Name: ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶGel-seq法によるDNA・RNA同時シーケンスライブラリ調製。少量細胞（100〜1000個）からサンプル分割せずゲノムとトランスクリプトーム情報を低コストで取得し、構造変異と遺伝子発現の関連を解析する革新的マルチオミクス技術です。

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この仕事のための資金は、国立科学財団大学院研究フェローシップ ・ プログラム、サン ディエゴ大学 NIH R01-HG007836 を与えると科学、ICT および将来計画の韓国大臣によって。
以前のバージョンのいくつかの数字が"・ ザ ・ フープル、g. d.らで出版された最初ゲル-seq: 全ゲノムとトランスクリプトーム シーケンスによる半透性ハイドロゲル障壁を用いた同時低入力 DNA および RNA 図書館準備によって。ラボオン チップ 17、2619-2630 doi:10.1039/c7lc00430c (2017)."ラボオン チップは、このパブリケーション内の図の再利用を認可しています。

<ol><li>Mawy, T. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n1/full/nmeth.2771.html">Single-cell sequencing.</a> Nat Methods. 11 (1), 18(2014).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2013-14-4-r31">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14 (4), 31(2013).</li>
<li>Ramsköld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-seq%3A+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome+and+transcriptome+sequencing+of+the+same+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell.</a> Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).</li>
<li>Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+large+RNA+molecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing large RNA molecules in solution.</a> RNA. 18 (2), 284-299 (2012).</li>
<li>SDS-PAGE Gel. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/7/pdb.rec087908.full?text_only=true">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2015 (7), 087908(2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd</a> (2017).</li>
<li>Vitak, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+thousands+of+single-cell+genomes+with+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing.</a> Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).</li>
<li>A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev B. Bio Rad. , Available from: 
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<li>Illumina. <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">Nextera ® XT DNA Library Preparation Kit</a>. , (2017).</li>
<li>Takara Bio USA Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SMART-Seq+v4+Ultra+Low+Input+RNA+Kit+for+Sequencing+User+Manual%22">SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual</a>. , (2016).</li>
<li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li>
</ol>

カザフスタンは、共同創設者兼 Singlera ジェノミクス社の科学アドバイザー

ゲル seq デバイス作製とプロトコル自体に関連付けられているいくつかの重要な手順があります。製作中にゲルの様々 な地域の所定の層の厚さで始まるをお勧めします。異なる製造オプションをテスト時間を大幅を過ごし、ここで説明したプロトコル [テーブルの材料および試薬カセットの最高のデバイスが生成されます。研究者は、代替カセット システムを使用している場合、デバイスを作成するときに使用されるボリュームを微調整するために必要な彼らがあります。作製での大きな課題は、高密度のゲル化領域が大きすぎて、カセットの端から剥離して電気泳動を妨げるカセットの内部の空気のポケットを作成する場合。冊別のレイヤーにいくつかのカセットをキャストすることによって研究者は、独自のハードウェアの最適構成をすばやく判断できる必要があります。
ゲル seq プロトコル プロトコルを完了する前に検証することができますいくつかの重要な手順があります。1 つの潜在的な障害ポイントは、gDNA RNA/cDNA の分離です。これは分離後ゲル seq デバイスをイメージングによって検証できます (<...

次世代シークエンシング (NGS) は、遺伝学研究方法の深遠な影響を与えています。ここでの研究者は、一度全体の種のゲノムに焦点を当てて、今単一の腫瘍または 1 つの実験でも単一セルのゲノムを配列することが可能です。1 NGS もしました、トランスクリプトームと呼ばれるデータのコレクションのセル内にある RNA 転写産物をシーケンス処理する費用対効果。増幅し、小さい開始サンプルから DNA または RNA をシーケンスする能力は、過去 5 年間で達成されているのみ。2,3,4は残念ながら、標準のプロトコルに互換性がないと研究者はある特定のサンプルの DNA または RNA をシーケンス処理するかどうかを選択する必要があります。開始サンプルが十分に大きい場合は、半分に分割することができます。ただし、規模が小さいサンプルの分裂のための材料の損失はライブラリの品質に影響を与えるし、細胞間の興味深いバリエーションを平均することができますサンプルのプールします。5さらに、研究者は単一のセルまたは小さな異種腫瘍生検などを分割できないサンプルを調べることに興味を持つ。6
この問題を解決する 3 つのプロトコルが最近開発された同じ開始サンプルから DNA と RNA の両方をシーケンス処理する: ゲル seq7、G &amp; T seq8、および DR seq9。この記事は、ゲル-seq、同時にごくわずかな追加コストで 100 細胞から DNA および RNA のライブラリを生成するための詳細なプロトコルを示します。ゲル seq の小説の側面は、DNA と RNA 低コスト ハイドロゲル行列を使用して大きさだけに基づいて区別する能力です。ゲル Seq プロトコルのコア技術革新は RNA から DNA を物理的に分離します。この分離は、電気泳動によってこれらの分子のサイズ違いの活用のポリアクリルアミドの膜の組み合わせを使用して実現されます。コンテキストでこれらのサイズ違いを置く、DNA と RNA をイメージする方法を検討してください: RNA ナノメートル スケール上に存在し、低温電子などの複雑な技術を使用してイメージを作成する必要があります DNA ミクロン スケール上に存在する、伝統的な顕微鏡を使用して表示することができますが、顕微鏡検査。10
このプロトコルでは DNA と RNA を分離するアプローチは、図 1に示します。左側のパネルは、DNA および RNA の無料ソリューション膜近くに浮かんでいるを示しています。電気フィールドを適用すると、右側のパネルに示すように、DNA および RNA は膜を介して移行を誘導する電気泳動の力を体験します。膜特性を調整することにより、RNA から DNA を分離する半透膜を作成しました。DNA 分子は膜に対して押されるが、サイズが大きいので端につれ。その一方で、小さな RNA 分子を再構成し、できます膜を通して彼らの方法を織る。レプテーション、として知られているこのプロセスはヘビが草を介して移動する方法に似ています。さらに小さいポリマー難しすぎて第二に、高密度の膜によってこれらの RNA 分子を停止する最終的に (&gt; 200 塩基対) をくねらせるため。一度物理的に分離、DNA および RNA 回収し、処理できるゲノムとトランスクリプトームの両方に関する情報を生成します。我々 は DNA と RNA を区切ることができます、我々 は分離前に cDNA に転写される RNA が逆の場合より良い結果が得られますを発見しました。CDNA/RNA 雑種は単独で RNA より安定して、低密度の膜を通して渡すことができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> 図 1.ゲル seq 動作原理。物理的に DNA と RNA を分離するために使用する基本原理。応用電界で小さな RNA 分子が低密度の膜を通って移行しますが、大きい DNA の分子が表面に閉じ込められています。この図は、王立化学協会の許可を得て参考文献 7 から再現しました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
本稿で詳細にゲル seq デバイス作製を生成する生物学的プロトコル ペアに DNA および RNA のライブラリ。両方の概要を図 2に示します。レイヤー 3 つ異なる密度ポリアクリルアミドゲルで互いの上に標準的なスタッキングのゲルを作成する同じプロセスでデバイスを作製しました。11生物学的プロトコルから始まる 100-1000 細胞を PBS で中断します。細胞を分離、cDNA/RNA 雑種からゲノム DNA を分離するデバイスを使用する前に、RNA が cDNA に変換されます。後分離と回復、ゲノム、トランスクリプトーム ライブラリは、標準の全ゲノム ライブラリの準備キットのプロトコルに密着したプロセスを使用して準備されます。チップ用の文書でラボでの開発とゲル seq の検証についてさらに詳細を読むことができます"ゲル seq: 全ゲノムとトランスクリプトーム シーケンス半透性ハイドロゲル障壁を用いた同時低入力 DNA および RNA 図書館準備で."7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> 図 2.ゲル seq プロトコル。ゲル seq デバイスおよびプロトコルを生成するための手順の概要については、DNA および RNA のライブラリ ペア。この図の部分は、王立化学協会の許可を得て参考文献 7 から再現されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
単一セルからの DNA および RNA のライブラリを生成するため、研究者は G &amp; T seq や DR seq. G 
DR seq は DNA や RNA からの cDNA の両方が同じ管で増幅される中古増幅ステップに依存します。サンプルが 2 つに分割し、DNA と RNA シーケンス ライブラリを準備する並列で処理します。ゲノム DNA と RNA からの cDNA の区別は、DR seq は計算のアプローチを取る。エクソンのみが存在するシーケンスは、それらは DNA や RNA から由来している可能性がありますと計算ゲノム DNA データの抑制されます。9このアプローチの利点は、DNA と cDNA/RNA 区切る必要はありません物理的にゲル seq と G &amp; T seq. で行われるように欠点は、ただしは、DR seq のゲノムとトランスクリプトーム (すなわちイントロンとエクソン)、事前知識を必要とし、多くの転写産物がないまだ完全に核のシーケンスなどのアプリケーションに最適なできない可能性があります。スプライシング ・ イントロンが含まれています。12
ゲル seq の小説の側面は、DNA と RNA のサイズのみに基づいてセルの数百を分離する能力です。このメソッドには、ゲノム、トランスクリプトームの先験的知識は不完全な接続に対してロバストとポリ adenylated の成績証明書に限定されていませんが必要です。研究者が少なくとも 100 セルから始まる、アプリケーション、ゲル seq は安く、広く利用可能な材料を使用して簡単な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミドモノマー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td>本文中では固相可逆固定化(SPRI)ビーズ</td></tr>と呼ばれている <tr><td>DNA ゲルローディング染料 (6x)</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>R0611</td><td>本文中では 6X ローディング色素</td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST ワンステップ qRT-PCR キット</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>本文中では 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebis(アクリルアミド)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>別名ビスアクリルアミド</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (本文中ではライブラリ調製キットと表記)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>含まれるもの: TD (本文中ではトランスポゼースバッファーと表記)、ATM (本文中ではトランスポゼースと表記)、NT (本文中ではトランスポゼース ストップバッファーと表記)、NPM (本文中ではライブラリ調製 PCR ミックスと表記)</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 キット (本文中では全転写産物増幅 (WTA) キットと表記)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>含まれるもの: 溶解バッファー、RNase 阻害剤、3'SMART-Seq CDS Primer II A(本文中ではRTプライマーと表記)、5X Ultra Low First Strand Buffer(本文中ではFirst Strand Bufferと表記)、SMART-Seq v4 Oligonucleotide(本文中ではテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド(TSO)と表記)、SMART-Scribe Reverse Transcriptase(本文中では逆転写酵素と表記)、PCR Primer II A(本文中ではcDNA PCRプライマーと表記)</td></tr><tr><td>WTAアダプター付きランダムヘキサマー&nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T9281-25MLDNA</td><td></td></tr><tr><td>アウェイ表面除染剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>7010PK&nbsp;&nbsp;</td><td>本文中ではDNA除去製品と呼ばれ</td></tr>ています<tr><td>トリス-ホウ酸-EDTAバッファー(10倍濃度)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>本文中ではゲル染色</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp;シリンジ針、ゲージ 18</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z192554</td><td>同等のハードウェアであれば何でも可</td></tr><tr><td>ブランソンCPXシリーズ超音波浴</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z769363</td><td>同等のハードウェアであれば何でも可能</td></tr><tr><td>エンプティ・ゲル・カセット、ミニ、1.0mm</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>NC2010</td><td>同等のハードウェアであれば何でも許容されます</td></tr><tr><td>メッシュフィルタープレート - コーニング&nbsp;HTSトランズウェル96ウェル透過性サポート - 8.0 & マイクロ;m 細孔径</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CLS3374</td><td>本文中では 8 um メッシュフィルタープレート</td></tr><tr><td>PowerPac HC 電源</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1645052</td><td>同等のハードウェアであれば何でも可</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>同等のハードウェアは何でも許容されます</td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>エッペンドルフ</td><td>22822993</td><td>同等のハードウェアであれば何でも許容されます</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>同等のハードウェアであれば何でも構いません</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>同等のハードウェアであれば何でも構いません</td></tr><tr><td>アマシャム UVC 500 紫外線架橋剤</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>UVC500-115V</td><td>製造中止、同等のハードウェアはどれでも使用できます</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ ゲルドキュメンテーションシステム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708195</td><td>本文中ではゲルイメージャー</td></tr>と呼ばれています <tr><td>Dark Reader トランスイルミネーター</td><td>クレア・ケミカル・リサーチ</td><td>DR89</td><td>本文中では UV トランスイルミネーター</td></tr><tr><td>&nbsp;超音波&nbsp;バスブラン</td><td>ソニック</td><td>1207K35</td>同等の<td>超音波浴は許容されます。</td></tr></tbody></table>

ゲル-seq: dna および rna のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

増幅し、小さい開始サンプルから DNA または RNA をシーケンスする能力は、過去 5 年間で達成されているのみ。残念なことに、ゲノムの生成やトランスクリプトーム ライブラリの標準的なプロトコルに互換性がないと、研究者は特定のサンプルの DNA または RNA をシーケンスするかどうかを選択する必要があります。ゲル seq DNA と単純なハイドロゲル デバイスを用いた 100-1000 細胞から始まる RNA の両方のライブラリを同時に準備する研究者を有効にしてこの問題を解決します。対ライブラリを生成する生物のプロトコルと同様に、デバイス作製のための詳細なアプローチを提案する.他の研究者によって簡単に実装できるようにゲル seq を設計多くの遺伝学研究所はすでにゲル seq デバイス作製を再現する必要な機器を持っています。私達のプロトコルは両方全体転写増幅 (WTA) のための一般的に使用されるキットを採用しています、ライブラリ生成ゲノムおよびトランスクリプトームに精通したライブラリの準備は、既に研究者に精通していることも多い。我々 のアプローチでは、ごくわずかな追加コストと分割せず単一サンプル、DNA と RNA の両方のシーケンスの力をもたらすために研究者をことができます。

蛍光イメージング; 的ゲル seq デバイス/RNA の cDNA と gDNA 雑種の物理的な分離に視覚化できます。代表的な結果を図 3に示します。パネルを示しますゲル seq 素子を試作偽色が異なるゲル領域を区別するために追加されました。パネル B を検証に使用される 4 つの異なる分離のクローズ アップ表示します。第 3 レーン、ネガティブ コントロールは、背景を表し、界面ゲルの autoflourescence がないことを示しています。我々 は DNA の梯子の最初と 2 番目のレーンを読み込まれます。これらの車線は低高密度膜間、明らかに小さい片は低密度のゲルが通過できるインターフェイスで暗いバンドのみを表示します。第 4 レーンが興味の生物的サンプルの動作を示しています: 500 PC3 細胞。プロトコルの手順 3 で説明した 4 つの車線を読み込みます。画像は、ゲノム DNA と cDNA/RNA 雑種の分離を示しています。低密度の膜の上部に暗いバンドは megabase スケール ゲノム DNA ...

ゲル seq の両方 DNA と RNA-seq 単純なハイドロゲル デバイスを用いた 100-1000 細胞からごくわずかな追加コストでライブラリを同時に準備することも可能。 にします。対ライブラリを生成する生物のプロトコルと同様に、デバイス作製のための詳細なアプローチを提案する.

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

この実験の全体的な目標は、サンプルを任意の時点で分割することなく、細胞の小さな集団のDNAとRNAの両方から次世代のシーケンシングライブラリを生成することです。この方法は、遺伝子の発現におけるDNAの構造的変異を研究するための新しいアプローチを研究者に提供します。私たちが最初にGel-seqを考案したとき、同じサンプルからDNAとRNAの両方を同時にシーケンシングするためのプロトコルはありませんでした。幸いなことに、この問題を解決する 3 つのアプローチが公開されています。この技術の主な利点は、ゲノム情報とトランスクリプトーム情報の両方を同じ細胞セットから取得でき、追加コストがほとんどないことです。Gel-seqはもともとアップライトカセットで開発されましたが、このプロトコールは標準的なゲル電気泳動カセットで機能するように適合させることができます。フィラー、高密度、および低密度の前駆体混合物を3つのチューブで調製します。記載されている順序で試薬を添加し、混合物をボルテックスします。APSまたはTemedのいずれかを時期尚早に追加しないでください。指示があるまで待ちます。次に、まずキャップに針を挿入して各ゲルモノマー溶液を脱気します。次に、針をハウスバキュームラインに接続し、このアセンブリを超音波浴に浸します。液体から泡が出なくなるまで約1分待ちます。次に、フィラー前駆体混合物に、TemedとAPSを添加し、短時間ボルテックスします。3分以内に、1mmピペットを使用して、こぼさないように各ゲルカセットに6mmを追加します。カセットを水平なテーブルに直立させて配置することにより、液体が水平であることを確認します。次に、脱気イオン水でカセットを徐々に補充し、重合混合物と水の混合を最小限に抑えるように注意します。その後、ポリマーを1時間から一晩硬化させます。ポリマーが硬化したら、ウォーターオーバーレイを捨て、6インチ離れたところから圧縮空気を穏やかに流してゲルの表面を乾燥させます。次に、高密度ゲル前駆体にTemedとAPSを添加し、短時間ボルテックスします。3分以内に、320マイクロリットルを各カセットに移し、カセットを前後に数回揺らしてフィラーゲル層に広げます。次に、脱イオンおよび脱気水でカセットを補充し、ポリマーを約1時間硬化させます。硬化したら、以前と同様にポリマーを乾燥させます。最後に、低密度ゲル前駆体混合物にTmedとAPSを添加し、ボルテックスします。次に、残りのカセットにこの混合物をすばやく充填し、硬化が始まる前にゲルコームを挿入します。次に、重合中に吸着する余分な予備前駆体をコームに加えます。硬化後、カセットは使用できるようになります。RNAをcDNAに変換した後、ゲルを使用して目的の画分を回収します。まず、数ミリリットルのDNA除去製品と糸くずの出ないワイプを使用して、電気泳動チャンバーを徹底的に洗浄します。次に、チャンバーに清潔なゼロポイント5 XTBEを充填し、装置全体を254ナノメートルのUV架橋オーブンに入れ、15分間滅菌します。次に、Gel-seqカセットを電気泳動チャンバーに挿入し、所定の位置にロックします。次に、ゲルを引き裂かずにゆっくりと上に引っ張って、ジェルコームをゆっくりと取り外します。次に、ピペットを使用してサンプルをロードします。サンプルをロードするときは、ウェル間の汚染の可能性を最小限に抑えるために、チップをウェルに完全に挿入してください。Gel-seqカセット全体に250ボルトの電界を30分間印加して、gDNAをcDNA/RNAハイブリッドから分離します。ゲルをロード、実行、および収集した後、メスを使用してゲルを高密度層のすぐ下で半分に切断し、フィラーゲルの半分を廃棄します。次に、カセットに残ったゲルを、掻き取り工具を慎重に使用してそっと剥がします。ゲルドックを使用して分離を確認した後、トランスイルミネーターを使用してバンドを切り出します。gDNAは低密度ゲルの開始点に位置し、cDNAは低密度領域と高密度領域の界面に位置する必要があります。次に、メスを使用して、gDNAとcDNAを含むゲルの領域を切り取ります。また、ネガティブコントロールレーンから同じセクションを削除します。鈍いピンセットを使用して、ゲルの切片をストリップチューブにそっと移します。ゲルが壊れた場合は、壊れた破片をすべて見つけてチューブに移します。次に、円を描くように動かしながら、ピペットチップでプレスしながら各ゲルを粉砕します。チップを取り外す前に、gDNAに40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加し、cDNAサンプルに80マイクロリットルを追加します。次に、チップを慎重に取り外して廃棄します。次に、ストリップチューブを摂氏37度のボルテックスミキサーに固定し、8〜12時間振とうします。したがって、DNAはゲルから逃れます。振とう後、サンプルを8ミクロンメッシュのフィルタープレートにピペットで移します。次に、プレートを2,600gで5分間回転させて、ゲルフラグメントを濾します。次に、メッシュフィルタープレートをハウジングプレートから持ち上げ、ピペットを使用してゲルフリーのサンプルをプレートから新しい200マイクロリットルストリップチューブに移します。gDNAを含む各サンプルに、1マイクロリットルのプロテアーゼを加え、ピペットで上下に動かしてよく混合します。次に、サンプルを摂氏50度で15分間インキュベートします。その後、摂氏70度で15分間加熱活性化します。このヌクレオソームの枯渇ステップは重要です。次に、18ゲージの針を使用して、すべてのサンプルチューブのキャップに穴を開けます。次に、真空分離機を使用してgDNAサンプルを5マイクロリットルに、cDNAサンプルを10マイクロリットルに減らします。容量が目標を下回った場合は、必要に応じてヌクレアーゼフリーの水を追加します。gDNAおよびcDNA/RNAハイブリッドは、Gel-seqデバイスを使用して物理的に分離しました。ネガティブコントロールでは、界面におけるゲルの自己蛍光は認められません。DNAラダーは、低密度膜と高密度膜の間の界面に暗いバンドのみを示しており、小さな断片が低密度ゲルを通過できることを明らかにしています。500個のPC3細胞からの生物学的サンプルは、ゲノムDNAとcDNA/RNAハイブリッドの望ましい分離を示しています。低密度膜の上部にある暗いバンドはメガベーススケールのゲノムDNAであり、cDNA/RNAハイブリッドは低密度領域と高密度領域の界面に積み重なっています。100塩基対未満の小さなフラグメントは、逆転写中にプライマーオリゴヌクレオチドから生成されるオフターゲット生成物であり、予想されます。ライブラリは、500個のPC3細胞または750個のHeLa細胞から作成しました。Gel-seqから生成されたマッチドライブラリーからのフラグメント分布を、標準プロトコルで生成されたマッチアップしないサンプルと比較しました。ヌクレオチドフラグメントの分布は、どちらの方法でも同様でした。PC3細胞ライブラリーのシーケンシング結果を従来の方法と比較しました。ゲノムワイドなコピー数変異を比較しました。統計的には、2つの方法は同様の結果を得ました。このビデオを見れば、同じ開始サンプルからDNAとRNAの両方についてペアになった次世代シーケンシングライブラリを生成する方法について十分に理解できるはずです。低入力シーケンシング実験と同様に、クリーンな作業環境を維持することを忘れないことが不可欠です。滅菌チューブとクリーニンググローブには細心の注意を払う必要があります。これらの予防措置があっても、コンタミネーションが原因で実験が失敗することがあります。重要な点として、ポリアクリルアミドゲルの遍在性と安全性は、製造前駆体が危険な神経毒であることを忘れがちです。これらの試薬は常にドラフト内で作業し、こぼれたものはすぐに片付けてください。私たちは、研究者が自分の研究室で簡単に導入できるようにGel-seqを設計し、この技術の迅速な採用を促進することを願っています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

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