Name: フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぼう フローサイトメトリーを用いた人脂肪組織からの免疫細胞分離と解析法。SVFを調製し、マクロファージやT細胞、B細胞、NK細胞などの免疫細胞サブセットを同定・定量化する手法を解説します。

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我々 感謝したい j. ヴァン ・ デ ・創刊と M. Vroomen (マーストリヒト大学、オランダ) テクニカル サポートのため。さらに、k. Verboven、D. ハンセン、j. Jocken に感謝したいと思います、血液や組織生検を提供するため E. Blaak はこのプロトコルとその後の実験の設定に使用します。

内臓や皮下のサンプル」では、医療倫理委員会ジェッサ病院、ハッセルト、ヘルシンキ宣言に基づき、ベルギーのハッセルト大学によって承認された研究対象から採取しました。
1. 試薬の調製
<ol><li>コラゲナーゼの解決<ol>
<li>1 g を溶かすコラゲナーゼのリン酸塩の 10 mL で緩衝生理食塩水 (PBS、カルシウムとマグネシウムなし) 100 mg/mL の原液をします。200 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>コラゲナーゼ XI PBS 100 mg/mL の原液を 10 mL に 1 g を溶解します。200 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>DNase の 10 mg を溶解 10 mg/mL の原液に PBS の 10 mL で。180 μ 因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>100 μ L コラゲナーゼを追加 (100 mg/mL)、100 μ L コラゲナーゼ XI (100 mg/mL)、および 90 μ L DNase I (10 mg/mL) 10 mL を DMEM ハム f12 キー。各分離の新鮮なコラゲナーゼの解決を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>赤血球の換散バッファー<ol>
<li>0.84 g NH4Cl 100 mL の純水に溶解します。</li>
		<li>使用する前に 7.4 で pH を設定します。4 ° C でガラスのフラスコに格納します。</li>
		<li>使用前に氷の上には、赤血球の換散バッファーを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS バッファー<ol>
<li>0.5 g ウシ血清アルブミン (BSA) を 0.5% BSA PBS を取得する PBS の 100 mL に溶かしてください。</li>
		<li>10 mM ナン3 0.5% BSA PBS を取得する 100 mL 0.5% BSA PBS にナン3 65 mg を溶解します。4 ° C でガラスのフラスコの中のストア ソリューション</li>
		<li>使用する前に氷の上場所 FACS バッファー。 注意: ナン3は非常に有毒です。発煙のフードで働き、安全メガネとナン3の処理中の保護のため手袋を着用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>人間の IgG ブロック<ol>
<li>10 mL の PBS 1 mg/mL を取得するにはヒト IgG の 10 mg を溶解します。100 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>使用する前に氷の上には、人間の IgG ブロックを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. AT からの SVF の分離
<ol><li>1 g の生検で小さく切る (± 2 mm2) メスと転送 (例えばファルコン管) 50 mL 遠心管に。コラゲナーゼ溶液 10 mL を各サンプルに追加します。 注: 管の蓋を完全に閉めるし、蓋 1/4 ターンを元に戻す。</li>
	<li>穏やかな揺れ (60 サイクル/分) の下水浴の 37 ° C で 60 分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μ M フィルター結果の懸濁液をフィルタ リングし、新しい 50 mL 遠心チューブにサンプルを収集します。フィルターを洗浄し、すべてのセルの取得フィルターの上に 7 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
	<li>ピペッティングで浮動脂肪細胞分画を削除します。細胞ペレットは、SVF です。 注: は、SVF を取得する脂肪細胞分画を削除します。これだけ、PBS とフローティングの脂肪細胞ではないが削除されますので、サンプルの全体の先端を水没は避けてください。</li>
	<li>5 mL の PBS コラゲナーゼを削除、70 μ M フィルターで懸濁液をフィルタ リング、5 ml の PBS のフィルターを洗浄し、4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離機で SVF を再懸濁します</li>
	<li>上澄みを除去し、赤血球の換散バッファーの 3 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>氷の上で 5 分間インキュベートします。孵化後 7 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
</ol>3. 染色 SVF のフローサイトメトリー解析
<ol><li>90 μ L 4 ° C FACS バッファー内細胞ペレットを溶解し、1 mg/mL ヒト IgG ブロックの 10 μ L を追加します。V 字 96 well プレートの 2 ウェルズに細胞懸濁液を分割します。氷の上のプレートを置き、15 分間インキュベート人間の IgG ブロックができます。</li>
	<li>各サンプルを洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 280 x g で 5 分間プレートに 100 μ L FACS バッファーを追加します。プレートをタップしないで 1 つの滑らかな動きで上下プレートをひっくり返すことによって上澄みを削除します。 メモ: は、プレートを逆さまに維持しながらティッシュでプレートの上から残りの液体を削除することを確認してください。</li>
	<li>表 1と表 2に記載のマクロファージと DC サブセット (FACS パネル 1) および T および B 細胞サブセット (FACS パネル 2) 抗体カクテルを準備します。表 1と表 2に記載されているボリュームは抗体濃度の最適化後に選択された、1 つの付加価値税または土のサンプルのために十分です。 注: FACS パネルで 1、使用して CD303 と CD141 マーカーを確認するその CD11C+ CD11B低細胞、Dc。ただし、ライブ/デッド染色を含むようにパネルからこれらのマーカーを除外することをお勧めします。1 と 2 両方 FACS パネルは、パネル 1 PE チャネルとしての CD303 を除くが使用されないときに染色ライブ/デッド修正赤死んだ細胞染色キット生存率と組み合わせることができます。製造元の指示に従って染色性を実行します。</li>
	<li>FACS パネル 2 のためのカクテル 23 μ L 抗体と 29.5 μ L 抗体 FACS パネル 1 のためのカクテルでペレットを再懸濁します。氷の上の暗闇の中で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに 150 μ L FACS バッファーを追加し、2 番目の洗浄ステップを実行する細胞ペレットを再懸濁します。280 x g と 4 ° C で 5 分間プレートを遠心分離します。上清を削除するには、プレートを逆さまに転倒します。</li>
	<li>セルを修正する各ウェルに 150 μ L 1% ホルムアルデヒド溶液を追加します。P200 ピペットでピペッティングによる各ウェルから対応する FACS チューブに細胞懸濁液を転送します。最大 7 日間暗闇で 4 ° C で FACS チューブを格納します。 注: 直接測定も可能です。1% のホルムアルデヒドではなく各ウェルに 150 μ L FACS バッファーを追加、対応する FACS チューブに P200 ピペットでピペッティングにより細胞を転送および細胞を分析します。 注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒です。ヒューム フード吸入を避けるために、手袋、保護のため保護メガネ着用で作業中のホルムアルデヒド溶液を準備します。</li>
</ol>4. 流れフローサイトメトリー解析
<ol><li>最初の測定の前に無染色のネガティブ コントロールを使用 (FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) を設定できます。関心のすべての人口は破片と生きた細胞の区別を行うことができます、FSC と SSC のグラフに表示されるよう、製造元の指示に従って流れの cytometer の電圧を調整します。</li>
	<li>次の製造元のプロトコル抗体キャプチャ ビーズ マルチ色補正解析を行います。</li>
	<li>抗体ミックスすることによってマイナス 1 つ (FMO) コントロール蛍光を準備がミックスから 1 つの抗体を除外します。すべての抗体は、FACS パネル 1、8 抗体ミックスと FACS パネル 2 の 6 の抗体のミックスを作成するこれを行います。これらの FMO の抗体の混合物はこのプロトコルで前述した SVF を染色に使用されます。</li>
	<li>FMO のすべてのコントロールを測定し、FMO コントロールに基づいてゲーティング戦略を設定します。FMO コントロールを使用して、セルの可能な自動蛍光を検出します。 注: ミックスの 1 つの抗体を外してこのチャンネルで検出された任意の蛍光レベル背景/蛍光信号です。したがって、異なる FMO を比較することによって FACS 結果を制御、ゲート、gatings 陽性細胞に基づく、自動蛍光に基づいていないこと、特定の集団に描画できます。</li>
	<li>渦、FACS チューブ流れの cytometer でそれらを配置して、測定開始前に 800 の rpm で。 注: 十分なセルがそれぞれの亜種から測定されますを確保するためには、最低 50,000 イベント ライブのゲートでの使用をお勧めします。</li>
</ol>

<ol><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+immunity%2C+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li>
<li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance%3A+cells%2C+cytokines%2C+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239(2013).</li>
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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

これらのメソッドは、付加価値税からの SVF を分離する方法について説明し座って、これらの組織内にある免疫細胞の相対的な量を定量化します。さらに、メソッドは状態特定の細胞型のマーカーの発現を決定する方法です。
免疫細胞のフローサイトメトリーは、組織の免疫学的状態の表現型に強力な手法です。免疫細胞の定量化は、多くのアプリケーションを持つことができます。結果に従って、特定の免疫細胞 (例えば、肥満と無駄のない) の患者のグループの間の存在を比較することが可能です。さらに、またフローサイトメトリーを実行すると同じ患者の血液、循環細胞と細胞の間の関連を調べることができます。このアプリケーションでは、単球の循環の特定のサブセットをプロ炎症性 CD11C に関連付けられていることを確認することができました+脂肪組織マクロファージ16。
記述のプロトコルを調整多数入手可能な蛍光抗体作る cytometry 流れ非常に多彩な応用が広がります。異なった抗体とほぼすべての細胞の種類を区別できるし、多くのマーカーの発現を検出することができます。さらに、構造の蛍光抗体の細胞内結合を許可する細胞膜によって細胞内マーカーを染色することが可能です。これらの特性は、過度に簡略化された M1 と M2 マクロファージ サブタイプを超えて非常に多様な大食細胞集団の区別を許可します。表面マーカー式の測定のほか、細胞内マクロファージの機能に関する情報を提供を (すなわちサイトカイン) の蛋白質に汚すことができます。また、キ67 など増殖マーカーが増殖率を定量化する使用されます。前述のように、マクロファージと Dc の違いは DC マーカーの MFI のレベルに基づいていた。CD68 などの一般的なマクロファージ マーカーは、マクロファージ パネル (FACS パネル 1) に組み込むことができます。ただし、CD68 は望ましくないとプロトコルを拡張する細胞膜の細胞内に必要な透過を染色する必要があります。他の大食細胞のマーカーは、CD163 や CD206 CD11c、ここに提示マクロファージ パネルに統合されている後者など一部マーカーです。
私たちの FACS のパネルでライブと死んでいるセルを区別するためにマーカー含まれませんでした、FSC と SSC の使用よりも死んだ細胞のより正確な除外できるのでこれが望ましいでしょう。頻繁に使用されるが、DNA 染色性染料 propidium ヨウ化 (PI) または 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と同様、遊離アミン反応染料ライブ/デッド修正死んだ細胞染色キットなど、別の色素の色で利用可能です。ただし、PI、DAPI は、セルを固定するときに使用できません。プロトコルに従って、LIVE/デッド修正赤死んだ細胞生存率の染色に統合できます両方のパネル全体 FACS の戦略をゲートに影響を与えずに。
さらに、データは、相対的なすべてのデータを意味生きているセルの割合として表されます。正確な入力、するだけに流れの cytometer 細胞数を知られていることは可能セル タイプごとの正確な数字を決定します。セルのおおよその数は、カウント箱を用いた SVF 分数でセルをカウント後に計算される可能性があります。この番号は生検組織、SVF を分離するために使用量を調整するだろうしかしで肥満に赤身を比較するとき、これは制限があります。満ちている脂質が大きく拡大した肥満の AT のような質量は、以下の脂肪細胞で構成されます。これは免疫細胞または脂肪細胞ごとでのグラム当たりの数として表示される場合免疫細胞数を過小評価する可能性があります。
人間の研究では、非常に重要な実験の手順の標準化を作る時間の長い期間にわたって患者の包含は通常行われます。流れ cytometry データ患者間の比較のためにいくつかのオプションがあります。このプロトコルに従って、細胞は同じ日にいくつかのサンプルの解析をできるように測定する前に修正できます。これは、すべてのサンプルの間で等しくなるようにプロシージャを汚すことができますそれらを染色には、細胞の生存率が影響を受ける前に、SVF を凍結によっても達成することができます。最後に、本研究で採用も、補正レベルをインストールする蛍光ビーズ、cytometer 追跡ビーズは、cytometer の日々 の測定を標準化する隔週を使用されました。この最後のオプションは、最も効率的な時間の長い期間に渡る研究からのサンプルの測定を行う場合。
フローサイトメトリー用の制限要因は、一般に蛍光性の使用です。同時に検出できる蛍光ラベルの数による発光スペクトルの重複制限されます。ただし、スマート FACS パネル開発と付加価値税または土サンプルごとのいくつかの抗体カクテルの使用は、このプロトコルで説明されているようこの問題を克服することができます。FACS パネル開発の重要な側面は、FMO のコントロールです。1 つを除いてパネルの全ての抗体を使用して、潜在的な自発レベルがフル パネルに FMO を比較するとき、それが理解できます。これにより、人口の正確なゲートと新しい FACS パネルを設定するときにこれらの手順を実行する必要があります。さらに、新世代の FACS デバイスはセルごとの多くの特徴の同時検出を許可する最大 50 パラメーターを検出できます。蛍光面に関連する別の問題は、特にマクロファージ細胞の蛍光です。FACS レーザによる細胞 (主に 488 nm 波長励起)、励起後これらの細胞は、蛍光シグナルを出す (主に < 640 nm) をことができる抗体の発光スペクトルと重複ラベル17,18。この点を考慮するには、無染色の細胞は各チャンネルで蛍光を決定する測定べきであります。この知識があれば、螢光色素は蛍光信号を超えると信号強度を表示するを選択してください。人口のゲーティングの戦略を決定するとき、この蛍光バック グラウンド信号考慮に入れする必要があります。したがって、このプロトコルとインテリジェント FACS パネル デザインのアプリケーションによって深度表現型マクロファージ サブタイプにすることが可能です。新しい個別でマクロファージとその機能を特徴づけることができます。

肥満の特徴は、低悪性度の AT を炎症1と (vAT、土) で内臓や皮下の炎症性免疫細胞の浸潤。付加価値税のプロ炎症性免疫細胞の蓄積はタイプ 2 の糖尿病2を開発するための主な危険因子であるインスリン抵抗性に します。CD4 肥満で、マクロファージ、肥満細胞、好中球などの自然免疫と適応免疫システムの両方の免疫細胞がある+および CD8+の T 細胞および B 細胞3,4,5,6 ,7。これらの免疫細胞、内皮細胞、間質細胞や脂肪前駆細胞、線維芽細胞、周と共に SVF8を構成するもので、AT9プロ炎症性物質の主な情報源。
西部のしみ10、qPCR11、免疫組織化学11などのテクニックで AT の炎症状態を調べた一般的.しかし、これらの技術、全体で、脂肪細胞、SVF を使用する場合、使用されます。量と免疫細胞で現在のサブセットを決定するは困難します。免疫細胞マクロファージなどに分類し、定義してさまざまな細胞のマーカーがあります。マクロファージは、機能や細胞表面マーカー式12で重要な不均一性を示します。したがって、しばしば 2 つの大食細胞集団に分けられる: M1 と M2。M2 マクロファージは通常また活性化マクロファージ12,13と呼ばれ、無駄のない代謝正常人間14AT 内に存在します。ただし、肥満の間に、M1 マクロファージに、表現型スイッチは M2 マクロファージから発生します。これらは古典的な M1 マクロファージ エクスプレス CD11C12と13クラウンのような構造を形成する死んだ脂肪細胞の周りに蓄積を活性化。それは示されているその CD11C+で、マクロファージはインスリン作用を損なうし、肥満人間15のインスリン抵抗性に関連付けられています。M1 と M2 の大食細胞を識別するために免疫組織化学はオプションです。このテクニックは、組織におけるマクロファージの場所に関する情報を与えます。ただし、1 つの染色で使用できるマーカーの数が制限されます。また、定量化することは困難ですも。そこで、vAT および土の沈殿物の異なる免疫細胞サブセットを調べるためには、流れの cytometry アプローチを開発しました。このアプローチは私たちの細胞のサブセットを定義し、各サブセットで預金の存在の数をカウントする 1 つのフローのフローサイトメトリー解析と細胞 1 個あたり複数のマーカーを使用する機会を与えます。

<table><tbody><tr><td>遠心分離機</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)-ハム's F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum 由来のコラゲナーゼ XI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum 由来のコラゲナーゼ I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>ウシの膵臓由来の DNAse I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Mシリンジ Filcons</td><td>BD Biosciences 340613</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;M フィルター</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc ブロック / ヒト IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BDバイオサイエンス555724</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD56-FITC</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421</td>バイオ<td>レジェン</td>ド<td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 v-shape well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td>651101</tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FACS チューブ 5 mL ポリスチレン丸底チューブ</td><td>コーニング</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清由来 IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rat Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウスIg、κ/ネガティブコントロール補正粒子セット</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能なレッドデッドセルステインキット</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&nbsp;MS 3ベーシックシェーカー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

(に) 預金皮下脂肪および内臓脂肪組織での免疫細胞の浸潤は、2 型糖尿病などの肥満関連の合併症の開発に貢献する低悪性度の炎症につながります。定量的および定性的調査預金でヒトの免疫細胞のサブセットを流れの cytometry アプローチを開発しました。免疫細胞を含む間質血管分数 (SVF) は、コラゲナーゼの消化力によって皮下脂肪および生検で内臓から分離されます。脂肪細胞は、遠心分離後に削除されます。SVF 細胞は免疫細胞のサブセットの間で区別するために選択し、フローサイトメトリーを用いて複数の膜結合型マーカーのステンド グラスします。このアプローチは、プロおよび抗炎症の大食細胞サブセットの結果として樹状細胞 (Dc)、B 細胞、CD4+および CD8+の T 細胞、NK 細胞を検出および定量化することができます。このメソッドは、免疫細胞とそれぞれの特定のサブセットの量に関する詳細情報を提供します。利用できる多数の蛍光抗体があるので流れ cytometry 取り組みは興味の様々 なの他の細胞および細胞内マーカーを測定する調整できます。

土および付加価値税から分離された SVF は、フローサイトメトリーを用いて測定しました。流れの cytometry の測定は、細胞マーカー (図 1 aと1 b) に基づいて異なる細胞集団を示すプロットを生成します。まず、プロットすることによって転送幅 (FSC W) を散布前後散布面積 (FSC-A)、セルの集計は、低 FSC w. として単一のセルをゲートでさらに分析から除去できます。次に、ライブのセルが選択されていると細胞の残骸がゲーティング セル、正しいサイズと FSC を使用して複雑さによって除外されて- と側散布領域 (SSC-A)、それぞれ。死んだ細胞が小さく、したがって異なる人口として目に見える小さな FSC A.次に、免疫細胞は、汎白血球マーカー CD45 の使用 (パネル 1 と 2、図 1 a) が選ばれました。T 細胞サブセット (CD3) B 細胞 (CD19)、好中球など他の免疫細胞のマクロファージを分析する (CD66b+ CD11b+)、これらの細胞をターゲットと異なる抗体を用いたが、同じ NK 細胞 (CD56) がさらなる分析から除外されたと螢光色素。残りのセルのさらなる細分化は CD11b と CD11c 表現に基づいていた。これ次の人口で起因した: CD11b+ CD11c+マクロファージ、CD11b+ CD11c-マクロファージと CD11b低/- CD11c+ Dc (FACS パネル 1、図 1 b)。平均蛍光強度 (MFI) の測定を許可 CD303 の式の定量化 (形質細胞様 DC マーカー) と CD141 (DC マーカー)、CD11b の+ CD11c+マクロファージと CD11b低/- CD11c+ Dc。両方のこれらのマーカーの発現が高かった CD11b低/- CD11c+を確認する細胞その CD11b低/- CD11c+セルされた DCs (図 1)。
CD45+細胞 (図 1 a) は、T 細胞と B 細胞に分けられた CD3 と CD19、それぞれ使用しています。T 細胞は、ヘルパー T 細胞に細分された (CD4+) と細胞傷害性 T 細胞 (CD8+)。最後に、CD3-CD19-セルされた NK 細胞マーカー CD56 を使用して定量化するプロット (FACS パネル 2,図 1)。各ゲート内のセルの数は定量化され、すべての生きているセル (表 3) のこの型のセルの割合を計算する使用ことができます。
すべての平均の計算を許可する各教科科目のグループでたとえば、特定免疫細胞、すなわち、プロ炎症性の CD11b の豊かさを表示する無駄のないまたは肥満の男性の生活細胞の割合を計算できます+CD11c+内臓のマクロファージ (図 2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> 図 1。内臓脂肪組織の戦略をゲート FACS 。FSC A と側面の散布領域強度に基づいて前方散乱幅強度 (FSC W) と (FSC A) を含むのみ単一のセル選択 (赤) FACS プロットに続いてゲート前方散乱領域強度のすべてのイベント (黒) の (A) FACS プロット (SSC-A)生きているセル (ライト グリーン) を選択するゲートを含みます。次に SSC a プロット CD45 蛍光強度を含む選択すべて CD45 ゲートと+ (免疫) 細胞 (青)。(B) FACS CD11b 蛍光強度とゲート CD19、CD3、CD66b、CD56 陰性、すべてのセルを選択する (ブラウン) さらに集団に分割の CD19、CD3 や CD66b、CD56 の蛍光強度のプロット。CD11b と CD11c の蛍光強度に基づいて次のプロットにさらに細分化。CD11b を含むゲートが表示されます+ CD11c+マクロファージ (ダーク グリーン)、CD11b+ CD11c-マクロファージ (紫) と CD11b低/- CD11c+樹状細胞 (青)。(C) CD11b 量+、CD11c+または CD11b低/- CD11c+ CD303 と CD141、及び平均対応する定量化の蛍光強度 (x 軸) のレベルを表示するセル (y 軸)蛍光強度 (MFI)。以前 CD45 を表示する (D) FACS プロット+ゲートの両方 CD3 (マゼンタ) の T 細胞、B 細胞 (ダーク グリーン) と非蛍光細胞 (グリーン) 負の選択を含む CD19、CD3 の蛍光強度に基づいて人口 (ブルー)CD19。次のプロットは CD4 を選択するゲートの CD4 および CD8 の蛍光に基づいて+ (ライト グリーン) および CD8+ (マゼンタ) T 細胞。同一ゲート戦略は、皮下脂肪組織に使用されます。同一ゲート戦略は、皮下脂肪組織に使用されます。この図は、参加らから変更されています。16<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> 図 2。肥満の付加価値税を含むより多くのプロ炎症性マクロファージ。CD11b 量+ CD11c+リーン、肥満の男性の付加価値税のすべての生きているセルの割合として提示マクロファージ。すべてのデータは、平均 ± SEM;n = 20 リーンと n = 31 の肥満。リーン対p ≤ 0.01。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ターゲットの定義</td>
			<td>上に存在します。</td>
			<td>螢光色素</td>
			<td>数量</td>
			<td>クローン</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>骨髄性インテグリン マーカー</td>
			<td>顆粒球、単球/マクロファージ、樹状細胞低ナチュラル キラー細胞</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>一般的な B 細胞抗原</td>
			<td>海つぼみ B 細胞と B 細胞にプロ B 細胞からの b 細胞の開発</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>一般的な T 細胞抗原</td>
			<td>T リンパ球、ナチュラル キラー T 細胞および胸腺細胞</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>癌胎児性抗原 (CEA) のメンバー-糖蛋白質家族のように</td>
			<td>顆粒球</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>大きくグリコ接着タンパク質</td>
			<td>ナチュラル キラー細胞、ナチュラル キラー T 細胞</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>タイプ II 膜貫通型糖タンパク質</td>
			<td>形質細胞様樹状細胞</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>トロンボモジュリン</td>
			<td>単球/マクロファージ低、樹状細胞の亜集団</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>タイプ I の膜貫通型糖タンパク質。インテグリン αx</td>
			<td>単球/マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、ナチュラル キラー細胞、B および T 細胞のサブセット</td>
			<td>APC Cy7</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>一般的な白血球抗原</td>
			<td>リンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および胸腺を含むすべての人間の白血球</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS バッファー</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 μ l</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。抗体のカクテル FACS panel サブセット マクロファージと樹状細胞集団を識別する 1.記載されている抗体の量は 1 つのサンプルの分析のためです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ターゲットの定義</td>
			<td>上に存在します。</td>
			<td>螢光色素</td>
			<td>数量</td>
			<td>クローン</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>一般的な B 細胞抗原</td>
			<td>海つぼみ B 細胞と B 細胞にプロ B 細胞からの b 細胞の開発</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>一般的な T 細胞抗原</td>
			<td>T リンパ球、ナチュラル キラー T 細胞および胸腺細胞</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>大きくグリコ接着タンパク質</td>
			<td>ナチュラル キラー細胞、ナチュラル キラー T 細胞</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>免疫グロブリンスーパーファミリー型膜貫通型糖タンパク質</td>
			<td>ヘルパー T 細胞、胸腺細胞、単球/マクロファージ、タイプ II 自然なキラー T 細胞</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>RPA T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>ジスルフィド分子複合体の α サブユニット</td>
			<td>細胞傷害性 T 細胞、胸腺細胞、ナチュラル キラー細胞のサブセット</td>
			<td>APC H7</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>一般的な白血球抗原</td>
			<td>リンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および胸腺を含むすべての人間の白血球</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS バッファー</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μ l</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。抗体のカクテル FACS パネル 2T および B 細胞の人口を識別する。記載されている抗体の量は 1 つのサンプルの分析のためです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マクロファージ パネル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲート名</td>
			<td># セル</td>
			<td>ライブの %</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセル</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブ</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>ダンプ-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B低/-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T 細胞、B 細胞、NK 細胞パネル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲート名</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>ライブの %</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセル</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブ</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK 細胞</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。付加価値税の異なる細胞型の免疫細胞豊富。生きた細胞の総量に基づいて各ゲート内のセルの数と異なった細胞のタイプの割合。

この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーを使用して、脂肪組織内に見られるさまざまな免疫細胞集団の表現型のために、ヒト脂肪組織から間質血管画分を単離することです。この方法は、肥満者の脂肪組織にどの免疫細胞がどの程度蓄積するかなど、代謝研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、免疫細胞上の複数のマーカーを同時に測定し、脂肪組織中のこれらの免疫細胞を同定および定量化できることです。この技術は、脂肪組織の炎症に関する重要な洞察を提供することができますが、他の臓器や組織にも適用できます。一般に、この技術に不慣れな人は、主に染色手順中に間質血管細胞の汚染と細胞の損失に苦労します。私の博士課程の候補者のうちの2人、Suzan WetzelsとMitchell Bijnenがプロトコールを実行します。メスを使用して、1グラムの脂肪組織生検を約2ミリメートル四方の小片に刻むことから始めます。ピースを50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、10ミリリットルのコラゲナーゼ溶液をサンプルに加えます。組織片を摂氏37度の水浴中で60分間、毎分60サイクルでインキュベートします。続いて、200マイクロメートルのストレーナーを介して新しい50ミリリットルの円錐管にろ過します。遠心分離する前に、フィルターを7ミリリットルのPBSですすいでください。次に、ピペットを使用して、ピペットチップ全体を溶液に沈めることなく上清を取り除きます。ペレットははっきりと見える必要があり、脂肪細胞による間質血管画分の汚染を避けるために、ほぼすべての上清を取り除く必要があります。間質血管細胞ペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSで懸濁し、70マイクロメートルのストレーナーを介して新しいチューブに間質血管画分をろ過します。遠心分離後、洗浄した間質血管画分ペレットを3ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に氷上で5分間懸濁します。次に、7ミリリットルのPBSで溶解を停止し、遠心分離によって細胞をペレット化します。フローサイトメトリー分析のために間質血管画分を染色するには、ペレットを摂氏4度の蛍光活性化細胞ソーティングまたはFACSバッファーの90マイクロリットルに再懸濁し、10マイクロリットルのヒトIgGで非特異的染色をブロックします。細胞懸濁液を96ウェルV底プレートの2つのウェル間で分割し、細胞を氷上に15分間置きます。インキュベーションの最後に、各サンプルを100マイクロリットルのFACSバッファーで洗浄し、遠心分離の終了時に上清を廃棄するためにタップすることなく、プレートを1回の滑らかな動きで逆さまにします。プレートを逆さまにする前に、プレートの底にペレットがはっきりと見えることを確認して、手順中に細胞が失われるのを防ぎます。最初のFACSパネル用に最初のペレットを29.5マイクロリットルの抗体カクテルに再懸濁し、2番目のペレットを23マイクロリットルの抗体カクテルに23マイクロリットルのFACSパネル用に再懸濁します。暗闇の中で氷上で30分間過ごした後、ウェルあたり150マイクロリットルのFACSバッファーで細胞を洗浄し、細胞ペレットを150マイクロリットルの1パーセントホルムアルデヒド溶液に固定します。各ウェルからの細胞懸濁液を適切な対応するFACSチューブに移し、サンプルを氷上に置きます。解析の前に、未染色のネガティブコントロールをフローサイトメーターにロードして、前方散乱光と側方散乱光のパラメータを設定します。次に、製造元の指示に従ってフローサイトメーターの電圧を調整し、対象のすべての集団が前方散乱グラフと側方散乱グラフに表示され、破片と生細胞を区別できるようになります。すべてのパラメータを設定したら、最初の実験サンプルを800rpmでボルテックスして細胞を完全に再懸濁し、サンプルをサイトメーターにロードします。ライブゲートで最低50, 000のイベントを読み取り、次にボルテックスを行い、ちょうど示したように分析のために2番目のサンプルをロードします。この代表的な実験で脂肪組織マクロファージ集団の解析を可能にするために、T細胞、B細胞、好中球およびナチュラルキラー細胞などの他の免疫細胞を除外して、CD11b + CD11c +マクロファージ、CD11B + CD11C-マクロファージ、およびCD11Blow-CD11C +樹状細胞の存在を明らかにした。これらの細胞の主な蛍光強度を定量すると、CD11B+CD11C+およびCD11Blow-CD11C+細胞上で血漿細胞様樹状細胞および一般的な樹状細胞マーカーが発現し、CD11Blow-CD11C+細胞では両方のマーカーの発現が高かったことが明らかになり、CD11Blow-CD11C+細胞が実際に樹状細胞であることが確認されました。CD45陽性細胞のゲーティングにより、CD19陽性B細胞集団およびCD3陽性T細胞集団が明らかになり、後者はさらにCD3+CD4+Tヘルパー、CD3+CD8+細胞傷害性T細胞サブセット、およびCD3-CD56+ナチュラルキラー細胞に細分化できる。次に、生存免疫細胞の割合を各被験者について計算し、肥満の成人男性被験者の内臓脂肪組織における炎症誘発性CD11B + CD11C +マクロファージの割合の有意な増加を明らかにしました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間以内に習得できます。この手順を試みる際には、バッファーと細胞画分を氷上に保つことが重要であり、細胞を抗体で標識する際には、それらを暗所に保つことが非常に重要です。開発後、この技術により、代謝研究の分野の研究者は、ヒトの脂肪組織における免疫細胞の変化を探求することができました。このビデオを見れば、脂肪組織免疫細胞を単離する方法と、これらの細胞でフローサイトメトリーを行う方法についてよく理解できるはずです。ホルムアルデヒドなど、感染性の可能性のある人体の物質や物質を扱っているため、危険な場合があることに注意してください。手袋と安全メガネを着用して、常に注意してください。

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

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医学

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この研究では、マウス呼吸器系の免疫集団を単離するための効果的で再現可能なプロトコルを提示する。また、9色ベースのフローサイトメトリーパネルを使用して、健康なマウスの肺に存在するすべての自然免疫細胞および適応免疫細胞を同定する方法も提供しています。...

マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

ここでは、ヒト皮下脂肪組織(hSATMVEC)から微小血管内皮細胞を単離、培養、および表現型決定するためのプロトコールについて説明します。さらに、hSATMVEC-脂肪細胞クロストークの実験モデルについても説明します。...

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

学ぼう フローサイトメトリーを用いた人脂肪組織からの免疫細胞分離と解析法。SVFを調製し、マクロファージやT細胞、B細胞、NK細胞などの免疫細胞サブセットを同定・定量化する手法を解説します。

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

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