Name: カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶカスパーゼBiFC法による細胞死メカニズムの可視化。Venusタンパク質断片を用いて生細胞内でイニシエーターカスパーゼの活性化複合体をリアルタイムで観察し、アポトーシスの動態解析に応用する。

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この技術の開発に貢献した Bouchier ・ ヘイズ ラボのすべての前メンバーを確認したいと思います。この仕事の一部 LBH テキサス子供病院小児パイロット賞によって資金を供給されました。Joya チャンドラ (MD アンダーソン、ヒューストン、テキサス州) は、彼女のチームと共同で公開されているデータを含むようにアクセス許可を感謝いたします。記述されている試薬の開発は NIH (NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 傘下 S10RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の援助からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別コアによって支えられました。

1. 細胞や培養皿の準備
注: 組織培養層流フードの 1-3 の手順に従います。手袋を着用します。
<ol><li>ガラス底培養皿を使用している場合は、フィブロネクチンとガラスをコートします。プラスチック製の食器を使用して手順 1.2 を省略します。<ol>
<li>フィブロネクチンの 0.1 mg/mL の溶液を作る: 9 mL の 1x PBS で 1 mg/mL フィブロネクチン溶液 1 mL を希釈します。</li>
		<li>0.5-1 の各ウェルのガラス底をカバー フィブロネクチンの mL と室温で 1 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>ピペットを使用して、フィブロネクチン ソリューションを収集、4 ° C で保存 メモ: フィブロネクチン ソリューションを複数回使用できます。</li>
		<li>1-2 mL の 1x PBS、一度ガラスを洗浄し、PBS を離れて吸い出しなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(別大きさで分類された井戸に使用する細胞数の表 1参照) 適切な細胞の培養基の 2 mL で 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 x 10 の5セルをプレートします。安定 (ディスカッションを参照) カスパーゼ BiFC コンポーネントを表現する細胞ラインを使用している場合、2 x 10 の5セルをプレートし、治療手順 (手順 3) に進みます。</li>
	<li>組織文化のインキュベーターで 37 ° C で一晩シャーレに付着します。</li>
</ol>2. トランスフェクション細胞のカスパーゼ BiFC コンポーネントを紹介するには
<ol><li>適切なトランスフェクション試薬で細胞を transfect します。 注: このプロトコルは、最小限の毒性のために最適化された Lipofectamine 2000 の指示をについて説明します。このプロトコルは、LN18 細胞 MCF7 細胞、Hela 細胞で正常に使用されています。追加場合、トランスフェクション試薬は製造元の指示に従って、必要に応じて最適化します。<ol>
<li>生殖不能の管に低下した血清中メディアの 750 μ L にトランスフェクション試薬の 12 μ L を追加します。</li>
		<li>5 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>追加 10 ng 記者プラスミド (蛍光蛋白質、例えば赤い蛍光蛋白質 [RFP] transfected セルにラベル付けするプラスミド) のために導入するのにも、各滅菌 1.5 mL チューブに。</li>
		<li>20 追加各カスパーゼ BiFC プラスミドの ng (例えば、20 カスパーゼ-2 prodomain [C2 プロ] ng-VC と 20 ng C2 Pro (ヴァイオリン) の) 各管 (表 2) に。</li>
		<li>低下した血清中のメディアを追加することにより 100 μ L の総ボリュームまで各チューブをもたらします。</li>
		<li>P200 ピペットを使用して、追加のトランスフェクション試薬溶液 100 μ L ステップ 2.1.2 からプラスミドの混合物に滴状に。</li>
		<li>プラスミド トランスフェクション試薬ミックス室温で 20 分間、インキュベートします。</li>
		<li>メディアや吸引でピペットを使用してセルからの吸引し、井戸の横にそっと血清無料メディアの 800 μ L をピペット p1000 ピペットを使用しています。</li>
		<li>P200 ピペットを使用して、各ウェルに滴状 DNA 脂質複合体の 200 μ L を追加します。</li>
		<li>3 h の 37 ° C で培養孵卵器内のセルを孵化させなさい。</li>
		<li>ように注意して、単層を混乱させる、ピペットで吸引を使用して吸引により DNA 脂質複合体を含む血清無料メディアを削除します。</li>
		<li>各ウェルの側を軽く下に予め温めておいた (37 ° C) 完全な成長媒体の 2 mL のピペットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最適な蛋白質の表現のための 24-48 時間培養のインキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
</ol>3. カスパーゼ活性化の誘導
<ol><li>薬やカスパーゼ活性化約 24 h 後トランスフェクションを誘導する刺激を扱います。<ol>
<li>目的に薬物濃度予め加温 (37 ° C) イメージング メディア (Hepes [20 mM, pH 7.2 7.5] と 2-メルカプトエタノール [55 μ M] 補足の完全な成長媒体) とミックス優しくを追加 (表 3)。</li>
		<li>吸引や吸引でピペットを使用してセルからメディアと井戸の横にそっと 3.1.1 から溶液 2 mL ピペット ピペットを使用して、その後。</li>
		<li>未処理のコントロールと 1 つの井戸に薬物なしのイメージング メディアを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C で培養のインキュベーターで細胞をインキュベートかコマ撮り実験手順 4.3 に進みます。</li>
</ol>4.カスパーゼ BiFC データ集録
<ol><li>
単一の時間ポイント獲得のカスパーゼ BiFC
	<ol>
<li>顕微鏡と蛍光光源の製造元の指示に従ってを入れます。</li>
		<li>RFP フィルターとレポーター遺伝子蛍光焦点の下のセルを検索します。</li>
		<li>手集計カウンターを使用すると、視野の RFP 陽性の細胞のすべてをカウントします。数を記録します。</li>
		<li>同じ視野を維持しながら GFP フィルター (または YFP フィルター使用可能な場合) に切り替えるし、緑も赤血球の数を数える手集計カウンターを使用して、(金星陽性)。金星陽性赤血球のみが評価されることを確保するため 2 つのフィルターを切り替える前後。レコード番号 (図 3)。</li>
		<li>各プレートの 3 つの個々 の領域の少なくとも 100 の RFP 陽性細胞を数えます。</li>
		<li>各エリアで金星正トランスフェクション細胞 (すなわち緑も赤細胞) の割合を計算します。標準偏差を取得する結果の割合を平均します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カスパーゼ BiFC の 3次元イメージング
	<ol>
<li>製造元の指示に従って顕微鏡をオンにし、集録ソフトウェアを起動します。</li>
		<li>60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置</li>
		<li>正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。</li>
		<li>落射蛍光光源や顕微鏡アイピースや共焦点レーザーとコンピューターの画面のいずれかを使用して、目的のフィールドに移動します。</li>
		<li>RFP レーザやフィルターを使用してレポーター蛍光に焦点を当てます。</li>
		<li>落射蛍光は、この時点までに使用されている場合、共焦点レーザー光源を切り替えるし、カメラによって獲得されたと集録ソフトウェア コンピューターの画面上で表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。</li>
		<li>ジョイスティック コントロールとフォーカス ホイールを使用して、微調整やセルの位置、フォーカス、ファインダーの中央にあるセル。お互いから分離され、重複していないセルを選択します。</li>
		<li>実験用に最適な設定を決定するための出発点として、金星の RFP 割合のレーザー出力の 50%、100 ms で露光時間を入力します。</li>
		<li>ライブ キャプチャおよび検査結果の画像と両方のチャネルの付属表示ヒストグラム。</li>
		<li>信号が少なく、イメージ作るは難しいが場合、は、画像の信号までの増減割合レーザー力および/または露出時間が長くなるよさそうです。</li>
		<li>信号が飽和しないを確認します。顕著なピークは、各蛍光表示されるかどうかを確認する表示ヒストグラムを検査します。ピークを包含する全体のヒストグラム表示場合、は、低いレーザー力と露出設定 (図 2) を入力します。</li>
		<li>信号の特定を確実に同じ条件の下で制御 (未処理または非導入) の細胞を可視化します。 注: 単色形質転換細胞は、クロス オーバーの制御にも使用できますが、信号が空間的に異なる (例えば細胞質とミトコンドリア) 場合これは必要ではありません。</li>
		<li>選択または顕微鏡のソフトウェアで Z スタック モジュールを開きます。</li>
		<li>フォーカスつまみを使用して、セルの中心に対応する焦点の位置を近似します。</li>
		<li>セルが表示されなくなるまで、1 つの方向でピントを調整、トップの位置とこれを選択します。</li>
		<li>セルが再び表示されなくなるまで反対方向にフォーカスを調整し、下の位置としてこれを選択します。</li>
		<li>最適ステップ サイズ (通常約 20 μ m) を選択し、自動的に上部と下部の位置の間 20 μ m の手順のそれぞれで各チャンネルで 1 つの画像を取るためにカメラを指示する集録を開始します。</li>
		<li>(図 4、映画 1) 3 D のイメージを再構築するのに 3 D レンダリング ソフトウェアを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カスパーゼ BiFC のタイムラプス イメージング
	<ol>
<li>実験する前に少なくとも 1 時間は顕微鏡をオンにし、37 ° C に温度を設定</li>
		<li>40 x、60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置します。</li>
		<li>正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。</li>
		<li>CO2発生源が利用できる場合は、プレート ホルダー上に CO2配信デバイス (通常提供する CO2管に接続されているプレキシ ガラス蓋) を置きます。CO2レベルを 5% に設定し、ソフトウェア内から CO2のコント ローラーをオンにします。CO2発生源が利用できない場合 20 mM Hepes にメディアをバッファーが含まれます。</li>
		<li>Transfected セルのフィールドに移動し、カメラによって獲得されたと RFP レーザーを使用して、コンピューター画面上の獲得ソフトウェアによって表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。</li>
		<li>次の手順 4.2.8-4.2.12 RFP レーザーのレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力します。蛍光信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。</li>
		<li>肯定的な制御を使用してサンプル (例については表 3を参照) で、以下 YFP レーザ光のレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力する手順 4.2.8-4.2.12。金星信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。</li>
		<li>プレートの各ウェル、記者を表現する 1 つまたは複数のセルを含む別の位置の数を選択します。</li>
		<li>取られるフレームの時間経過および合計数の各フレーム間の時間間隔を入力します。次のフレームが行われる前にすべての選択した位置を取得する時間があることを確認します。</li>
		<li>各位置に再アクセスして、修正し、必要に応じてフォーカスを更新します。</li>
		<li>外部振動や温度の変化に起因する焦点のドリフトを修正するにフォーカス ドリフト補正システム (ある場合) をオンに。</li>
		<li>コマ撮りを開始し、データを保存します。</li>
		<li>(図 5、映画 2) 利用のイメージング ソフトウェアを使用してデータを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li>
<li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li>
<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+model+for+apical+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li>
<li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+domains+of+death%3A+evolution+of+the+apoptosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li>
<li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation%3A+the+induced-proximity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li>
<li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apoptosome%3A+signalling+platform+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIDDosome%2C+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li>
<li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813(2015).</li>
<li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+road+map+for+those+who+don%27t+know+JAK-STAT%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li>
<li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953(2016).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li>
<li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li>
<li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade%3A+hierarchical+activation+of+caspases-2%2C+-3%2C+-6%2C+-7%2C+-8%2C+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

このプロトコルでは、カスパーゼによる近接を測定する蛍光タンパク質を分割の使用について説明します。それは非常に明るく、非常にあると、巻き戻しである高速13分割金星この方法を選ばれました。したがって、カスパーゼ タンパク質相互作用ダイナミクスの実時間推定に近い金星カスパーゼによる近接時に巻き戻しの分析を提供できます。金星は金星 (ヴィーナス N または VN) から成るアミノ酸 1 173 の N 末端、2 少し重複フラグメントに分割され C 末端フラグメント (金星 C または VC) から成る残留 155-239。その他の分割の蛍光タンパク質が存在するが、分割 mCherry など、いくつかは 2 h まで巻き戻し21の 4 ° C で培養を必要とします。追加の分割蛍光タンパク質セルリアン (シアンの蛍光タンパク質のバージョン) を分割を含むと遠赤の分割 mLumin がまだこのコンテキスト13,22でテストされます。最終的に...

カスパーゼのプロテアーゼ家族はアポトーシスと免疫1における重要な役割を知られています。重要性のため決定するとき、どこで、どのように効率的に特定のカスパーゼを活性活性化経路カスパーゼのメカニズムに重要な洞察力を提供することができます。ここで説明したイメージング ベースのプロトコルは、カスパーゼ活性化カスケードの最も早いステップの可視化を実現。 にします。この手法は動的蛋白質: 蛋白質の相互作用のドライブのカスパーゼ活性化で活用します。
カスパーゼは、2 つのグループに分けることができます: イニシエーター ・ カスパーゼ (カスパーゼ-1、-2、-4、-5、-8,-9,-10-12) と死刑執行カスパーゼ (カスパーゼ-3、-6、-7)。死刑執行カスパーゼは、前もって形成された二量体として細胞内に存在、大小サブユニット2間の乖離によってアクティブ化されます。アクティブになったとき、彼らはアポトーシス3の結果を多くの構造および調節蛋白質を切断します。イニシエーター ・ カスパーゼは最初カスパーゼ経路でアクティブにし、一般に死刑執行カスパーゼの活性化を誘発します。死刑執行のカスパーゼとは対照的イニシエーター ・ カスパーゼは二量体化4,5によってアクティブ化されます。この二量体は、活性化のプラットフォームとして知られている特定の大きな分子量複合体に非アクティブなモノマーの採用によって促進されます。活性化プラットフォームのアセンブリは、特定の蛋白質: 蛋白質の相互作用のシリーズによって支配されます。これらは、保存されている蛋白質相互作用モチーフ proform イニシエーター ・ カスパーゼの存在によって仲介される、死ドメイン (DD)、死のエフェクター ドメイン (DED) およびカスパーゼ募集ドメイン (カード) 6 (図 1 a)。活性化のプラットフォームは、受容体タンパク質とアダプター蛋白質に通常含まれます。受容体は、リガンドの結合するにより、多数の分子の重合における立体構造変化を誘発する有効になります。受容体、どちらかを募集するカスパーゼ直接または順番に、カスパーゼをもたらす複雑なアダプター分子。したがって、多数のカスパーゼ分子二量体化を許可する近接になります。これは誘導近接モデル7として知られています。二量化、一度、カスパーゼ活性酵素4,8を安定させるのに役立つ自動処理を受けます。たとえば、Apaf1 アポトソームのアセンブリは、シトクロム c がミトコンドリアの外膜透過 (MOMP) と呼ばれるプロセス内のミトコンドリアからのリリースで、以下によってトリガーされます。Apaf1 は、順番カードの両方のタンパク質9の存在によって媒介される相互作用を介してカスパーゼ 9 を募集します。同じような蛋白質の相互作用は、CD95 死の複雑なシグナルを誘導する (ディスク); カスパーゼ 8 の活性化につながるアセンブリカスパーゼ-2; をアクティブにすることができます PIDDosome様々 なインフラマソーム錯体カスパーゼ 1 の活性化10、11,12を開始します。したがって、イニシエーター ・ カスパーゼは、誘起近接と二量体化、活性化は発生しませんなしに共通のメカニズムによって特定の活発化のプラットフォームに募集しています。
カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) はまずこのイニシエーター カスパーゼの活性化を測定するために開発されたイメージング ベースのアッセイ カスパーゼによる近接活性化プラットフォームを次の直接可視化が可能アセンブリ。このメソッドは、分割蛍光タンパク質金星の性質を活用します。金星は明るく、2 つの非蛍光性と少し重複フラグメントに分割でき、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) のより多くのあるバージョン: ヴィーナス (金星 N または VN) と金星 (ヴィーナス C または VC) の C 末端の N 末端。これらのフラグメントは、フォールディングし、近接13時に蛍光になる能力を保持します。金星の各フラグメントは、カスパーゼ活性化プラットフォームへのバインドの最小の部分であるカスパーゼの prodomain に融合されます。これにより、カスパーゼ酵素活性は保持されません、したがって内因性イベントに関連付けられているダウン ストリーム イベントの同時分析が可能です。金星の断片フォールディング カスパーゼ prodomains 活性化プラットフォームを採用し、誘起近接を受けるとき。(図 1 b)。金星の生じる蛍光性は、正確かつ具体的に細胞レベル下のローカリゼーション、速度、および単一細胞におけるイニシエーター カスパーゼ活性化プラットフォームのアセンブリの効率を監視する使用できます。標準蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で得ることができる画像データとを含む各種の顕微鏡のアプローチの数を合わせることができる: リアルタイムでカスパーゼ活性化を追跡するタイムラプス イメージング細胞レベル下のローカリゼーションの正確な決定のための高分解能イメージング終点の活性化効率の定量化。
この手法は、カスパーゼ 214の活性化を調査する最初に開発されました。2 カスパーゼの活性化のプラットフォームは、PIDDosome と考えられている中から成る PIDD (死ドメインと p53 誘導された蛋白質) 受容体とアダプター RAIDD (RIP 関連する ICH-1/CAD-3 死ドメインの相同タンパク質)、PIDDosome 独立 caspase-2 活性化が報告されています。カスパーゼ 2 追加のアクティブ化プラットフォームに15、16が存在することが示唆されました。カスパーゼの活性化プラットフォームの完全なコンポーネントを知らず、にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法はカスパーゼ 2 シグナル伝達経路の分子レベル14,17の成功の尋問のため許可されています。我々 はまた、正常に炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、-12) この議定書を適応している18と、原則として、同じアプローチは、同様に残りのイニシエーター ・ カスパーゼのそれぞれを分析するのに十分なはず。このプロトコルは、合わせることができる同様に二量体化が主要な活性化信号が他の経路を調査します。例えば、Janus のキナーゼ (JAK) 19によってリン酸化、次二量体化 STAT 蛋白質が活性化します。したがって、STAT の活性化だけでなく、動的蛋白質の相互作用によって調整される他の多くの経路を視覚化する BiFC システムを使用可能性があります。次のプロトコルは、画像集録および解析のためのセルに記者の導入のための手順や方法論を提供します。

<table><tbody><tr><td>6ウェル コーティングされていない No. 1.5 20 mm ガラス底皿</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿フィブロネクチン精製タンパク質</td><td>ミリポア</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>シグマ</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>31985088</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VCプラスミド</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VNプラスミド</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>LBHから要請により入手可能な</td><td>炎症性カスパーゼBiFCプラスミド</td><td></td><td></td> LBH</tr><tr><td>HeLa細胞から入手可能 安定的に発現するC2-Pro BiFC成分</td><td></td><td></td><td>LBH</td></tr><tr><td>DsRed水戸プラスミド</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>蛍光レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen 15630106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2、Mercaptoethanol、1000X</td>、<td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>、q-VD-OPH</td>、<td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table> にあります

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

カスパーゼのプロテアーゼ族は、アポトーシスと自然免疫で重要な役割を再生します。これらのうち、イニシエーター ・ カスパーゼと呼ばれるサブグループこれらの経路でアクティブにする最初のです。このグループ含まれてカスパーゼ-2,-8,-9 と炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、-4 と-5。イニシエーター ・ カスパーゼはすべて活性化プラットフォームと呼ばれる特定の多蛋白質複合体への募集、次二量体化によって活性化します。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) は、カスパーゼはイニシエーター カスパーゼの活性化プラットフォームや結果に募集を視覚化に使用されるイニシエーターに溶ける蛍光蛋白質を分割イメージング ベースのアプローチ誘導近接。この蛍光は、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化のために必要な初期手順の 1 つの読み出しを提供します。異なる顕微鏡ベースのアプローチの数を使用して、このテクニックがカスパーゼ活性化のサイズとカスパーゼ活性化の数の速度と同様に、人口レベルでカスパーゼ活性化の効率の定量的データを提供できます。セルごとに複合体。

カスパーゼ 2 BiFC による DNA 損傷の例は図 3に示します。カンプトテシン、トポイソメラーゼ私阻害剤は DNA の損傷・ カスパーゼ-2 の活性化を誘導するために使用されました。BiFC プローブを細胞に表現をし、セルの合計数を視覚化するために、赤の蛍光タンパク質 mCherry は記者として使用されました。金星蛍光グリーンでは、大涙点を表すカスパーゼ 2 近接を誘発します。金星-陽性細胞の割合を決定するため、これらの細胞を数えることができます。細胞内局在についての結論は、このようなイメージからも可能です。例で示すように、細胞質17のように核小体もカスパーゼ 2 誘導近接が検出されました。カスパーゼ活性化複合体の細胞内分布の高解像度の可視化を提供するために単一セルの 3 次元でイメージを作成できます。図 4は、このような 3 D 画像を表現する 2 つの方法を示しています。最初はセルの 3 D 再...

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

この方法論の全体的な目標は、イニシエーターカスパーゼの活性化の最初のステップの1つを視覚化することです。このステップは誘導近接と呼ばれ、アポトーシス細胞死中にカスパーゼ分子が集まって活性二量体を形成するときに発生します。この方法は、特定のイニシエーターカスパーゼをいつ、どこで、どれだけ効率的に活性化できるかなど、カスパーゼ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生細胞内のカスパーゼ活性化複合体の集合をリアルタイムで視覚化できることです。この生体分子蛍光相補法は、カスパーゼに注入されたチロキシンタンパク質Venusの断片を使用します。断片はそれ自体では蛍光を発しませんが、カスパーゼが誘導された接近を受けると、2つの金星の半分が一緒になり、光ります。細胞をトランスフェクションするには、まず、滅菌チューブ内の750マイクロリットルの還元血清培地に12マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。混合物を室温で5分間インキュベートします。次に、トランスフェクションするウェルごとに1.5ミリリットルのステリルチューブに10ナノグラムのレポータープラスミドを加えます。各カスパーゼBiFC血漿を各チューブに20ナノグラム加えます。各チューブを合計容量100マイクロリットルまで上げ、減らした血清培地を追加します。P200ピペットを使用して、100マイクロリットルのトランスフェクション試薬溶液をプラスミド混合物に滴下します。プラスミドトランスフェクション試薬ミックスを室温で20分間インキュベートした後、ピペットまたは吸引を使用して細胞から培地を吸引します。次に、P1000ピペットを使用して、800マイクロリットルの無血清培地をウェルの側面に静かにピペットで下ろします。P200ピペットを使用して、200マイクロリットルのDNA脂質複合体を各ウェルに滴下します。組織培養インキュベーターで37°Cの細胞を3時間インキュベートします。インキュベーション後、DNA脂質複合体を含む無血清培地を吸引するか、単層を破壊しないように注意しながらピペットで吸引します。予め温めた2ミリリットルの全増殖培地を各ウェルの側面に静かにピペットで移してから、テキストプロトコルに記載されているように細胞をインキュベートします。データ取得に先立ち、テキストプロトコルに記載されているように、カスパーゼ活性化の誘導を行います。製造元の指示に従って顕微鏡の電源を入れ、取得ソフトウェアを起動します。60xまたは63xオイル対物レンズを選択し、対物レンズにオイルを一滴垂らします。次に、正しいプレートホルダーを使用して培養皿を顕微鏡ステージに置きます。ヒーターをつけて、温度を摂氏37度に設定します。RFPレーザーまたはフィルターを使用してレポーターの蛍光に焦点を当てます。VenusとRFPの両方について、レーザー出力を50%で、露光時間を100ミリ秒で開始点として入力し、実験に使用する最適な設定を決定します。ライブキャプチャをオンにして、結果の画像と両方のチャネルの表示されたヒストグラムを調べます。信号が少なく、画像がわかりにくい場合は、信号と画像が良好に見えるまで、レーザー出力や露光時間を段階的に増やします。次に、顕微鏡ソフトウェアでZスタックモジュールを選択するか開きます。セルが見えなくなるまで、フォーカスを一方向に調整します。これを上部の位置として選択します。セルが再び見えなくなるまでフォーカスを反対方向に調整し、これを下部の位置として選択します。最適なステップサイズを選択し、取得を開始します。必要に応じて、表示ヒストグラムを調整して、蛍光シグナルの視覚的な外観を改善します。最後に、3次元レンダリングソフトウェアを使用して3D画像を再構築します。二酸化炭素源が利用可能な場合は、プレートホルダーの上に二酸化炭素供給装置を置きます。二酸化炭素レベルを5%に設定し、ソフトウェア内から二酸化炭素コントローラーをオンにします。トランスフェクションされた細胞のフィールドに移動します。カメラで取得され、RFPレーザーを使用してコンピューター画面に表示された細胞のライブ画像を視覚化します。次に、RFPレーザーのレーザー出力と露光時間の割合の設定を入力します。次に、YFPレーザー光のレーザー出力と露光時間の割合の設定を入力します。プレートの各ウェルについて、レポーターを発現する1つ以上の細胞を含む多数の異なる位置を選択します。タイムラップの各フレーム間の時間間隔と、撮影するフレームの総数を入力します。各位置を再確認し、必要に応じてフォーカスを修正および更新します。タイムラプスを開始し、データを保存します。最後に、テキストプロトコルで説明されているように、利用可能なイメージングソフトウェアを使用してデータを分析します。ここに示されているのは、DNA損傷後のカスパーゼ-2 BiFCの例です。細胞は、トポイソメラーゼ1阻害剤:カンプトテシンで処理した。赤色蛍光タンパク質であるmCherryをレポーターとして使用して、細胞がBiFCプローブを発現し、細胞の総数を視覚化するのに役立つことを示しました。金星の蛍光は緑色で示され、大きな点はカスパーゼ-2による近接性を表しています。カスパーゼ活性化複合体の細胞内局在を高解像度で可視化するために、単一細胞を3次元でイメージングすることができます。ここでは、Caspase-2の活性化を緑色で、核を赤色で示しています。セルの直交スライスビューは、xy平面、yz平面、およびxz平面を並べて視覚化できる場所で示されています。この立体画像は、セルがy軸を中心に回転しているムービーに表示することもできます。カスパーゼBiFCの動態データを提供するために、タイムラプスイメージングを使用することができます。この動画は、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブによる治療後のカスパーゼ-2の活性化を緑色で示しています。ミトコンドリアは赤で示されています。このビデオを見れば、カスパーゼBiFCを使用してカスパーゼ活性化複合体の集合をリアルタイムで追跡し、複合体が生成したサイズ、形状、局在を明確に決定する方法を十分に理解できるはずです。このプロトコルは、カスパーゼBiFC実験の結果を収集するためのいくつかの顕微鏡ベースのアプローチを概説しています。しかし、これらのアプローチの多くのバリエーションおよび組み合わせを使用して、カスパーゼ活性化経路を創造的に調査できることに留意すべきである。この手順を試みる際には、光毒性や光退色などの顕微鏡によるアーチファクトからのコントロールを含めることを忘れないでください。付属のテキストプロトコルには、これを達成するためのヒントが含まれています。どの取得および分析方法を使用するかは、調査する範囲と、装置およびイメージングソフトウェアの可用性によって決定されます。この手順に従って、イメージング解析アプローチを使用してデータを解釈できます。蛍光強度の経時変化や蛍光細胞の割合を測定できます。焦点の数やオブジェクトのサイズも計算できます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。...

二分子蛍光相補

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

このビデオは、二分子蛍光相補レポータータンパク質を使用して、ヒトマクロファージのカスパーゼタンパク質の活性化を示しています。カスパーゼ-1のプロドメインは、Venusタンパク質の非蛍光フラグメントと融合しており、Venusタンパク質はインフラマソーム複合体に動員されます。インフラマソームの近接性は、Venusフラグメントのリフォールディングと蛍光を誘導し、マクロファージにおけるカスパーゼの活性化を確認します。...

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。...

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。...

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

小分子基質であるルシフェリンを酸化するルシフェラーゼ酵素によって放出される生物発光光は、光感覚タンパク質を活性化するために利用することができ、それによって光刺激に別の次元を加え、時間的および空間的スケールにわたって細胞内の多数の光媒介機能の操作を可能にする。...

生物発光光遺伝学2.0:生体内および生体内で光感覚タンパク質を活性化するための生物発光の利用

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。...

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

学ぶカスパーゼBiFC法による細胞死メカニズムの可視化。Venusタンパク質断片を用いて生細胞内でイニシエーターカスパーゼの活性化複合体をリアルタイムで観察し、アポトーシスの動態解析に応用する。

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

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