあたり13マイクロリットルのトロンビン溶液を24ウェルのガラス底プレートに加えます。次に、各ウェルに0.5ミリリットルのビーズフィブリノーゲン溶液を加え、ビーズを直接トロンビンに慎重にピペットで移し、ゆっくりと2〜3回上下して溶液を完全に混合します。すべてのウェルを播種したら、トロンビン-フィブリノーゲン溶液を層流フードにプレクロロットし、室温で30分間待ちます。インキュベーションの終わりに、プレートを摂氏37度のインキュベーターにさらに1.5〜2時間慎重に移します。ゲルが完全に固まったら、正常なヒト肺線維芽細胞を完全培地中に1ミリリットルあたり10〜4細胞の濃度で2倍で再懸濁し、各ウェルに1ミリリットルの線維芽細胞を添加します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。コーティングプロトコルを厳守すると、フィブリンゲル移植の準備ができている十分にコーティングされたビーズのこの代表的な画像に示されているように、粗いゴルフボールのような外観の細胞コーティングビーズが得られます。さらに、このプロトコルは、in vitroでの2つの細胞型の緊密な関連を、発芽の発生を補完する周皮細胞の存在と促進します。この手順を試みる際には、攪拌ステップ中にビーズを細胞で完全にコーティングすること、およびゲル注入中に気泡を導入せずにビーズをフィブリンゲルに慎重に埋め込むことを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、血管新生のマウス研究などの他の解析を実施して、in vitroでのペリサイトビーズ発芽アッセイで探索されたメカニズムと表現型のin vivoでの関連性は何かなど、追加の質問に答えることができます。この技術は、がん生物学の分野の研究者や、血管新生のより生理学的に関連性のあるin vitroモデルで内皮細胞の周皮細胞の相互作用と機能を探索するのに役立ちます。

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Developmental Biology

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内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

我々は、マウス脳ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示する。抗生物質フリー濃縮指向のペリサイト抽出に基づいて、このプロトコルは、高純度と高収率を提供するインビトロ研究のための貴重なツールであり、したがって、使用される実験動物の数を減少させる。...

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

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インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

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Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

学ぶペリサイトを組み込んだビーズアッセイによる血管新生の異種細胞相互作用解析法。内皮細胞とペリサイトの相互作用をin vitroで再現し、増殖・移動・吻合の各段階を統合して研究できます。

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

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