CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

このエレクトロポレーションベースのin vivo遺伝子導入アプローチの全体的な目標は、CRISPRを介した機能喪失解析を使用して、小脳顆粒細胞の分化における対象遺伝子の役割を評価することです。この方法は、正常な小脳の発達や脳腫瘍の形成に重要な分子の同定など、発生神経科学や神経腫瘍学における重要な質問に答えるのに役立ちます。子宮内エレクトロポレーションの手順は、Peter Lichter教授の研究室のポスドクであるLena Herbst博士によって実演され、その後、Haikun Di博士の研究室のポスドクであるWeijun Feng博士によって次の免疫組織化学が行われます。

この方法の主な利点は、ノックアウト動物の組み合わせを生成する代わりに、CRISPR-cas9技術を使用して、小脳細胞の目的の遺伝子を実行可能にノックアウトすることを試みることです。この方法は、正常な小脳の発達における遺伝子機能に関する洞察を得ることができますが、他の物理的な脳領域の発達や脳腫瘍のモデリングなど、他のシステムにも適用できます。まず、ホウケイ酸ガラスキャピラリーをマイクロピペットプーラーに装填し、引っ張って細い先端を作ります。

注入中の視認性を高めるために、キャピラリーチップに黒インクでラベルを付け、ガラスにスケールを描きます。実体顕微鏡下で作業し、定規と鋭利な針ピンセットを使用して先端を約6ミリメートルの長さにトリミングし、シャープな片側の面取りエッジを作成します。1%fastグリーンストック溶液をゼロポイントの22ミクロンフィルターでろ過し、溶液から色素粒子を除去します。

シングルガイドRNAプラスミドをルシフェラーゼレポータープラスミドと等量ずつ混合し、各プラスミドの最終濃度が1ミリリットルあたり少なくとも1マイクログラムになるようにします。プラスミド溶液を最終濃度0.5%のファストグリーンで着色妊娠中のCD-1マウスにイソフルランで麻酔した後、マウスを温熱パッドに仰向けに置き、鎮痛剤を投与します。手術中の目の乾燥を防ぐために、目の軟膏を塗布します。

レンズをテープで固定し、消毒液で腹部を消毒します。マウスをガーゼで覆い、手術領域のみを露出させます。長さ約2センチの皮膚切開を行った後、linea albaの位置を特定し、先端が鈍い組織ハサミを使用して、腹膜を通る2回目の切開をわずかに小さくします。

開いた腹腔を予め温めた滅菌PBSで湿らせます。次に、リング鉗子を使用して、腹腔から子宮角を慎重に抽出します。隣接する2つの胚の卵黄嚢の間の隙間にある子宮壁をつかみ、優しく引っ張ります。

切開部を通して胚を引っ張る間、胚に圧力をかけないでください。子宮角が抽出されたら、準備したガラスキャピラリーで約10〜15マイクロリットルの着色プラスミド溶液を吸引します。.このプロセス中は気泡を避けてください。

リング鉗子で胚を優しく保持し、首の部分を見つけます。ガラス毛細血管の先端で背側後脳をゆっくりと貫通し、第4脳室に移動します。プラスミドミックスを約1マイクロリットル注入します。

染色したDNAが脳から漏れ出ていないこと、ひし形の構造として見えることを確認します。ここでは、第4心室の全領域をプラスミド溶液で満たし、DNAを小脳原基の遠位部分にも送達することが最も重要です。同時に、その過程で出血を引き起こさないように注意してください。

直径5mmの電極板を装着したプラチナピンセットを胚の頭部上に横向きに装着し、負極を耳を覆い、正極を小脳原基に子宮壁の上の位置に置くことで、電気の四角いパルスを印加します。すべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮角を慎重に腹腔に戻し、滅菌PBSで満たします。子宮の角を自然な位置にスライドさせます。

麻酔をオフにし、動物を腹を下にして新しいケージに入れて回復させます。凍結切片を作成する前に、脳あたりPBS中の4%PFAの5ミリリットルで、摂氏4度で小脳を一晩固定します。翌日、固定された小脳を脳あたりPBS中の30%スクロースの10ミリリットルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、組織がチューブの底に沈んだ後、スクロースから脳を取り出し、残りのスクロース溶液をセルロースフィルターペーパーで吸収します。次に、使い捨てのプラスチック型で各小脳を最適な切断温度のコンパウンドに浸し、ドライアイスで凍結します。クライオスタットを使用して極低温ブロックを10ミクロンの厚さのセクションに切断し、使用するまでセクションを摂氏マイナス80度に保ちます。

免疫染色に進む準備ができたら、まずスライドを室温で30分間乾燥させ、次にPBSで毎回10分間2回洗浄します。リキッドブロッカーペンで切片を丸で囲み、ブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液に目的の分子に対する一次抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

スライドをPBSを含む0.1%トリトンで10分間ずつ3回洗浄します。次に、DAPIを含むブロッキング溶液で希釈した蛍光色素標識二次抗体を添加し、切片を室温で暗所で1時間インキュベートします。スライドをPBS-Tで3回、毎回10分間洗浄し、スライドをマウントし、イメージングまで摂氏4度に保ちます。

化膿連鎖球菌cas9を安定的に発現するhek293T細胞に、プラスミドを発現し標的とするsgRNAをトランスフェクションした。生細胞におけるGFP発現を、トランスフェクションの48時間後に蛍光細胞イメージャーを用いてモニターしました。この画像は、GFP発現に基づく影響を受けたsgRNA配列を示しています。

この画像は、非効果的なsgRNA配列に起因するGFP発現の欠如を示しています。これらの画像は、フロックスストップカセットと下流のバイシストロンカセインcas9およびEGFP配列を備えたp7-rosa26-LSL-cas9ノックインマウスから、E13.5でE13.5でエレクトロポレーションを行い、制御sgRNAを発現するCreプラスミドを用いて、小脳におけるGFP、Ki67、およびp27の免疫染色を示しています。切片はDAPIで対比染色されています。

Ki67でマークされた外側の顆粒細胞層のGFP発現細胞に注意してください。一度習得すれば、この手術はマウス1匹あたり30分以内に行うことができます。この手順を試みる際には、胚を非常に慎重に取り扱い、常に先端が鋭い毛細血管を使用し、電極を正確な角度に配置して、電気パルスが第4脳室の屋根に確実に送達されるようにすることを覚えておくことが重要です。

その開発後、この技術は、医学分野の研究者がマウス小脳の脳腫瘍を含む神経障害の原因要因を探求する道を開きました。