Name: CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ子宮内エレクトロポレーションによる小脳顆粒細胞のCRISPR遺伝子導入法。発達神経科学や脳腫瘍研究における遺伝子機能評価に応用可能です。

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テクニカル サポートにローラ ジーバー、アンナ Neuerburg、ヤシン ハリムとペトラ, を申し上げます。我々 もありがとう夫妻・ k ・ Reifenberg、k. デル、P. Prückl DKFZ; で動物実験の支援イメージング コアの施設、DKFZ とカール ツァイス イメージング センター、DKFZ 共焦点顕微鏡画像。この作品は、ドイツ研究振興協会、KA 4472/1-1 (に称えられ) によって支えられました。

<ol><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
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<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
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<li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2C+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303(2016).</li>
<li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).</li>
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Exo 子宮エレクトロポレーションを使用すると、以前 siRNA ベースは生体内での機能解析 Atoh1 小脳顆粒の初期の段階で細胞分化8を報告した.SiRNA 希釈/劣化と子宮壁外胚の露出のため electroporated 顆粒細胞の表現型の分析は、胚の段階に限られていた。ただし、現在のメソッドは生後動物の表現型の分析を有効にします。
私たちの以前の研究を示した子宮内エレクトロポレーションに成功した髄芽腫2を介して腫瘍のサプレッサー Ptch1の Cas9 を介したノックアウト。比較では、現在のアプローチは、2 つの主要な利点を展示: 1) Cas9 する必要はありません、プラスミドで配信される複数遺伝子の代わりに単一のプラスミドで複数の sgRNA 式カセットを運ぶことによってターゲットを可能にします。・ 2) 標的細胞とその後代が永久に付け GFP、生きた細胞の可視化を有効にして、 in vivo</...

脳疾患は、最も恐ろしいの致命的な病気の一つです。彼らはしばしば起因遺伝的変異とその後破綻。脳疾患の分子機構を理解するには、人間の患者のゲノムを解読する永遠に続く努力は、潜在的な原因となる遺伝子の数を発見しました。これまでのところ、体内の利得の機能 (GOF) とそのような候補者の遺伝子の機能喪失 (LOF) 解析の生殖細胞系遺伝子組み換え動物モデルが利用されています。機能検証研究の加速の開発によりより実現可能で柔軟な生体内遺伝子アッセイ系遺伝子の機能を研究するためお勧めします。
マウス脳の発達する生体内でエレクトロポレーションを用いた遺伝子伝達システムのアプリケーションは、この目的に適しています。実際、子宮内エレクトロポレーションを使用していくつかの研究は、発展途上の脳1,2,3の機能解析を行うことの可能性を示しています。実際には、マウスの脳、大脳皮質4網膜5間脳6、7菱脳、小脳8脊髄9などのいくつかの地域は、体細胞の遺伝子導入による対象となっています。これまでアプローチ。
確かに、マウス萌芽期の脳に生体内でエレクトロポレーションによる一時的な遺伝子発現は GOF 分析のため長い間使用されています。さらに最近のトランスポゾンを用いたゲノム統合技術有効利息10,11, 遺伝子の長期および/または条件式中に空間的で、一時的な方法で遺伝子機能を解剖に有利であります。開発。GOF 解析と対照をなして LOF 分析は難しくされています。Sirna と shRNA 運ぶプラスミドのトランスフェクションが実行されますが、外因に導入された核酸、プラスミドなど二本の最終的な劣化による遺伝子の LOF の長期効果は保証されません。ただし、LOF 解析におけるブレークスルー CRISPR/Cas 技術を提供します。蛍光蛋白質 (例えばGFP) または (例えばホタルのルシフェラーゼ) の発光タンパク質をコードする遺伝子は、CRISPR Cas9 と sgRNAs CRISPR Cas9 媒介体細胞突然変異の細胞をラベルする co transfected されて持っています。それにもかかわらず、このアプローチ制限機能研究では増殖細胞外因性マーカー遺伝子を希釈し、長期的な増殖後低下するので。Transfected セルおよびその娘細胞は、CRISPR による突然変異、ゲノムを受ける中、彼らの足跡を時間をかけて失われて得るかもしれない。したがって、遺伝的ラベリングのアプローチはこの問題を克服するために適当でしょう。
我々 は最近、分化12長期的な増殖を受ける小脳顆粒細胞における CRISPR ベース LOF 方式を開発しました。遺伝子 transfected セルにラベルを付ける、 Creと共に sgRNA を運ぶプラスミドを構築し、Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP マウス13 子宮内エレクトロポレーションを用いた小脳にプラスミドを導入します。異なり、通常のプラスミッドのベクトルは EGFP をエンコード、このアプローチ ラベル付け transfected 顆粒ニューロン前駆体 (GNPs) とその娘細胞。このメソッドは、通常の脳の発達と腫瘍が発生しやすい背景における増殖細胞に興味の遺伝子の生体内で機能を理解する上で素晴らしいサポートを提供します。

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 ヤギ アンチチキン</td><td>ThermoFisher</td><td>A11039</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>Alexa 568 ロバ アンチマウス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-10037</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>Alexa 594 ドンキー アンチウサギ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A21207</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>Alexa 647 ドンキー アンチウサギ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A31573</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ (FastAP)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブバンド</td><td>キスカーバイオテック</td><td>150262</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI (FastDigest)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>セルロースフィルターペーパー (Whatman)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347525</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td>Tork</td><td>530378</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>バイオビジョン</td><td>7903-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9542</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>使い捨てプラスチック金型 (ティッシュテック サイロモールド)</td> <td>VWR</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>DMEM グルタマックス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31966047</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロスクエアポレーター</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>エンドフリー マキシキット</td><td>キアゲン</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏 (ベパンテン)</td><td>バイエル</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン</td><td>メルク</td><td>104022</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10270-016</td><td></td></tr><tr><td>フィルター(0.22 & micro;m)</td><td>メルク</td><td>F8148</td><td></td></tr><tr><td>蛍光細胞イメージャー (ZOE)</td><td>Biorad</td><td>1450031</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15387311</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>フィラメント付きガラス毛細管</td><td>成重</td><td>GD1-2</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>ThermoLux</td><td>463265 / -67</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア (ImageJ and Fiji)</td><td>NIH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 (B. Braun OMNICAN U-100)</td><td>Carl Roth</td><td>AKP0.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>TU061219</td><td></td></tr><tr><td>IVISルミナLTシリーズIIIキャリパー</td>パーキン<td>エルマー</td><td>CLS136331</td><td></td></tr><tr><td>カルト縫合針</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>12050-02</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HIFI HOTSTART READYミックス</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Ki67抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500希釈ライト</td></tr><tr><td>ポインターフォト</td><td>ニック</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>液体ブロッカーペン</td><td>Kiskerバイオテック</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>メタミゾール</td><td>WDT</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>マイクログラインダー</td><td>成重</td><td>EG-45</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>成重</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>P-97</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>ソフトウェア ZEN</td> Zeiss-Non-sterile <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture Thread (0.12 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound (Tissue-Tek)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>p27 antibody</td><td>BD bioscience</td><td>610241</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-EGxxFP</td><td>Addgene</td><td>50716</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>pX330 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>リング鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>スライド (SuperFrost)</td><td>ThermoFisher</td><td>10417002</td><td></td></tr><tr><td>生物統計学用ソフトウェア (プリズム 7)</td><td>GraphPad Software,</td> <td>Inc-Spitacid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>EcoLab</td><td>3003840</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>C-PS</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>先端が鈍い外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸 (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))</td><td>SMI</td><td>220340</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ライゲーションバッファー</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュハサミ ブラント (11.5 cm)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>TOP2B 抗体</td><td>サンタ クルス</td><td>sc13059</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>トリプシン (2.5 %)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット 5mm &Oslash; ディスク電極 プラチナ</td><td>エクセルティス GmbH</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>気化器</td><td>Dr&auml;ガーヴェルクAG</td><td>GS186</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

脳の奇形はしばしば遺伝の突然変異によって引き起こされます。解読患者由来組織の突然変異は病気の潜在的な原因となる要因を識別しています。発病する変異遺伝子の機能不全の貢献度を検証するため、突然変異を運ぶ動物モデルの生成はわかりやすいアプローチの 1 つです。生殖細胞系遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) 人気のある生物学的ツールと再現性のある結果を展示、それは時間とコストによって制限されています。一方、非生殖 GEMMs は、しばしばより現実的な方法で探索の遺伝子機能を有効にします。いくつかの脳から体に起因する病気 (例えば、脳腫瘍) が見えて、ない生殖細胞系突然変異、非生殖細胞キメラ マウス モデル、正常と異常な細胞が共存疾患関連する分析のために有用かもしれない。本研究では、小脳に CRISPR 媒介体細胞突然変異の誘導法を報告します。具体的には、利用条件付きノックアウトのマウス、 Cas9とGFPの慢性的なアクティブ化するCAG (CMV エンハンサー/鶏 β-アクチン) プロモーターでCre後-ゲノムの組換えを介した。自己設計されていたシングル ガイド Rna (sgRNAs) と単一プラスミド構築でエンコードされた両方 Cre リコンビナーゼ シーケンスは、子宮内でエレクトロポレーションを使用して萌芽期の段階で小脳幹/前駆細胞に渡されました。その結果、transfected セルおよびその娘細胞は緑色蛍光タンパク質 (GFP) ため、さらに表現型解析が容易で付けられました。したがって、このメソッドは、胚性小脳細胞へのエレクトロポレーション法による遺伝子導入を示すだけでなく、また CRISPR 媒介機能喪失の表現型を評価する定量的手法を提案します。

生体内機能解析、外因性遺伝子が導入された細胞を識別するために重要です。マーカーの表現は、非増殖細胞における GFP でくフォロー アップの時間の長い期間のような信号は細胞増殖に順番に失われます。この効果の実例は、図 1に示されています。LOF 分析 transfected セルのフット プリントを失うことを回避するために CRISPR/Cas9 技術とエレクトロポレーション法による遺伝子導入を組み合わせることで新しいアプローチを開発しました。
代表的な結果は、図 2のとおりです。PU6-sgTop2b-Cbh-Cre のトランスフェクションによってプラスミドの構成要素の機能をテストし、安定に発現する SpCas9 細胞の pCAG の-例えば-Top2b-FP17、sg...

ノックアウト動物を用いた遺伝子の機能喪失従来は、高価で時間のかかる多くの場合されています。CRISPR 媒介体細胞突然変異誘発のエレクトロポレーション ベースは遺伝子の生体内の機能を理解するための強力なツールです。小脳の細胞増殖にノックアウトの表現型を解析する手法を報告する.

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

このエレクトロポレーションベースのin vivo遺伝子導入アプローチの全体的な目標は、CRISPRを介した機能喪失解析を使用して、小脳顆粒細胞の分化における対象遺伝子の役割を評価することです。この方法は、正常な小脳の発達や脳腫瘍の形成に重要な分子の同定など、発生神経科学や神経腫瘍学における重要な質問に答えるのに役立ちます。子宮内エレクトロポレーションの手順は、Peter Lichter教授の研究室のポスドクであるLena Herbst博士によって実演され、その後、Haikun Di博士の研究室のポスドクであるWeijun Feng博士によって次の免疫組織化学が行われます。この方法の主な利点は、ノックアウト動物の組み合わせを生成する代わりに、CRISPR-cas9技術を使用して、小脳細胞の目的の遺伝子を実行可能にノックアウトすることを試みることです。この方法は、正常な小脳の発達における遺伝子機能に関する洞察を得ることができますが、他の物理的な脳領域の発達や脳腫瘍のモデリングなど、他のシステムにも適用できます。まず、ホウケイ酸ガラスキャピラリーをマイクロピペットプーラーに装填し、引っ張って細い先端を作ります。注入中の視認性を高めるために、キャピラリーチップに黒インクでラベルを付け、ガラスにスケールを描きます。実体顕微鏡下で作業し、定規と鋭利な針ピンセットを使用して先端を約6ミリメートルの長さにトリミングし、シャープな片側の面取りエッジを作成します。1%fastグリーンストック溶液をゼロポイントの22ミクロンフィルターでろ過し、溶液から色素粒子を除去します。シングルガイドRNAプラスミドをルシフェラーゼレポータープラスミドと等量ずつ混合し、各プラスミドの最終濃度が1ミリリットルあたり少なくとも1マイクログラムになるようにします。プラスミド溶液を最終濃度0.5%のファストグリーンで着色妊娠中のCD-1マウスにイソフルランで麻酔した後、マウスを温熱パッドに仰向けに置き、鎮痛剤を投与します。手術中の目の乾燥を防ぐために、目の軟膏を塗布します。レンズをテープで固定し、消毒液で腹部を消毒します。マウスをガーゼで覆い、手術領域のみを露出させます。長さ約2センチの皮膚切開を行った後、linea albaの位置を特定し、先端が鈍い組織ハサミを使用して、腹膜を通る2回目の切開をわずかに小さくします。開いた腹腔を予め温めた滅菌PBSで湿らせます。次に、リング鉗子を使用して、腹腔から子宮角を慎重に抽出します。隣接する2つの胚の卵黄嚢の間の隙間にある子宮壁をつかみ、優しく引っ張ります。切開部を通して胚を引っ張る間、胚に圧力をかけないでください。子宮角が抽出されたら、準備したガラスキャピラリーで約10〜15マイクロリットルの着色プラスミド溶液を吸引します。.このプロセス中は気泡を避けてください。リング鉗子で胚を優しく保持し、首の部分を見つけます。ガラス毛細血管の先端で背側後脳をゆっくりと貫通し、第4脳室に移動します。プラスミドミックスを約1マイクロリットル注入します。染色したDNAが脳から漏れ出ていないこと、ひし形の構造として見えることを確認します。ここでは、第4心室の全領域をプラスミド溶液で満たし、DNAを小脳原基の遠位部分にも送達することが最も重要です。同時に、その過程で出血を引き起こさないように注意してください。直径5mmの電極板を装着したプラチナピンセットを胚の頭部上に横向きに装着し、負極を耳を覆い、正極を小脳原基に子宮壁の上の位置に置くことで、電気の四角いパルスを印加します。すべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮角を慎重に腹腔に戻し、滅菌PBSで満たします。子宮の角を自然な位置にスライドさせます。麻酔をオフにし、動物を腹を下にして新しいケージに入れて回復させます。凍結切片を作成する前に、脳あたりPBS中の4%PFAの5ミリリットルで、摂氏4度で小脳を一晩固定します。翌日、固定された小脳を脳あたりPBS中の30%スクロースの10ミリリットルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、組織がチューブの底に沈んだ後、スクロースから脳を取り出し、残りのスクロース溶液をセルロースフィルターペーパーで吸収します。次に、使い捨てのプラスチック型で各小脳を最適な切断温度のコンパウンドに浸し、ドライアイスで凍結します。クライオスタットを使用して極低温ブロックを10ミクロンの厚さのセクションに切断し、使用するまでセクションを摂氏マイナス80度に保ちます。免疫染色に進む準備ができたら、まずスライドを室温で30分間乾燥させ、次にPBSで毎回10分間2回洗浄します。リキッドブロッカーペンで切片を丸で囲み、ブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液に目的の分子に対する一次抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。スライドをPBSを含む0.1%トリトンで10分間ずつ3回洗浄します。次に、DAPIを含むブロッキング溶液で希釈した蛍光色素標識二次抗体を添加し、切片を室温で暗所で1時間インキュベートします。スライドをPBS-Tで3回、毎回10分間洗浄し、スライドをマウントし、イメージングまで摂氏4度に保ちます。化膿連鎖球菌cas9を安定的に発現するhek293T細胞に、プラスミドを発現し標的とするsgRNAをトランスフェクションした。生細胞におけるGFP発現を、トランスフェクションの48時間後に蛍光細胞イメージャーを用いてモニターしました。この画像は、GFP発現に基づく影響を受けたsgRNA配列を示しています。この画像は、非効果的なsgRNA配列に起因するGFP発現の欠如を示しています。これらの画像は、フロックスストップカセットと下流のバイシストロンカセインcas9およびEGFP配列を備えたp7-rosa26-LSL-cas9ノックインマウスから、E13.5でE13.5でエレクトロポレーションを行い、制御sgRNAを発現するCreプラスミドを用いて、小脳におけるGFP、Ki67、およびp27の免疫染色を示しています。切片はDAPIで対比染色されています。Ki67でマークされた外側の顆粒細胞層のGFP発現細胞に注意してください。一度習得すれば、この手術はマウス1匹あたり30分以内に行うことができます。この手順を試みる際には、胚を非常に慎重に取り扱い、常に先端が鋭い毛細血管を使用し、電極を正確な角度に配置して、電気パルスが第4脳室の屋根に確実に送達されるようにすることを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、医学分野の研究者がマウス小脳の脳腫瘍を含む神経障害の原因要因を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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