フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション
2018年3月6日
この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーを使用して、脂肪組織内に見られるさまざまな免疫細胞集団の表現型のために、ヒト脂肪組織から間質血管画分を単離することです。この方法は、肥満者の脂肪組織にどの免疫細胞がどの程度蓄積するかなど、代謝研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、免疫細胞上の複数のマーカーを同時に測定し、脂肪組織中のこれらの免疫細胞を同定および定量化できることです。
この技術は、脂肪組織の炎症に関する重要な洞察を提供することができますが、他の臓器や組織にも適用できます。一般に、この技術に不慣れな人は、主に染色手順中に間質血管細胞の汚染と細胞の損失に苦労します。私の博士課程の候補者のうちの2人、Suzan WetzelsとMitchell Bijnenがプロトコールを実行します。
メスを使用して、1グラムの脂肪組織生検を約2ミリメートル四方の小片に刻むことから始めます。ピースを50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、10ミリリットルのコラゲナーゼ溶液をサンプルに加えます。組織片を摂氏37度の水浴中で60分間、毎分60サイクルでインキュベー
トします。続いて、200マイクロメートルのストレーナーを介して新しい50ミリリットルの円錐管にろ過します。遠心分離する前に、フィルターを7ミリリットルのPBSですすいでください。次に、ピペットを使用して、ピペットチップ全体を溶液に沈めることなく上清を取り除きます。
ペレットははっきりと見える必要があり、脂肪細胞による間質血管画分の汚染を避けるために、ほぼすべての上清を取り除く必要があります。間質血管細胞ペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSで懸濁し、70マイクロメートルのストレーナーを介して新しいチューブに間質血管画分をろ過します。遠心分離後、洗浄した間質血管画分ペレットを3ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に氷上で5分間懸濁します。
次に、7ミリリットルのPBSで溶解を停止し、遠心分離によって細胞をペレット化します。フローサイトメトリー分析のために間質血管画分を染色するには、ペレットを摂氏4度の蛍光活性化細胞ソーティングまたはFACSバッファーの90マイクロリットルに再懸濁し、10マイクロリットルのヒトIgGで非特異的染色をブロックします。細胞懸濁液を96ウェルV底プレートの2つのウェル間で分割し、細胞を氷上に15分間置きます。
インキュベーションの最後に、各サンプルを100マイクロリットルのFACSバッファーで洗浄し、遠心分離の終了時に上清を廃棄するためにタップすることなく、プレートを1回の滑らかな動きで逆さまにします。プレートを逆さまにする前に、プレートの底にペレットがはっきりと見えることを確認して、手順中に細胞が失われるのを防ぎます。最初のFACSパネル用に最初のペレットを29.5マイクロリットルの抗体カクテルに再懸濁し、2番目のペレットを23マイクロリットルの抗体カクテルに23マイクロリットルのFACSパネル用に再懸濁します。
暗闇の中で氷上で30分間過ごした後、ウェルあたり150マイクロリットルのFACSバッファーで細胞を洗浄し、細胞ペレットを150マイクロリットルの1パーセントホルムアルデヒド溶液に固定します。各ウェルからの細胞懸濁液を適切な対応するFACSチューブに移し、サンプルを氷上に置きます。解析の前に、未染色のネガティブコントロールをフローサイトメーターにロードして、前方散乱光と側方散乱光のパラメータを設定します。
次に、製造元の指示に従ってフローサイトメーターの電圧を調整し、対象のすべての集団が前方散乱グラフと側方散乱グラフに表示され、破片と生細胞を区別できるようになります。すべてのパラメータを設定したら、最初の実験サンプルを800rpmでボルテックスして細胞を完全に再懸濁し、サンプルをサイトメーターにロードします。ライブゲートで最低50, 000のイベントを読み取り、次にボルテックスを行い、ちょうど示したように分析のために2番目のサンプルをロードします。
この代表的な実験で脂肪組織マクロファージ集団の解析を可能にするために、T細胞、B細胞、好中球およびナチュラルキラー細胞などの他の免疫細胞を除外して、CD11b + CD11c +マクロファージ、CD11B + CD11C-マクロファージ、およびCD11Blow-CD11C +樹状細胞の存在を明らかにした。これらの細胞の主な蛍光強度を定量すると、CD11B+CD11C+およびCD11Blow-CD11C+細胞上で血漿細胞様樹状細胞および一般的な樹状細胞マーカーが発現し、CD11Blow-CD11C+細胞では両方のマーカーの発現が高かったことが明らかになり、CD11Blow-CD11C+細胞が実際に樹状細胞であることが確認されました。CD45陽性細胞のゲーティングにより、CD19陽性B細胞集団およびCD3陽性T細胞集団が明らかになり、後者はさらにCD3+CD4+Tヘルパー、CD3+CD8+細胞傷害性T細胞サブセット、およびCD3-CD56+ナチュラルキラー細胞に細分化できる。
次に、生存免疫細胞の割合を各被験者について計算し、肥満の成人男性被験者の内臓脂肪組織における炎症誘発性CD11B + CD11C +マクロファージの割合の有意な増加を明らかにしました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間以内に習得できます。この手順を試みる際には、バッファーと細胞画分を氷上に保つことが重要であり、細胞を抗体で標識する際には、それらを暗所に保つことが非常に重要です。
開発後、この技術により、代謝研究の分野の研究者は、ヒトの脂肪組織における免疫細胞の変化を探求することができました。このビデオを見れば、脂肪組織免疫細胞を単離する方法と、これらの細胞でフローサイトメトリーを行う方法についてよく理解できるはずです。ホルムアルデヒドなど、感染性の可能性のある人体の物質や物質を扱っているため、危険な場合があることに注意してください。
手袋と安全メガネを着用して、常に注意してください。
概要
この記事では、免疫細胞を分離し、フローサイトメトリーを用いて分析することで、脂肪組織の免疫細胞含有量を分析する方法について説明しています。この技術は、特に肥満の文脈において、脂肪組織内の免疫細胞集団に関する洞察を提供します。
主要な研究要素
科学分野
- 免疫学
- 代謝研究
- 細胞生物学
背景
- 脂肪組織における免疫細胞ダイナミクスの理解は代謝研究にとって重要です。
- フローサイトメトリーにより、複数の免疫細胞マーカーの同時測定が可能になります。
- 免疫細胞集団の同定は肥満における炎症の役割の解明に役立ちます。
- 課題には、間質血管細胞の汚染や染色時の細胞損失が含まれます。
研究目的
- ヒトの脂肪組織から免疫細胞を分離し分析すること。
- 肥満者における免疫細胞集団の構成を決定すること。
- 代謝研究において研究者が利用できるプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 細断された脂肪組織は、間質血管分画を分離するためにコラーゲナーゼで消化されます。
- 細胞はフローサイトメトリ分析のために特定の抗体で染色されます。
- フローサイトメーターで生細胞とデブリを区別するためのパラメータが設定されます。
- 炎症レベルを評価するために免疫細胞集団の定量化が行われます。
主要な結果
- 肥満被験者の内臓脂肪組織において、炎症促進マクロファージの有意な増加が観察されました。
- T細胞やB細胞を含む異なる免疫細胞集団が成功裏に同定されました。
- この技術により、脂肪組織内の免疫細胞の詳細なフェノタイピングが可能になります。
- 結果は肥満における免疫変化の理解に貢献します。
結論
- この方法は、脂肪組織の免疫細胞を研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- 他の組織や器官にも同様の分析に適用できます。
- プロトコルを適切に実行すれば、4時間以内に結果を得ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative immune cell profiling in human adipose tissue is critical for de-risking metabolic disease targets and clarifying inflammatory mechanisms in obesity-linked pathologies. Flow cytometry-based characterization of the stromal vascular fraction enables high-content, reproducible immune subset analysis, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by providing robust, quantitative data on immune cell dynamics in disease-relevant tissues.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell accumulation and phenotype in adipose tissue relevant to metabolic disease hypotheses.
- Supports biological de-risking by distinguishing pro- and anti-inflammatory macrophage subsets and other immune populations.
- Provides quantitative immune profiling to inform target validation and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immune cell subset identification for downstream assay development and screening workflows.
- Facilitates assay reproducibility and standardization through multiparametric flow cytometry panels.
- Enables scalable, quantitative readouts for immune cell composition in tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant human tissue, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling immune monitoring in human samples.
- De-risks mechanistic assumptions about inflammation in metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust immune cell analysis in human adipose tissue biopsies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell infiltration and phenotype in metabolic disease.
- Screening: Provides standardized, quantitative immune cell subset data for assay readiness.
- Analytics: Delivers multiparametric measurements and gating strategies for comparative immune profiling.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics in human tissue to preclinical and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues and marker panels, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-driven disease models.
- Operational Value: Standardizes immune cell phenotyping with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying immune mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and inflammatory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and immune cell marker selection.
- Needs access to high-parameter flow cytometers and validated antibody panels.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and gating strategies.
- Adaptable to other tissues but may require protocol optimization for different sample types.
- Attention to cell loss and contamination is critical for reproducibility and data quality.
