March 28th, 2018
(3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。
この手順の全体的な目標は、その後の2つのPCRで転写産物特異的なネストプライマーを使用し、精製されたPCR産物をシーケンシングすることにより、3プライム末端からタンパク質コード領域内の領域までのmRNA転写産物の配列を決定することです。この方法は、ポリアデニル化シグナル、終止コドン、転写産物の3プライム非翻訳領域の配列の決定など、遺伝分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、オープンリーディングフレームの小さな領域の配列が、腫瘍特異的な融合遺伝子およびスプライス変異体を検出できるため、この技術の意味するところが癌診断にまで及ぶ場合、任意の転写産物に適用できることである。
この手法のアイデアを最初に思いついたのは、これまで特徴付けられていなかった、3つのプライミングされた未翻訳領域を持つ新規転写産物を特定したときでした。プロトコールを開始するには、フェノールとグアニジンのイソチオシアネート細胞混合物を氷上で解凍します。解凍したら、PCRフード内の微量遠心チューブに100マイクロリットルのクロロホルムを加えます。
混合物がピンク色で不透明になるまで、サンプルを10〜15秒間ボルテックスします。次に、サンプルを氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを20、800g、摂氏4度で15分間遠心分離します。
上部の無色水相を慎重に取り出し、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、沈殿に移り、等量のイソプロパノールをサンプルに加えます。1マイクロリットルの共沈剤をサンプルに加えて、RNAのキャリアとして機能し、後続のステップでRNAを視覚化するのに役立ちます。
サンプルを摂氏80度で少なくとも4時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを冷却した遠心分離機に移し、20、800g、摂氏4度で35分間回転させます。スピン後、RNAはチューブの底に青い斑点として現れます。
サンプルからイソプロパノールを慎重に取り除きます。500マイクロリットルの80%エタノールを加え、3秒間短時間ボルテックスしてペレットを再懸濁します。サンプルを再度遠心分離します。
サンプルからすべてのエタノールを取り除き、サンプルを約10分間風乾させます。サンプルが乾いたら、35マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。次に、サンプルをヒートブロックに置きます。
摂氏65度に5分間設定して、RNAが完全に溶液中にあることを確認します。加熱後、すぐにチューブを氷の上に置きます。最終反応量が50マイクロリットルの場合、水を加えた全RNAを4マイクログラム、総量22マイクロリットルを新しいチューブに加えます。
10マイクロモルプライマー溶液から2マイクロリットルのOligo dT 25プライマーを添加します。逆転写キットから、RNase阻害剤を2マイクロリットル、5x反応バッファーを8マイクロリットル、10ミリモルdNTPを4マイクロリットル、逆転写酵素を2マイクロリットル追加します。逆転写酵素を使わずに反応を起こし、ネガティブコントロールとして作用させます。
チューブを摂氏42度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを直接氷に移してから、加熱ブロックに輸送します。次に、チューブを摂氏75度で5分間加熱します。
75°Cに加熱した後、チューブを氷の上に置きます。2マイクロリットルのcDNAを新鮮な0.5ミリリットルのPCRチューブに移します。10ミリモルプライマー溶液からフォワードプライマー1マイクロリットルとリバースプライマー1マイクロリットルを追加します。
8.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、12.5マイクロリットルの2x PCRをゲルマスターミックスに加えることで、最大12.5マイクロリットルを作ります。次に、画面にリストされているPCRサーマルサイクリング条件を入力し、PCRを実行します。PCR後、エチジウムブロマイドで染色した1%アガロースゲルを調製します。
1グラムのアガロースを100ミリリットルのトリアセテートまたはTAEバッファーに250ミリリットルのフラスコに溶解します。中身を電子レンジで茹でます。ゲルを1分間冷まし、ヒュームフードに7.5マイクロリットルの臭化エチジウム溶液を加えます。
フラスコを回してよく混ぜます。内容物を水平ゲル装置に注ぎ、ヒュームフード内でゲルを室温で少なくとも30分間固化させます。ゲルを1x TAEバッファーで覆い、10マイクロリットルのPCR産物を3〜5マイクロリットルのDNA分子量ラダーとともにアガロースゲルにロードします。
ゲルを175ボルトで10分間泳がせます。最初のPCRでは、1マイクロリットルのcDNAをPCRチューブに移し、5マイクロリットルの10x Pfu反応バッファーを追加します。10ミリモル溶液から、最初のネスティングフォワードプライマーを1マイクロリットル、T7 Oligo dT 25プライマーを1マイクロリットル、dNTPを1マイクロリットル追加します。
40マイクロリットルの水を追加することで、最大49マイクロリットルの総容量を作ります。1マイクロリットルのPfu DNAポリメラーゼを加え、よく混ぜます。次に、PCRを実行します。
次に、2枚目のPCRを調製します。最初のPCRから2マイクロリットルの製品を新しいPCRチューブに移し、5マイクロリットルの10x Pfu ultra two reactionバッファーと混合します。2番目のネスティングPCRプライマーを1マイクロリットル、T7プライマーを1マイクロリットル、およびdNTPを1マイクロリットル追加します。
39マイクロリットルの水を追加し、1マイクロリットルのPfu DNAポリメラーゼを追加することで、最大49マイクロリットルの総反応量を作成します。最初のPCRセットアップと同じPCRプロファイルを使用してPCRを実行します。あるいは、Pfu DNAポリメラーゼを使用する代わりに、キメラDNAポリメラーゼを2つの異なるPCRに使用することができます。
2番目のPCR産物を5〜10マイクロリットル取り、アガロースゲルで実行します。最後に、結果をイメージャーで視覚化します。このアガロースゲルは、同じフォワードプライマーを使用するが異なるリバースプライマーを使用する2つの異なるPCR産物と、異なるフォワードプライマーとリバースプライマーを持つ異なるPCR産物を示しています。
PCRベースの反応に使用する理想的なプライマーは、1つの異なるPCR産物を与えるプライマーです。Pfu DNAポリメラーゼとキメラDNAポリメラーゼを用いた2回目のPCR反応で得られた産物は、3プライムRACEのPCRサイクリング条件が異なるにもかかわらず、同じサイズのPCR産物を産生しました。逆転写酵素陰性コントロールでは、cDNA合成に使用されたRNAおよびその後の下流反応で使用されたRNAのゲノム汚染は示されませんでした。
ゲル精製されたPCR産物をシーケンシングのために送付しました。シーケンスクロマトグラムから得られた代表的なサンガー配列により、3プライムRACE産物の終止コドンの位置、推定されるポリアデニル化シグナル、その部位、およびポリAテールが同定されました。この手順を試みるときは、常に保護具と手袋を着用することを忘れないでください。
さらに、試薬チューブやその他の使い捨て品には、滅菌済みのDNaseとRNaseを使用してください。フェノールやクロロホルムの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。また、試薬をフード内で使用したり、指定された廃棄物容器に材料を捨てたりするなどの予防措置を必ず講じる必要があります。
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この記事では、がん細胞株からmRNA配列をマッピングするために異なるDNAポリメラーゼを利用する2つの異なる3' RACEプロトコルについて説明しています。焦点は、転写物のオープンリーディングフレーム、ストップコドン、3' UTRの特定にあります。
Mapping transcript architecture from the 3' end into coding regions enables precise characterization of mRNA isoforms, a critical step in target validation for oncology drug discovery. By identifying tumor-specific fusion genes and splice variants, this method supports mechanistic de-risking and improves predictive confidence in early-stage target selection. The approach enhances translational continuity by linking molecular findings to functional transcript stability elements such as miRNA binding sites and AU-rich regions.
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly when transcript integrity influences target druggability or biomarker potential.