カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

この方法論の全体的な目標は、イニシエーターカスパーゼの活性化の最初のステップの1つを視覚化することです。このステップは誘導近接と呼ばれ、アポトーシス細胞死中にカスパーゼ分子が集まって活性二量体を形成するときに発生します。この方法は、特定のイニシエーターカスパーゼをいつ、どこで、どれだけ効率的に活性化できるかなど、カスパーゼ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、生細胞内のカスパーゼ活性化複合体の集合をリアルタイムで視覚化できることです。この生体分子蛍光相補法は、カスパーゼに注入されたチロキシンタンパク質Venusの断片を使用します。断片はそれ自体では蛍光を発しませんが、カスパーゼが誘導された接近を受けると、2つの金星の半分が一緒になり、光ります。

細胞をトランスフェクションするには、まず、滅菌チューブ内の750マイクロリットルの還元血清培地に12マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。混合物を室温で5分間インキュベートします。次に、トランスフェクションするウェルごとに1.5ミリリットルのステリルチューブに10ナノグラムのレポータープラスミドを加えます。

各カスパーゼBiFC血漿を各チューブに20ナノグラム加えます。各チューブを合計容量100マイクロリットルまで上げ、減らした血清培地を追加します。P200ピペットを使用して、100マイクロリットルのトランスフェクション試薬溶液をプラスミド混合物に滴下します。

プラスミドトランスフェクション試薬ミックスを室温で20分間インキュベートした後、ピペットまたは吸引を使用して細胞から培地を吸引します。次に、P1000ピペットを使用して、800マイクロリットルの無血清培地をウェルの側面に静かにピペットで下ろします。P200ピペットを使用して、200マイクロリットルのDNA脂質複合体を各ウェルに滴下します。

組織培養インキュベーターで37°Cの細胞を3時間インキュベートします。インキュベーション後、DNA脂質複合体を含む無血清培地を吸引するか、単層を破壊しないように注意しながらピペットで吸引します。予め温めた2ミリリットルの全増殖培地を各ウェルの側面に静かにピペットで移してから、テキストプロトコルに記載されているように細胞をインキュベートします。

データ取得に先立ち、テキストプロトコルに記載されているように、カスパーゼ活性化の誘導を行います。製造元の指示に従って顕微鏡の電源を入れ、取得ソフトウェアを起動します。60xまたは63xオイル対物レンズを選択し、対物レンズにオイルを一滴垂らします。

次に、正しいプレートホルダーを使用して培養皿を顕微鏡ステージに置きます。ヒーターをつけて、温度を摂氏37度に設定します。RFPレーザーまたはフィルターを使用してレポーターの蛍光に焦点を当てます。

VenusとRFPの両方について、レーザー出力を50%で、露光時間を100ミリ秒で開始点として入力し、実験に使用する最適な設定を決定します。ライブキャプチャをオンにして、結果の画像と両方のチャネルの表示されたヒストグラムを調べます。信号が少なく、画像がわかりにくい場合は、信号と画像が良好に見えるまで、レーザー出力や露光時間を段階的に増

次に、顕微鏡ソフトウェアでZスタックモジュールを選択するか開きます。セルが見えなくなるまで、フォーカスを一方向に調整します。これを上部の位置として選択します。

セルが再び見えなくなるまでフォーカスを反対方向に調整し、これを下部の位置として選択します。最適なステップサイズを選択し、取得を開始します。必要に応じて、表示ヒストグラムを調整して、蛍光シグナルの視覚的な外観を改善します。

最後に、3次元レンダリングソフトウェアを使用して3D画像を再構築します。二酸化炭素源が利用可能な場合は、プレートホルダーの上に二酸化炭素供給装置を置きます。二酸化炭素レベルを5%に設定し、ソフトウェア内から二酸化炭素コントローラーをオンにします。

トランスフェクションされた細胞のフィールドに移動します。カメラで取得され、RFPレーザーを使用してコンピューター画面に表示された細胞のライブ画像を視覚化します。次に、RFPレーザーのレーザー出力と露光時間の割合の設定を入力します。

次に、YFPレーザー光のレーザー出力と露光時間の割合の設定を入力します。プレートの各ウェルについて、レポーターを発現する1つ以上の細胞を含む多数の異なる位置を選択します。タイムラップの各フレーム間の時間間隔と、撮影するフレームの総数を入力します。

各位置を再確認し、必要に応じてフォーカスを修正および更新します。タイムラプスを開始し、データを保存します。最後に、テキストプロトコルで説明されているように、利用可能なイメージングソフトウェアを使用してデータを分析します。

ここに示されているのは、DNA損傷後のカスパーゼ-2 BiFCの例です。細胞は、トポイソメラーゼ1阻害剤:カンプトテシンで処理した。赤色蛍光タンパク質であるmCherryをレポーターとして使用して、細胞がBiFCプローブを発現し、細胞の総数を視覚化するのに役立つことを示しました。

金星の蛍光は緑色で示され、大きな点はカスパーゼ-2による近接性を表しています。カスパーゼ活性化複合体の細胞内局在を高解像度で可視化するために、単一細胞を3次元でイメージングすることができます。ここでは、Caspase-2の活性化を緑色で、核を赤色で示しています。

セルの直交スライスビューは、xy平面、yz平面、およびxz平面を並べて視覚化できる場所で示されています。この立体画像は、セルがy軸を中心に回転しているムービーに表示することもできます。カスパーゼBiFCの動態データを提供するために、タイムラプスイメージングを使用することができます。

この動画は、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブによる治療後のカスパーゼ-2の活性化を緑色で示しています。ミトコンドリアは赤で示されています。このビデオを見れば、カスパーゼBiFCを使用してカスパーゼ活性化複合体の集合をリアルタイムで追跡し、複合体が生成したサイズ、形状、局在を明確に決定する方法を十分に理解できるはずです。

このプロトコルは、カスパーゼBiFC実験の結果を収集するためのいくつかの顕微鏡ベースのアプローチを概説しています。しかし、これらのアプローチの多くのバリエーションおよび組み合わせを使用して、カスパーゼ活性化経路を創造的に調査できることに留意すべきである。この手順を試みる際には、光毒性や光退色などの顕微鏡によるアーチファクトからのコントロールを含めることを忘れないでください。付属のテキストプロトコルには、これを達成するためのヒントが含まれています。

どの取得および分析方法を使用するかは、調査する範囲と、装置およびイメージングソフトウェアの可用性によって決定されます。この手順に従って、イメージング解析アプローチを使用してデータを解釈できます。蛍光強度の経時変化や蛍光細胞の割合を測定できます。

焦点の数やオブジェクトのサイズも計算できます。