Name: 準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ脂肪酸リポソームの調製・精製法を用いた合成生物学と生命起源研究における人工原細胞構築手法。薄膜形成、再水和、膜ろ過、ゲル濾過カラムによる精製プロセスを含む実験プロトコルです。

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溶接学会概要は、ハワード ヒューズ医学研究所の研究員です。この仕事は一部に溶接学会概要にサイモンズ財団から助成金 (290363) によって支えられました。A.E.E. と K.P.A. の両方は、ミネソタ大学スタートアップ資金からサポートを認めます。

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

脂肪酸から形成されるリポソームは、高透磁率、動的プロパティによる原始細胞の潜在的なモデルとして多くの人に提案されています。単鎖脂肪酸のカルボキシル ヘッドのみを自己制限 pH 範囲内膜に許可し、結果膜、塩の存在に非常に敏感。その結果、脂肪酸小胞異なる準備およびリン脂質ベシクルと比較してメソッドの処理が必要です。
このプロトコルでは、リポソームを形成する例としてオレイン酸を使用して他のロング チェーン不飽和脂肪酸 (C14) 及びその誘導体 (ca. ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、および対応するアルコールとグリセリンのエステル) も小胞を形成総脂質濃度は、cmc と水分補給バッファー pH の上がある限り薄膜水分補給方法を次は、膜内脂肪酸の pKa に近いです。トリス塩酸バッファーは、このプロトコルで使用する以外他のバッファー システム (ca. ビシン、リン酸、ホウ酸塩) はリン酸塩やホウ酸バッファーで形成される小胞は通常かなり漏れ13脂肪酸小胞形成をサポートする報告されました。水分補給後結果脂肪酸小胞は多と多重が、前述の押し出しによって小さな径ベシクルに簡単に変換されます。小さい小胞を生成するための代替方法として超音波処理と比較して、押出は、別孔サイズの膜を適用することによって小胞サイズのコントロールのより多くのオプションを提供します。押出後小胞は膜の孔径よりやや大きい通常が、押出成形サイクルの数を増加させると、狭いサイズ分布と膜孔径に近い平均サイズ小胞を得ることができます。
機能作成を合成するために脂肪酸小胞はホスト特定の生化学的な反作用は、RNA または他のビルディング ブロックのカプセル化に起因する必要があります。薄膜水分補給方法は、目的の内包物を含むフォーム小胞に簡単な方法を提供します。ただし、カプセル化効率は比較的低い、RNA など貴重な資料の大部分は浄化プロセスの間に通常失われます。いくつかのケースで、押出の前に繰り返し凍結融解によってカプセル化効率を控えめに改善できます。マイクロりん脂質リポソームの高収率作製法脂肪酸小胞類似方法がまだ開発されていませんがほぼ 100% カプセル化効率を可能にします。
反応速度の精度に影響を与える可能性があります素材をカプセル化処理キレート化無料 Mg2 +、その後マグネシウムのソリューション、及び再精製各時点の除去を保証する前に浄化と吹き込む流出しました。ベシクル内測定。各浄化は、良好な分離を達成するために、小胞の分数を収集するために、少なくとも 10 分を取る、ので高速反応の解析は困難であり、反応は列及び再精製する前に停止する必要があります。
ここでは提示プロトコルはよく模倣して原始的な細胞で発生する反応をホストする脂肪酸リポソームの構築に適しています。私達のプロトコルはまた、生体の配信システムとその他の生化学的な反作用のバイオリアクターの開発の潜在的なアプリケーションを有効にします。

リポソーム、または小胞-両親媒性脂質の二重膜で囲まれた区画 - は、多数のバイオメディカル分野で、配送車両の合成開発、医薬品、細胞膜のモデルとして、使用を発見しました。セルです。私たちと他の人も初期の生活の中の原始的な細胞膜のモデルとしてリポソームを採用しています。1,2,3,4通常、このようなシステムを用いてこれらの分子は近代的な電池を採用コード化された蛋白質の酵素の利点なしで合成するより簡単な (例えばオレイン酸)、1 つだけ脂質炭化水素の尾を含む単一鎖両親媒性物質。
単一鎖脂質から成るリポソーム diacylphospholipids から形成されたものと類似している (例えば1-パルミトイル-2-オレオイル -sn- グリセロホスファチジン-3-phosphocholine、または POPC) 境界は二重膜で構成されるという点で。リポソームの脂質のいずれかのクラスから形成された溶存ペイロードを保持することができますと、縮小・異なった技術によって精製できます。単一鎖脂質のユニークな化学的特徴からいくつかの重要な違いの結果。リン脂質によって形成される小胞は、脂肪酸小胞、小胞の準備のためある特定の pH のバッファーを必要とする中性ないし弱塩基性 pH (ca. 7-9) で安定しているだけ広い pH 範囲で安定しています。ほとんどの時間、区分の生化学的な反作用または単純な蛍光染料 (例えばカルセインのため、このバッファーは小胞のカプセル化、どちらかの材料 (例えばRNA) をすることができます特定の水溶性分子を含めることができますも) 小胞のキャラクタリゼーションのため。
のみ 1 つの炭化水素の鎖の存在は、両方の溶質をより透過性だけでなくよりダイナミックな膜を生成します。また、カルボン酸頭のグループ (例えばMg2 +) 塩と 2価の陽イオンの存在に敏感な小胞の脂肪酸の結果に存在。マグネシウムは、まだ生命の起源研究の生化学反応を触媒するため最も重要な二価のカチオン類のひとつです。洗練された蛋白質の酵素の進化前の初期の人生の RNA 自己複製を触媒を実行するデュアル機能のための支配的な高分子であったかもしれません。マグネシウム必要とする RNA の 1 つの代表的な例は関連の反応は非酵素的 RNA コピー、1960 年代に初めて明らかにしました。5化学的に活性化された RNA ヌクレオチド (すなわち2 反応に対する生体のヌクレオチド) は複雑な既存プライマー テンプレートにバインド、プライマーの 3' ヒドロキシル グループ攻撃を転置するため隣接する活性モノマーの 5' リン酸残してグループ (すなわち2-methylimidazole)、およびフォーム新しいのリン酸ジエステルが付着します。この RNA のコピーの化学では、高濃度 Mg2 +、脂肪酸吹き込むと互換性があるためにキレート環を作る必要がある必要があります。6別の Mg2 +-依存性反応は、おそらく最も特徴付けられる触媒 RNA であるハンマー ヘッド型リボザイムによって触媒されます。2 つの短いオリゴヌクレオチドから再構成することができる、このリボザイムは、ゲルの転位によって監視に便利です自己開裂反応を実行します。など、それは頻繁にモデル リボザイムとして生命の起源の研究で採用です。7リガンド非結合状態のマグネシウムのこのリボザイムによって要件によるリポソームでマグネシウムに安定している脂肪酸グリセロール エステル脂肪酸の混合物で構成されています。8,9でこのプロトコルを提案手法を我々 は準備、操作、これらの小胞のキャラクタリゼーションを開発し、ホスト非酵素 RNA のコピーとハンマー ヘッド型リボザイムに吹き込むとしてこれらの小胞のアプリケーションを示す触媒。

<table><tbody><tr><td>セホロース 4B</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>4B200</td><td></td></tr><tr><td>カルセイン</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>C0875-10G</td><td></td></tr><tr><td>tris-HCl pH8.0 1M</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>AM9851</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>251275-500G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>71690-250G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマ</td><td>30614</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Nu-Chek</td><td>U-46-A</td><td></td></tr><tr><td>グリセロールモノオレイン酸</td><td>Nu-Chek</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhodamine-PE</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>L1392</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャー/サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>シークアゲル濃縮物</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-830</td><td></td></tr><tr><td>シークエーゲル 希釈液</td><td>ナショナル ダイアグノスティック</td>ス <td>EC-840</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-尿素ゲル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EC68852BOX</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>titon-100x</td><td>シグマ アルドリッチ インク</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNAプライマー</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td><td></td></tr><tr><td>RNAテンプレート</td><td>IDT</td><td>5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td><td></td></tr><tr><td>ハンマーヘッド基板ストランド</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td><td></td></tr><tr><td>ハンマーヘッド リボザイムストランド</td><td>IDT</td><td>5'GGC UCG ACU GAU GAG GAG GCG</td><td></td></tr><tr><td>vesicle 押出機セット</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクター</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>171041</tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Fisher</td><td>NC9995941/675</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax i3</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Nikon Nikon</td><td>A1R MP 共焦点</td><td></td></tr><tr><td>ゲルスキャナー</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon 9410 スキャナー</td><td></td></tr></tbody></table>

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、これらの両親媒性分子のユニークな化学的性質による diacylphospholipids を含むと比較して異なるプロパティを示します。特に、脂肪酸リポソームは、単一鎖両親媒性の比較的高い容解性のための動的キャラクターを強化します。同様に、遊離脂肪酸を含むリポソームはカルボン酸頭部基と金属イオンとの間の強い相互作用のための塩と 2価陽イオンにより敏感です。ここでは、準備、浄化、および一部で構成されるリポソームの使用または単一のチェーン両親媒性物質 (例えばオレイン酸) の全体のためのテクニックを示しています。

我々 は通常、サイズ排除カラムにリポソーム浄化を実行します。典型的なリポソーム製剤には、いくつかの種類の蛍光体が含まれています。リポソームの生成および押し出しとき、カプセル化する種リポソームの内外の両方に存在しています。サイズ排除樹脂 (セファローズ 4 b) リポソームを浄化することによって大きいリポソームは、溶出させ (図 1 a)、カプセル化されていない溶質が樹脂の細孔内に保持されます。分数を収集し、通常蛍光対分数番号 (図 1 b) をプロットは、収集され、後続のアプリケーションで使用されているリポソームに対応する初期溶出画分と 2 つピーク トレースが得られます。
よくされたリボザイムと蛋白質による RNA ポリメラーゼの出現の前に RNA 複製の可能性が高いことを意味非酵素的プライマー拡張反応を調べた。これらの反応は通常活性モノマーによって拡張されている蛍光標識プライマー (図 2 a) を採用しています。これらの反作用はゲルの電気泳動 (図 2 b) によって監視でき、結果エレクトロフェロ統合した所定の反応条件 (図 2) の速度定数を取得します。
吹き込む内に RNA を機能することことを示すため、我々 はモデルの RNA の触媒反応としてハンマー ヘッド型リボザイムの自己切断 (図 3 a) を採用しています。この反応が必要無料 Mg2 +触媒化学、容易にするために、5 mM Mg2 +の存在下で安定しているので、したがって我々 は OA/遺伝子組み換え小胞を使用します。プライマー拡張反応と同様に、ハンマー ヘッド型リボザイム自己開裂反応することができますゲル電気泳動法 (図 3 b) によって監視され、特定の条件 (図 3) の下の速度定数を取得するを後で分析します。
我々 は、リポソーム両方の蛍光を採用し、透過光をイメージします。リポソームは、蛍光の脂質膜ラベル (図 4 a) を与える、または (図 4 b)、ルーメン内の蛍光溶質を使用ラベル付けできます。(また図 4 bに示すように) 小胞を観察する透過光を使用もできます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">クロロホルムでは表 1.1 純粋なオレイン酸</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コンポーネント</td>
			<td>株式</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オレイン酸</td>
			<td>&gt; 99%</td>
			<td>11.7 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">クロロホルム</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">表 1.2 オレイン酸とグリセリン モノオレート クロロホルム (9:1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コンポーネント</td>
			<td>株式</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オレイン酸</td>
			<td>&gt; 99%</td>
			<td>10.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">グリセリン モノオレート</td>
			<td>&gt; 99%</td>
			<td>1.4 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">クロロホルム</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">表 1.3 オレイン酸 0.2mol% ローダミン PE クロロホルム</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コンポーネント</td>
			<td>株式</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オレイン酸</td>
			<td>&gt; 99%</td>
			<td>1.6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">クロロホルムのローダミン PE</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">クロロホルム</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。脂肪酸クロロホルム ソリューション。
<img alt="カルセイン小胞クロマトグラフィープロセス;分離結果を示す図と蛍光グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1。精製率の小胞浄化と蛍光特性評価。A.無料カルセイン セファローズ 4 b カラム上からカルセインを含む小胞の分離。B.小胞と分別後よく数対各ウェル内の蛍光をプロットすることによって無料のカルセイン ピーク検出。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="DNA伸長プロセス図、ゲル電気泳動結果、速度論解析グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2。OA ベシクル内非酵素 RNA の複製。A.の非酵素的 RNA プライマー拡張方式。B.純粋なオレイン酸ベシクル内、セクション 4 の条件でプライマー拡張反応のページのイメージ。C.線形プライマー時点時間以上 30 h. 反応速度対のプライマーの初期量に与えられた残りの量の比の自然対数のフィット、ln (Π/P0) 対時間の斜面から計算、0.058 h-1です。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="RNA切断図、ゲル電気泳動、速度論的分析チャート。Cy3標識基板プロセス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3。OA/遺伝子組み換え小胞でハンマー ヘッド型リボザイム切断。A.の蛍光に分類された基板ストランド (top) のハンマー ヘッド型リボザイム切断方式。B.ハンマー ヘッド型リボザイム切断 5 mm Mg2 +OA/遺伝子組み換えベシクル内のページのイメージ。ベシクル内C.リボザイム活動。基板の特定の時点で残りの量の比の自然対数の線形フィット最初 4 h 反応で時間対基板の初期量に ln (S/S0) 対時間の傾きから算出率は 0.36 h-1。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="脂質小胞、蛍光イメージング、位相差の二重顕微鏡画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4。顕微鏡検査のための巨大な脂肪酸小胞。A.ローダミン PE の共焦点顕微鏡画像ラベル オレイン酸小胞、スケール バー 10 μ m。B.オレイン酸 Alexa488 を含む分子膜ベシクルの共焦点顕微鏡画像の付いた RNA 膜透過検出 (TD) チャネル、スケール 5 μ m バーで示されています。

単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、一本鎖両親媒性分子のユニークな化学的性質によるこれらの含まれている diacylphospholipids と比較して異なるプロパティを示します。ここで準備、精製、および一部で構成されるリポソームの使用またはこれらの両親媒性分子の全体のための手法について述べる。

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

この手順の全体的な目標は、脂肪酸の一部または全部で構成されるリポソームを調製、精製、および使用することです。この方法は、合成生物学や生命起源研究における、最小細胞の定義や人工原始細胞の構築など、重要な疑問に答えるのに役立ちます。このプロトコールの主な利点は、高収率の単分散脂肪酸小胞を作製し、それらをさまざまな実験条件で処理するための簡単で安価な方法を導入することです。一般に、この方法に不慣れな個人は、脂肪酸小胞がリン脂質小胞よりも繊細であるため、特に乾燥脂質の薄膜を調製するには、ガスタイトシリンジを使用して、クロロホルム中の特定の量の脂質をガラスバイアルに移します。ヒュームフード内の窒素またはアルゴンの流れの下でクロロホルムを蒸発させます。得られた薄膜を少なくとも2時間ハウス真空にさらして、残留クロロホルムを除去します。この時点で、脂質は一晩真空下に置いておくことができます。小胞を再水和するには、250マイクロリットルの水和バッファーを空のチューブにピペットで入れ、次に1.875マイクロリットルの10モルの水酸化ナトリウムを追加して、最終的な75ミリモルベースにします。溶液を乾燥脂質の薄膜に移して、総脂肪酸濃度が0.15モルの小胞を形成し、次に高速ボルテックスを使用して、得られた混合物を4〜5秒間ボルテックスします。低速回転シェーカーで脂質緩衝液混合物を攪拌し、一晩で再水和します。均一なサイズの小胞を生成するには、ピンセットを使用して、リポソーム押出機のシリンジポートの各内面に1つのフィルターサポートを適用します。各フィルターサポートを250ミリモルのTris-HCL pH 8で濡らします。ピンセットを使用して、100ナノメートルのポリカーボネート膜に1つのトラックエッチングを押出機のOリングとフィルターサポートの1つに適用します。メンブレンが破れたり穴を開けたりしないように注意しながら、メンブレンをOリングにそっと押し込み、2つの表面がしっかりと接触するようにします。次に、メンブレンとフィルターサポートがずれないように注意しながら、押出機を組み立てます。エクストルーダーシリンジに約0.5ミリリットルの250ミリモルTris-HCL pH 8を充填します。このシリンジを押出機の片側に挿入します。空のシリンジを押出機の反対側に挿入します。プランジャーとシリンジ入りバッファーを手でゆっくりと押し、トラックエッチングされたメンブレンが所定の位置に存在し、損傷していないことを示す抵抗が感じられることを確認します。メンブレンを置かずにこの手順を練習すると、予想される抵抗レベルを測定するのに役立ちます。2 本のシリンジを取り外して空にします。この段階で2つのシリンジを洗浄する必要はありません。なぜなら、それらはリポソーム調製物と同じ組成の緩衝液を含んでいるからです。次に、リポソーム調製物を2つのシリンジのいずれかにロードします。左側に小胞サンプルが入ったシリンジ、右側に空のシリンジを使用して、押出機を組み立て直します。次に、小胞サンプルを含むシリンジのプランジャーを手で非常にゆっくりと押します。押出機の右側にあるシリンジを注意深く観察します。クリアバッファーは、押出機の内部デッドボリュームにより、最初に押出機の右側に入り、その後に押し出されたリポソームの小さなプルームが続きます。この時点ですぐに押すのをやめてください。エクストルーダーの右側にあるシリンジを取り外し、溶液を廃棄します。エクストルーダーの右側にあるシリンジを交換し、左のシリンジが空になるまで押し出します。押出機の向きを逆にして、シリンジの交換を繰り返します。必要なサイクル数だけ続行します。奇数は常に、もともと未押出のリポソームが含まれていたシリンジからリポソームが収集されないようにするために使用されます。最後に、右シリンジの内容物をエッペンドルフチューブに静かに分注します。チューブを低速回転シェーカーに約30分間置きます。小胞精製移動相を調製するには、15 ミリリットルの Falcon チューブに 5 ミリリットルの 250 ミリモル Tris-HCL pH 8 水和バッファーを調製します。次に、37.5マイクロリットルの10モルの水酸化ナトリウムを水和緩衝液に加えます。235マイクロリットルの純粋なオレイン酸をファルコンチューブにピペットで注入し、0.15モルの総脂質を含む小胞溶液を得ます。次に、高速ボルテックスを使用して、混合物を4〜5秒間ボルテックスします。その後、低速回転シェーカーで少なくとも2時間転がります。この時点で、脂質調製物は回転するシェーカーに一晩放置することができます。0.22 ミクロンのシリンジフィルターユニットで移動相をろ過し、潜在的な凝集体を除去します。小胞を精製するには、まずテキストプロトコールに詳述されているようにセファロース4Bカラムを調製し、レトルトスタンドにクランプします。次に、カラムの先端をストップコックコネクタに接続し、チューブをフラクションコレクターに接続します。バッファーの別の部分を追加してチューブを洗い流し、カラム内の液面が樹脂の上部に近づいたらストップコックを閉じます。次に、レジンベッドやカラム壁に触れずに、ベシクル調製物をできるだけ均一にレジンに塗布するように注意しながら、200マイクロリットルのピペッターを使用して、押し出したベシクルをレジンの上部に塗布します。ストップコックを開いてフローを開始し、フラクションを96ウェルプレートに集め始めます。緩衝液が枯渇するにつれて、レジンベッドの上部にベシクル精製移動相を0.5〜1ミリリットルずつ塗布し、レジンベッドが乾燥しないように注意します。次に、溶離液を5滴の画分で収集し、少なくとも36ウェルを収集します。精製フラクションの特性評価を行うには、プレートリーダーで96ウェルプレートを読み取ります。結果の蛍光データを蛍光対小数としてプロットします。小胞が最初に溶出し、次にカプセル化されていない画分が溶出します。配位子マグネシウムを使用する場合は、塩化マグネシウムとクエン酸カリウムを250ミリモルのTris-HCL pH 8緩衝液に指定の比率でプレミックスします。ここでは、安定なオレイン酸小胞に対して1対4の比率が用いられます。常にマグネシウムとリガンド溶液をプレミックスすることを忘れないでください。脂肪酸小胞を非キレート化マグネシウムだけにさらさないでください。予混合されたクエン酸マグネシウム溶液を小胞サンプルに加えます。混合物を短時間ボルテックスします。テキストプロトコルに記載されているように、再精製する前に、小胞サンプルをタンブラーに少なくとも30分間放置します。小胞サンプルと同じ濃度のマグネシウムとクエン酸塩を再精製移動相に必ず添加してください。テキストプロトコルに記載されているように、マグネシウム溶液を精製小胞と混合して、自己切断反応を開始します。速度論的研究では、各時点で 100 マイクロリットルの混合物を採取し、移動相として 250 ミリモルの Tris-HCL pH 8 を使用したセファロース 4B サイズ排除カラムでこのアリコートを直接再精製します。小胞画分を収集します。テキストプロトコルに記載されているように、RNAローディングサンプルを調製します。市販の15%TBE尿素ゲルをゲルボックスに入れ、ゲルボックスに1X TBEゲルランニングバッファーを充填します。サンプルを摂氏80度のヒートブロックで1分間加熱した後、ウェルごとに各サンプルの5マイクロリットルをロードします。ゲルを一定の200ボルトで約1時間泳がせます。最後に、ゲルをスキャンし、分析プログラムで定量します。RNAがプロトセル内で機能することを実証するために、蛍光標識された基質鎖を用いたハンマーヘッドリボザイム自己切断をモデルRNA触媒反応として用いた。この反応には、触媒作用を促進するために遊離マグネシウムが必要です。したがって、オレイン酸/モノオレイン酸グリセロール小胞は、5ミリモルのマグネシウムの存在下で安定であるため、使用されました。シュモクザメリボザイムの自己切断反応は、ゲル電気泳動によってモニターできます。ページ画像を定量化した後、特定の時点に残っている基板の量と初期基板量と時間の比率の自然対数の線形近似が生成されます。このプロットは、リボザイム活性の計算に使用できます。一度習得すると、カプセル化された色素またはRNAを含む脂肪酸リポソームを調製し、24時間以内に精製することができます。この手順を試みる際には、適切なpH範囲で脂肪酸リポソームを形成し、小胞の溶解を避けるために総脂質濃度を脂質の臨界凝集濃度以上に保つことを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、脂肪酸リポソームの調製方法と、脂肪酸リポソームを使用して生化学反応をホストする方法をよく理解できるはずです。

preparation-purification-and-use-of-fatty-acid-containing-liposomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

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