Name: 適応 3 CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ 3' RACE法によるがん細胞株のmRNA配列決定法。ネスト型プライマーとPCRを用いて、オープンリーディングフレーム、終止コドン、3' UTRを同定し、腫瘍特異的融合遺伝子やスプライスバリアントを検出する。

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彼女の技術的なヘルプ Bettine ギブスを認識したいと思います。

このプロトコルのすべてのプロシージャの実行中は常に白衣、手袋と安全メガネを着用します。フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬容器/チューブが認定フードで指定されたコンテナー内のフェノール廃棄物処分のみ開かれているを確認します。DNAse、RNAse フリーの生殖不能の管、ヒント、および試薬を使用します。
1. 細胞培養
<ol><li>HeLa 細胞ラインと 2 懸濁液マントル細胞リンパ腫細胞株、グランタ 519 と Jeko-1、10% を含む DMEM を成長 FBS と 37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで 100 の U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンセル 1:10 を希釈し、粒子カウンター14を使用してをカウントします。</li>
	<li>RNA の抽出、細胞/ウェル 6 ウェル プレート (ウェルあたり 2 mL メディア) の 500,000 をプレートします。24 時間培養した後、細胞から RNA を収集します。</li>
</ol>2. RNA の抽出
<ol><li>セルを収穫 注: 遠心分離のステップを除いて、無菌性を維持するティッシュ文化フードの記載されたすべての手順を実行します。<ol>
<li>浮遊細胞 (Jeko 1 およびグランタ 519): の場合<ol>
<li>15 mL チューブに (一緒に 2 mL の培地) セルを転送し、1,725 x g で 5 分間吸引メディアで遠心管の底で細胞ペレットを残します。</li>
			<li>リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 1 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。500 μ L の単相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬を 1.5 mL 遠心チューブ内の各サンプルに追加します。よく混ぜ、5 分間室温 (RT) で遠心チューブを反転しながら 1 分毎のまま。</li>
		</ol>
</li>
		<li>付着性のセル (hela 細胞)。<ol>
<li>各ウェルからの細胞培養媒体を吸い出しなさい。破片を洗浄する各ウェルに 1 mL の PBS を追加します。</li>
			<li>PBS を削除し、相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の試薬の 500 μ L を各ウェルに追加します。</li>
			<li>RT で穏やかな揺動で 5 分間インキュベートします。1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>セル換散<ol>
<li>フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合 1 時間-20 ° c の凍結します。 注:-20 ° c 夜間、または必要になるまでは、ミックスが残すことができます。</li>
		<li>フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合氷の上を解凍します。PCR フード遠心チューブに 100 μ L のクロロホルムを追加します。渦混合物まで 10-15 秒のサンプルは不透明なピンクです。15 分間 (4 ° C) で氷のサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>20,800 x g と 4 ° C で 15 分間のサンプルを遠心分離します。上部の無色の水相を慎重に取り外します (〜 200 μ L) と新しい 1.5 mL 遠心チューブに移転。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA の沈殿物<ol>
<li>各サンプルに等量のイソプロパノールを追加します。クロムの 1 μ L を追加 (材料表を参照) を各サンプルの RNA のためのキャリアとして機能して、以降の手順で RNA の視覚化に役立ちます。少なくとも 4 時間-80 ° C でサンプルをインキュベートします。-80 ° C で一晩インキュベート最高の結果を得るには、</li>
		<li>サンプルを冷却遠心機に転送します。20,800 x g で 35 分間遠心分離機/4 ° C;RNA は、管の底に青い斑点として表示されます。サンプルからイソプロパノールを慎重に取り外します。80% エタノール 500 μ L を追加し、簡潔に 3 のボルテックスでペレットを再懸濁します s。</li>
		<li>5 分間遠心する RT で 20,800 x g でサンプルは、すべてのエタノールをサンプルから削除します。みましょうサンプルは、約 10 分は、RNAse フリー水の 35 μ L のサンプルを再懸濁しますのために空気乾燥します。熱ブロック (65 ° C) RNA で完全にソリューションであることを確認する 5 分間に、すぐに氷のチューブを置きます。</li>
		<li>前述したように、代わりに 1 μ L151.5 μ L の RNA のサンプルを使用して除いて分光光度計を使用して総 RNA の濃度を決定します。必要に応じて、RNA の整合性を判断 1% の agarose のゲルの総 RNA の 1 μ g を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase 処理
<ol><li>RNA の定量化後、ゲノム DNA を低下させる総 RNA の DNAse 処理を実行します。各サンプルは、RNAse フリーの DNAse キットを 20 μ L の全反応別の微量遠心チューブにミックスを作るから次の試薬を追加します。<ol>
<li>ミックス 2 μ L の 10 DNase 反応バッファー X 総 RNA の 4.4 μ g と。水 14 μ L の合計をもたらします。</li>
		<li>RNase フリーの DNAse の 2 μ L を追加します。37 ° c (逆転写キット) から RNase 阻害剤の 2 μ L の存在下で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>DNAse 酵素を不活化する 70 の ° C で 10 分間の熱ブロックの停止ソリューションと熱の 2 μ L を追加します。 注: DNAse 処理はオプションです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cDNA 合成
50 μ l 反応ボリューム。
<ol><li>50 μ L 反応量: DNase の転送 22 μ L 新しいチューブ、または新しい管へ 22 μ L の総ボリュームに追加された水の総 RNA の転送 4 μ g に RNA を扱われます。10 μ M プライマー溶液から 2 μ L の T7 オリゴ dT25プライマーを追加します。T7 オリゴ dT25プライマー シーケンスは 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。</li>
	<li>逆転写キットから RNase 阻害剤 (20 U/μ L) の 2 μ L、8 μ L の反応液の 5 倍、10 mM の dNTPs の 4 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 2 μ L を追加します。 注: は、ネガティブ コントロールとして機能する逆転写酵素のない反応を設定します。</li>
	<li>1 h. 氷に直接転送の 42 ° C で孵化させなさい。5 分 75 ° C でチューブを加熱し、氷の上管を配置します。</li>
</ol>5. プライマー融合遺伝子転写産物の検索
<ol><li>
プライマー デザイン
	<ol>
<li>アンサンブルのゲノムのブラウザー (ENST00000360839.6/NM_017747) から cDNA シーケンスをダウンロードし、ターゲットのトラン スクリプト (ANKHD1) 上流停止コドンの ORF 内の領域を識別します。プライマー デザイン ソフトウェアのシーケンスのエントリ領域に終止コドンの上流シーケンスを含んでいる全体の地域 (最大 700 ヌクレオチド) のコピペ (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>)。</li>
		<li>ショー カスタム デザイン オプションを選択し、プライマーの数の 10 を選択 (返される結果) をシステムが生成するすべての他のパラメーターはデフォルトに設定しています。</li>
		<li>5 前方プライマーと重複しない 2 つの逆プライマーを選択します。プライマーを注文し、10 μ M の最終的な集中に RNAse/DNAse 自由水で再構成します。PCR のための一般的なプライマー デザインの詳細については、別途説明16。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
その後 3' レースで使用するための潜在的なプライマーを識別するために PCR 注: 反応で使用する最終的な前方プライマーを確認するには、PCR フード正規 PCR のため前方および逆のプライマーのさまざまな組み合わせを設定することによって設計されたプライマーをテストします。<ol>
<li>新鮮な 0.5 mL PCR チューブに cDNA (2 μ L) を転送します。前方のプライマーの 1 μ L と 1 μ L (10 mM プライマー液) から逆プライマーの追加します。ヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L を追加することで最大 12.5 μ L を作る。12.5 μ L の PCR のゲル マスター ミックス × 2 を追加します。</li>
		<li>次 PCR 熱サイクリング条件を使用: 95 ° C、2 分に続いて 29 サイクル 95 ° C の 30 s、60 ° C、30 秒と 1 分の 72 ° C、7 分 68 ° C で最終的なサイクルを設定。</li>
		<li>PCR 後に、エチジウム ブロマイドで染色 1% アガロースゲルの製品を実行します。電気泳動の詳細、いくつかの変更17以前に解説しています。<ol>
<li>250 mL のフラスコでトリス酢酸 (TAE) バッファーの 100 mL の寒天 1 g を溶解します。電子レンジで沸騰させます。</li>
			<li>まま 1 分間冷却して発煙のフード エチジウム ブロマイド溶液 (10 mg/mL 在庫) 7.5 μ L を追加します。フラスコを旋回でよく混ぜるし、水平のゲル装置に注ぐ。常温固化するゲルを許可するように、少なくとも 30 分の発煙のフードを残します。</li>
			<li>1 x TAE バッファーでゲルをカバーし、一緒に 3-5 μ L の DNA 分子量の梯子の agarose のゲルに PCR の製品の 10 μ L をロードします。10 分、撮像素子を使用している製品を可視化するため 175 V で実行し、さらに製品の分離が必要な場合追加の 5-10 分のためのゲルを実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
入り込まれたプライマー 3' 競争のための選択
	<ol>
<li>明確な強力な単一 PCR バンドを持っているプライマーを選択する PCR agarose のゲルの結果を分析します。5'-ほとんどのプライマーを使用 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC 3') 一緒に実行最初の PCR の T7 oligodT25プライマー。</li>
		<li>最初のプライマーの下流側にある入れ子になったプライマーを選択 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3')、T7 プライマーとして使用 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR の反作用の 2 番目のセット。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 最適化 3' 3' UTR の 2 つの異なる酵素を使用してマップするレース
注: ある pcr 法に使用される DNA ポリメラーゼの多様性の増加をしています。したがって、我々 は 3' レース PCR の反作用のための異なる酵素を使用した場合でも適用することができます標準の条件を決定したいです。任意のトラン スクリプトの逆のプライマーは一定します。唯一の変更は、ターゲットのトラン スクリプトの特定される入れ子になった前方プライマーです。
<ol><li>
1:3 のプロトコル 'ピュロ コックス ・ フリオスス (Pfu)から変更された DNA ポリメラーゼを用いたレース
	<ol>
<li>最初の PCR<ol>
<li>PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送し、10 x Pfu反応バッファーの 5 μ L を追加します。(10 mM ソリューション) から最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L、T7 oligodT25プライマーの 1 μ L および dNTPs の 1 μ L を追加します。</li>
			<li>水の 40 μ L を追加することによって最大 49 μ L の総ボリュームを作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を加え、よく混ぜます。表 1に PCR のプロファイルを使用して PCR を実行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第 2 PCR<ol>
<li>新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送し、10 x Pfuウルトラ II 反応バッファーの 5 μ L でミックスします。第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L、T7 プライマーの 1 μ L および dNTPs (10 mM 液) 1 μ L を追加します。</li>
			<li>水の 39 μ L を追加することによって最大 49 μ L 全反応量を作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を追加します。最初の PCR の設定 (表 1) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2:3 のプロトコル 'パイロコッカス融合した DNA 結合ドメインから成るキメラ DNA ポリメラーゼを用いたレース-校正のポリメラーゼ PCR マスター ミックスのような
	<ol>
<li>最初の PCR<ol>
<li>PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送します。最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L と T7 oligodT25プライマーの 1 μ L を追加します。水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。</li>
			<li>PCR マスター ミックス × 2 の 25 μ L を加え、よく混ぜます。表 2に記載されている PCR サイクリング条件を使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第 2 PCR<ol>
<li>新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送します。T7 逆プライマーの 1 μ L と共に第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L を追加します。</li>
			<li>水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。25 μ L の PCR マスター ミックス × 2 を追加します。最初の PCR の設定 (表 2) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 3「レースの 2 番目 PCR 製品を確認します。
<ol><li>2 番目の PCR の製品 (と同様のトラン スクリプトが豊富に記述された場合は pcr 法の最初のラウンドから製品) を 5-10 μ L と agarose のゲルの実行。ゲルを設定し、前述泳 (5.2.3.1 に 5.2.3.3 の手順) を実行します。イメージャーの結果を可視化します。</li>
</ol>8. 製品の精製とシーケンス
<ol><li>製造元のプロトコルに従ってゲルおよび PCR フラグメント DNA クリーンアップ システムを使用して 2 番目の PCR からゲルの PCR の製品を浄化します。</li>
	<li>サンガーを実行シーケンス (または、ゲル精製 PCR 製品サンプルと適切なシーケンス プライマー シーケンスの研究室に送信)。サンガーにシーケンス データを分析シーケンス。</li>
	<li>シーケンス分析ソフトウェアをダウンロード (材料の表を参照) し、トレース ファイルをソフトウェアにインポートします。呼び出し情報18を利用して個々 の純粋なベース QVs ベースを取得する (品質値)。高品質のトレース表示でクロマト グラムをダウンロードします。 省略可能: ゲル精製した製品は適切なクローン作成キットとサンガーの送信分離のクローンを使用してを複製することができますシーケンス。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

遺伝子によ遺伝子単位での大規模な並列シーケンス技術の出現にもかかわらず 3' レースまだまま PAS とポリ a の尾に隣接したヌクレオチドを識別する最も簡単なと最も経済的な方法です。ここで説明した適応は 3' レースを使用して両方を増幅し、ORF、終止コドンと全体 3' UTR ANKHD1 mRNA のコピーの部分を含むシーケンスをマップするを展開します。3' 競争の主な利点は、いくつかのマイナーな適応から 3' レース製品ことができます 3' UTR 機能 miRNA ターゲット、安定性試金、その他の機構のアッセイを含む下流の尋問を容易にする他のベクトルに複製します。これは、入れ子になったプライマー シーケンス9,10内の制限の酵素のサイトを含めることによって行うことができます。調整を行われると、のみ、3' UTR なし 3' UTR 機能アッセイ5のクローニングのための ORF からの任意のシーケンスを含めることができます。
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3' 末端の形成は、ポリ a テール1,2を作る ~ 250 untemplated アデニンの添加に続いて PAS のプレ mRNA の下流の胸の谷間を含む mRNA 成熟の重要なステップです。ポリ a 結合蛋白質 (PABP) ポリ a の尾に、これは、劣化から mRNA の転写を保護し、容易に翻訳1。
現在の推定では、ひと遺伝子の 70% を複数のパスを持ってしたがって代替起こる、結果は複数の 3' 端3を受けるとを示唆しています。したがって、任意の特定のコピーで使用される PAS を識別し同様、ポリ a の尾が 3' UTR の残りの部分に接続する位置を特定することが重要です。次世代シーケンシングの出現は UTRs とたくさんの遺伝子の 3' の同時同定になりました。シーケンス機能のこの増加は、3' 末端の代替起こるに関連するデータを分析するバイオインフォマティクス アルゴリズムの開発を求められています。De novo検出や PAS の検証、それゆえ大規模な配列データから個々 の遺伝子の 3' 末端のマッピング、3' レース選択4、5の方法のままです。通常 3' 競争の cDNA 製品に含まれるシーケンスには 3' UTR ポリ a の尾、胸の谷間サイト、PAS および PAS の上流のシーケンスが含まれている部分だけが含まれます。3' レースはデザインと遺伝子特定の前方および逆のプライマーの使用必要とする PCR とは異なり、2 つの遺伝子特定入れ子になった前方プライマーのみ必要があります。したがって、PCR 増幅4,6をされている遺伝子の大きな領域の塩基配列の詳細な知識が必要です。3' レースを使用するので同じ逆、ポリ a テールすべて polyadenylated RNA 転写産物のターゲット、前方プライマーのみする必要がある遺伝子を特定、したがって、だけ mRNA の非常に小さい領域の知識を必要とする入門書です。これにより、そのシーケンスがあります完全に特徴づけられる4,7の領域の増幅。これは、3' だけでなく遺伝子の 3' 終わりを決定するが、また判断して上流 3' UTR の重要な部分を形成する PAS の大きい地域を特徴づけるのための競争を許可しています。5' 変更された 3' 3' UTR のより大きい部分と並ぶ地域を含むレースとレースを組み合わせて、完全にシーケンスまたは 3' 端8に 5' 端から全体 mRNA のコピーのクローンを作成することが可能です。
この変更された 3' 競争の適用の例は、小説CCND1 MRCK融合遺伝子転写マントル細胞リンパ腫細胞株およびがん患者からの最近の id です。3' UTR CCND1とMRCKの両方の遺伝子配列から成り、miRNA 規制9に反抗しました。2 つ入れ子になったCCND1特定前方プライマーがすぐに隣接してCCND1の終止コドンの下流領域に補足。財源やバイオ情報を作る専門知識に多くの研究所がない場合があります特定 bioinformatic ツールと共に全体のトランスクリプトーム シーケンスを使用して、3' UTR10内遺伝子融合を検出できますが、この技術を使って。したがって、3' レースは 3' UTR を含む新規融合遺伝子のde novoの識別と確認のための代替。考えると、抜本的な報告された融合遺伝子の数の増加し同様に議事録を読んで、3' レース ツールとなっている強力な遺伝子シーケンス11,12を特徴付けること。また、最近の研究は、3' UTR の長さと同様、そのさまざまなシーケンス内で 3' UTR mRNA 転写安定性、ローカリゼーション、訳し、および関数13に影響することができますを示しています。関心の高まりの一部によるトランスクリプトームをマッピングの研究室で使用するため開発されている種類の DNA ポリメラーゼの数が増加しています。どのような種類の変更させることができます 3' DNA ポリメラーゼの使用可能なレパートリーを活用するための競争のプロトコルを決定することが重要です。
この作業を適応 3' マップ全体 3' UTR にレース レポート、PAS とを使用してANKHD1の転写産物の 3' 終わり胸の谷間サイト ネスト トラン スクリプトの 2 つの種類の DNA ポリメラーゼANKHD1セクション内のプライマー。

<table><tbody><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>子宮頸がん細胞株。</td></tr><tr><td>Jeko-1細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>マントル細胞リンパ腫細胞株。</td></tr><tr><td>Granta-519細胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>マントル細胞リンパ腫細胞株。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F6178</td><td>細胞培養用のウシ胎児血清。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>抗生物質および抗真菌剤。</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>共沈剤。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco ブランドの細胞培養培地と GlutaMAX。</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼ自由水</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(非 DEPC 処理)。</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝液</td><td>コーニング</td><td>21-030</td><td>1X PBS。</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ&nbsp;Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>試薬 アルコール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>エタノール</td></tr><tr><td>エチジウム臭化物溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>単相フェノールおよびグアニジン イソチオシアネート試薬。</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&nbsp; ルーチンのクイックPCRアッセイやプライマー検索に使用されるローディング色素が含まれています。</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase治療キット。</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix には、Pyrococcus様プルーフリーディングポリメラーゼと他の試薬に融合したDNA結合ドメインからなるキメラDNAポリメラーゼが含まれています。</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Pyrococcus furiosus(Pfu)由来の修飾DNAポリメラーゼ。</td></tr><tr><td>RevertAid RT 逆転写キット</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>mRNAの逆転写からcDNA合成に使用します。キットに含まれるもの&nbsp;Ribolock RNAse阻害剤、RevertAid M-MuLV逆転写酵素、および原稿に記載されているその他の試薬。</td></tr><tr><td>Pefectサイズ1Kbラダー5</td><td>プライム</td><td>2500360</td><td>分子量DNAラダー。</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>エチジウムブロマイド染色アガロースゲルの視覚化に使用されます。</td></tr><tr><td>低分子量ラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3233L</td><td>分子量DNAラダー。</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>ドライバス</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>分光光度計。</td></tr><tr><td>ワイドミニサブ&nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>電気泳動装置-ゲル</td></tr>体を設置する装置 <tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>ゲル電気泳動用電源です。</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR サーモサイクラー。</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV ゲルと PCR フラグメント DNA クリーンアップシステム</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&nbsp;TOP10 ケミカルコンピテント大腸菌細胞</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR調製ステーション Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>PCR作業専用のフードです。</td></tr><tr><td>ハミルトン SafeAire II ヒュームフード</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>ヒュームフード。</td></tr><tr><td>ベックマン・コールターZ1&nbsp;粒子&nbsp;カウンター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>6605698</td><td>パーティクルカウンター。めっき前のセルカウント用&nbsp;RNA抽出用。</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (via ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>サンガーシーケンシングデータを解析するソフトウェアです。</td></tr></tbody></table>

適応 3' cdna の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

真核生物 Mrna の成熟には、ポリ a 尾部の付加を含む 3' 端形成が含まれます。遺伝子の 3' 末端をマップするために選択する従来の方法は (3' レース) の cDNA の端の急速な拡大は 3' です。3' 競争のプロトコルには、入念な設計と興味のターゲット遺伝子の 3' 非翻訳領域 (3' UTR) 内でネストされたプライマーの選択が必要です。ただし、いくつかの変更で全体 3' UTR と ORF と 3' UTR の関係のより包括的な画像を提供するオープンリーディング フレーム (ORF) 内のシーケンスを含めるプロトコルを使用できます。これは従来 3' 競争によって提供される、胸の谷間と起こるサイトだけでなく、起こる信号 (PAS) の識別に加えてです。拡張された 3' レース珍しい 3' 3' UTR、内融合遺伝子を含む UTRs を検出できるし、AU 豊富なトラン スクリプトの安定性に影響を与える要素の不安定化と同様、潜在的なマイクロ Rna 結合部位を予測するシーケンス情報を使用できます。

入れ子になった前方プライマー検索:
Agarose のゲルから使用する同じ転送別逆プライマーはプライマー 2 個別 PCR のゲル製品 (レーン 1 と 2) を図 1に示します。レーン 3 個別 PCR の製品、異なる前方および逆プライマーを有しています。理想的なプライマーによる PCR 反応に使用する、1 種類の PCR 製品 (3 車線) を与えます。レーン 1 と 2 で使用される転送プライマー最強のバンドを与える (予想)、最大の PCR の製品を与えるし、最初の前方のプライマーとして使用されます。3' レースでの PCR の反作用の 2 番目のセットの第 2 ネストされたプライマーは、車線 3 から前方のプライマーです。
異なる DNA ポ...

(3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。

適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

この手順の全体的な目標は、その後の2つのPCRで転写産物特異的なネストプライマーを使用し、精製されたPCR産物をシーケンシングすることにより、3プライム末端からタンパク質コード領域内の領域までのmRNA転写産物の配列を決定することです。この方法は、ポリアデニル化シグナル、終止コドン、転写産物の3プライム非翻訳領域の配列の決定など、遺伝分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、オープンリーディングフレームの小さな領域の配列が、腫瘍特異的な融合遺伝子およびスプライス変異体を検出できるため、この技術の意味するところが癌診断にまで及ぶ場合、任意の転写産物に適用できることである。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、これまで特徴付けられていなかった、3つのプライミングされた未翻訳領域を持つ新規転写産物を特定したときでした。プロトコールを開始するには、フェノールとグアニジンのイソチオシアネート細胞混合物を氷上で解凍します。解凍したら、PCRフード内の微量遠心チューブに100マイクロリットルのクロロホルムを加えます。混合物がピンク色で不透明になるまで、サンプルを10〜15秒間ボルテックスします。次に、サンプルを氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを20、800g、摂氏4度で15分間遠心分離します。上部の無色水相を慎重に取り出し、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、沈殿に移り、等量のイソプロパノールをサンプルに加えます。1マイクロリットルの共沈剤をサンプルに加えて、RNAのキャリアとして機能し、後続のステップでRNAを視覚化するのに役立ちます。サンプルを摂氏80度で少なくとも4時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを冷却した遠心分離機に移し、20、800g、摂氏4度で35分間回転させます。スピン後、RNAはチューブの底に青い斑点として現れます。サンプルからイソプロパノールを慎重に取り除きます。500マイクロリットルの80%エタノールを加え、3秒間短時間ボルテックスしてペレットを再懸濁します。サンプルを再度遠心分離します。サンプルからすべてのエタノールを取り除き、サンプルを約10分間風乾させます。サンプルが乾いたら、35マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。次に、サンプルをヒートブロックに置きます。摂氏65度に5分間設定して、RNAが完全に溶液中にあることを確認します。加熱後、すぐにチューブを氷の上に置きます。最終反応量が50マイクロリットルの場合、水を加えた全RNAを4マイクログラム、総量22マイクロリットルを新しいチューブに加えます。10マイクロモルプライマー溶液から2マイクロリットルのOligo dT 25プライマーを添加します。逆転写キットから、RNase阻害剤を2マイクロリットル、5x反応バッファーを8マイクロリットル、10ミリモルdNTPを4マイクロリットル、逆転写酵素を2マイクロリットル追加します。逆転写酵素を使わずに反応を起こし、ネガティブコントロールとして作用させます。チューブを摂氏42度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを直接氷に移してから、加熱ブロックに輸送します。次に、チューブを摂氏75度で5分間加熱します。75°Cに加熱した後、チューブを氷の上に置きます。2マイクロリットルのcDNAを新鮮な0.5ミリリットルのPCRチューブに移します。10ミリモルプライマー溶液からフォワードプライマー1マイクロリットルとリバースプライマー1マイクロリットルを追加します。8.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、12.5マイクロリットルの2x PCRをゲルマスターミックスに加えることで、最大12.5マイクロリットルを作ります。次に、画面にリストされているPCRサーマルサイクリング条件を入力し、PCRを実行します。PCR後、エチジウムブロマイドで染色した1%アガロースゲルを調製します。1グラムのアガロースを100ミリリットルのトリアセテートまたはTAEバッファーに250ミリリットルのフラスコに溶解します。中身を電子レンジで茹でます。ゲルを1分間冷まし、ヒュームフードに7.5マイクロリットルの臭化エチジウム溶液を加えます。フラスコを回してよく混ぜます。内容物を水平ゲル装置に注ぎ、ヒュームフード内でゲルを室温で少なくとも30分間固化させます。ゲルを1x TAEバッファーで覆い、10マイクロリットルのPCR産物を3〜5マイクロリットルのDNA分子量ラダーとともにアガロースゲルにロードします。ゲルを175ボルトで10分間泳がせます。最初のPCRでは、1マイクロリットルのcDNAをPCRチューブに移し、5マイクロリットルの10x Pfu反応バッファーを追加します。10ミリモル溶液から、最初のネスティングフォワードプライマーを1マイクロリットル、T7 Oligo dT 25プライマーを1マイクロリットル、dNTPを1マイクロリットル追加します。40マイクロリットルの水を追加することで、最大49マイクロリットルの総容量を作ります。1マイクロリットルのPfu DNAポリメラーゼを加え、よく混ぜます。次に、PCRを実行します。次に、2枚目のPCRを調製します。最初のPCRから2マイクロリットルの製品を新しいPCRチューブに移し、5マイクロリットルの10x Pfu ultra two reactionバッファーと混合します。2番目のネスティングPCRプライマーを1マイクロリットル、T7プライマーを1マイクロリットル、およびdNTPを1マイクロリットル追加します。39マイクロリットルの水を追加し、1マイクロリットルのPfu DNAポリメラーゼを追加することで、最大49マイクロリットルの総反応量を作成します。最初のPCRセットアップと同じPCRプロファイルを使用してPCRを実行します。あるいは、Pfu DNAポリメラーゼを使用する代わりに、キメラDNAポリメラーゼを2つの異なるPCRに使用することができます。2番目のPCR産物を5〜10マイクロリットル取り、アガロースゲルで実行します。最後に、結果をイメージャーで視覚化します。このアガロースゲルは、同じフォワードプライマーを使用するが異なるリバースプライマーを使用する2つの異なるPCR産物と、異なるフォワードプライマーとリバースプライマーを持つ異なるPCR産物を示しています。PCRベースの反応に使用する理想的なプライマーは、1つの異なるPCR産物を与えるプライマーです。Pfu DNAポリメラーゼとキメラDNAポリメラーゼを用いた2回目のPCR反応で得られた産物は、3プライムRACEのPCRサイクリング条件が異なるにもかかわらず、同じサイズのPCR産物を産生しました。逆転写酵素陰性コントロールでは、cDNA合成に使用されたRNAおよびその後の下流反応で使用されたRNAのゲノム汚染は示されませんでした。ゲル精製されたPCR産物をシーケンシングのために送付しました。シーケンスクロマトグラムから得られた代表的なサンガー配列により、3プライムRACE産物の終止コドンの位置、推定されるポリアデニル化シグナル、その部位、およびポリAテールが同定されました。この手順を試みるときは、常に保護具と手袋を着用することを忘れないでください。さらに、試薬チューブやその他の使い捨て品には、滅菌済みのDNaseとRNaseを使用してください。フェノールやクロロホルムの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。また、試薬をフード内で使用したり、指定された廃棄物容器に材料を捨てたりするなどの予防措置を必ず講じる必要があります。

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。...

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

このプロトコルでは、マッピング mRNA 3'...

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR...

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。...

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

ここでは、複数のバイオインフォマティクスツールを組み合わせて、がんにおける TMEM200A...

汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。...

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

学ぶ 3' RACE法によるがん細胞株のmRNA配列決定法。ネスト型プライマーとPCRを用いて、オープンリーディングフレーム、終止コドン、3' UTRを同定し、腫瘍特異的融合遺伝子やスプライスバリアントを検出する。

適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

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