Name: マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶマウス膵島細胞の分離法と活性酸素種誘導化学物質のスクリーニング技術。環境化学物質の糖尿病誘発リスクを評価するin vitroアッセイ手法を解説します。

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この作品は、CREH センター主催 NIEHS、国家自然科学基金の中国 (第 31572626) からパイロット プロジェクトの助成金によって支えられました。

すべての動物実験は、すべての関連するガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行されました。例示されているプロトコルは、指導と承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、テキサス A & M 研究所のゲノム医学の下で行った。
1. ソリューションの準備
<ol><li>ダブル蒸留 H2O, 1 x 10 x ハンクのバランスの取れた塩溶液を希釈し、4 ° C で保存</li>
	<li>HEPES (10 mM)、MgCl2 (1 mM)、グルコース (5 mM) を追加して、分離ソリューションを準備します。PH 7.4 に調整して氷の上。</li>
	<li>コラゲナーゼ タイプ 4 からコラゲナーゼの解決を準備します。 注:具体的には、コラゲナーゼ タイプ 4 には、乾燥重量の mg 当たり 160 U が含まれています。1 グラム コラゲナーゼ タイプ 4 は 5 mL 二重蒸留 H2O 200 Mg/ml の濃度で希釈しました。30 mL の氷冷分離ソリューションに希薄のコラゲナーゼの 2 mL が追加され、コラゲナーゼ溶液 6 mL が各マウスの 50 mL チューブに転送されます。</li>
	<li>1 mM CaCl2を分離ソリューションに追加することで洗浄液を準備します。</li>
	<li>浄化液の冷たい polysucrose/ナトリウム diatrizoate (1.1119 g/mL、5 mL) を準備します。</li>
	<li>RPMI 培地への L-グルタミン (20 mM)、(100 U/mL) ペニシリン、ストレプトマイシン (100 μ g/mL)、ウシ胎児血清 (FBS) (10%) の追加によって膵島培養液 500 mL を準備します。</li>
	<li>蒸留水 200 μ M で、-20 ° C で店で粉体を溶解することにより DCFH DA 原液を準備します。 注:染色液ロスたて、DCFH DA RPMI で 5 μ M の最終的な集中に原液を希釈することによって行われます。この試薬は、光から保護する必要があります。</li>
</ol>2. 手術の準備
<ol><li>腹腔内注入 (i. p.) タヴェルタン (2.5% タヴェルタン、0.4 mL/20 g) 付きのマウス。マウス麻酔が完全に応答しなくなった後ハインドに足をつまみ、マウスを安楽死させるし、生物のフードに移動します。</li>
	<li>腹部側を上に euthanized のマウスを置き、殺菌のための 70% のエタノールで皮膚をスプレーします。</li>
	<li>腹部に 1 cm U 切開で腹腔内を開き、腹腔内を公開する胸の上の吻側方向に皮膚を撤回します。</li>
</ol>3. 膵灌流と除去
<ol><li>図 1に示すように、乳頭部の場所を見つけます。オディ括約筋の位置の近くに十二指腸をクランプするのにカーブタイプ鉗子のペアを使用します。十二指腸に胆汁経路をブロックするのに十二指腸の壁をクランプするのにカーブタイプ鉗子の別のペアを使用します。 注:この手順では、乳頭が挿入されていません。この手順は、十二指腸で胆汁の経路をブロックするものです。</li>
	<li>頭の近位と遠位研究者に関しての足を使って、マウスの位置を変更します。</li>
	<li>総胆管を見つけるし、30 G 針、5 mL 注射器でゆっくりとコラゲナーゼ溶液 3 mL を注入します。総胆管と膵臓注入後膨張していることを確認します。</li>
	<li>下降結腸、腸、胃と脾臓から分離するカーブタイプ鉗子と罰金のはさみを使用して膨張した膵臓を削除します。コラゲナーゼ溶液 3 mL を含む 50 mL チューブに膵臓を置く氷の上保管してください。</li>
</ol>4. 膵消化
<ol><li>37 ° C の水浴に各 50 mL チューブを配置します。15-20 分間インキュベート (ひずみとマウスの年齢時間異なります)。</li>
	<li>渦を使用して管を振動させます。</li>
	<li>4-5 大型滅菌シンク ストレーナーの消化膵臓をプール、スクープを使用して、徹底的にバラバラ膵臓。強制的に画面オフ消化細胞をピペットに 23 G 針、10 mL シリンジを含む洗浄液を使用します。50 mL チューブの洗浄ソリューションを収集します。</li>
	<li>4 ° c 1 分 97 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。</li>
	<li>チューブに洗浄溶液 25 mL を追加し、再穏やかなボルテックスによって組織を中断します。4 ° c 1 分 97 x g で組織をスピンし、上清をデカントします。3 回繰り返します。ペレットの組織が外れないように注意してください。</li>
</ol>5. 島の精製
<ol><li>洗浄組織ペレットに浄化溶液 10 mL を追加し、軽く内容を再懸濁します。</li>
	<li>優しく浄化ソリューションに分離溶液 5 mL をオーバーレイします。2 つのソリューション間の鋭い液体インターフェイスを保つように注意します。</li>
	<li>低速の加速と 15 分のための 4 ° C で g x 560 でないブレーキ管を遠心します。インターフェイスにピペットを挿入し、新しい 50 mL チューブに小島層を収集します。</li>
	<li>3.5 の手順で説明されているように島を洗います。</li>
</ol>6. メッキと膵島細胞の治療
<ol><li>膵島培養液の 10 mL で小島を再懸濁します、ゆっくり、混ぜると、96 ウェル プレートにマルチ チャンネル ピペットを 100 μ L/ウェル。まあ 96 あたり約 5 小島を配置します。</li>
	<li>12 h の組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。</li>
	<li>遠心分離機 (112 x g) の 96 ウェル プレート、培養培地を取り外します。</li>
	<li>膵島培養液中の環境汚染物質を希釈します。プレートの別の井戸に化学の希釈剤のそれぞれの 100 μ L を追加します。各ウェル中の小島を再懸濁します、37 ° C (異なる環境化学物質の濃度変化) で 12 時間孵化させなさい。</li>
</ol>7. ROS 染色と測定
<ol><li>1x PBS で洗浄小島治療後 (各 96 ウェルの 200 μ L)。 注:化学物質の濃度は以下の通りです: AFB1: 3 μ M、アトラジン: 100 μ M、BaP: 10 μ M、BPA: 100 μ M, PCB126 β エストロゲン: 10 μ M、ノニルフェノール、ビスフェノール A: 100 μ M。</li>
	<li>活性酸素を抑制するのに抗酸化物質として N アセチルのシステイン (NAC) を使用します。ROS 誘起化学希釈剤に NAC の 5 mM を追加し、37 ° C で 12 時間インキュベート</li>
	<li>112 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、37 ° C, 60 分で蛍光プローブ (H2 DCFH DA RPMI メディアで解散) の 5 μ M 溶液で孵化させなさい。</li>
	<li>PBS で 3 回処理した膵島細胞を洗浄し、488 のマイクロ プレート リーダーで蛍光を測定 nm。 注:530 で蛍光性の増加によって測定されるセルの DCF の蓄積サンプルは 488 で興奮すると nm nm。</li>
	<li>活性酸素を誘発する異物にグルコース刺激によるインスリン分泌 (GSIS) 試金9を実行膵島の生理機能上異物の影響を測定する未処理の島と島を扱われます。</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

環境化学物質への曝露を示唆している証拠の蓄積 2 型糖尿病の開発の重要な役割を果たしています。化学物質による活性酸素は、2 型糖尿病の発展に貢献する潜在的な病因因子として認識されています。人間は、生体異物の化学薬品の広い範囲にさらされている、膵毒性物質を効果的に識別し、膵臓の細胞に固有の毒性のメカニズムを調査する新しい研究技術のための大きい必要があります。
パブリッシュされた手順14、に基づいて、本研究で我々 は膵細胞への酸化ストレス誘起損傷の生体異物の化学物質と細胞マウスと画面から膵島を分離するためのプロトコルを開発しました。我々 はまた異物化合物による膵の特定の毒性反応を調査するのにこの手順を使用します。マウスから膵臓を取得、血糖値は変わりませんし、膵臓15,16,17の血管には影響しませんので、他の麻酔上タヴェルタンを使うことが望ましい。密度勾...

2 型糖尿病の有病率の増加は、近年公衆衛生1に深刻な脅威に地球規模の健康危機をなっています。多くの要因が見つかっている間、2 型糖尿病の開発にリンク作因的に定期的な示唆これらの要因の 1 つの一般的な収束点である過剰な活性酸素2の世代につながる酸化ストレス誘導,3。
Pcb、ダイオキシン、BaP など環境化学物質の広いスペクトルは、膵 β 細胞の機能を損なうし、インスリン抵抗性と 2 型糖尿病4につながる可能性のある酸化ストレスを誘導するために発見されています。活性酸素の生理学的なレベルでは、細胞機能に重要な役割を果たしている、抗酸化システムの容量を超える ROS への暴露細胞/組織に損傷の結果、5疾患に 。膵 β 細胞抗酸化酵素の低レベルを表現、従って酸化ストレスを介した損傷6、7のための敏感なターゲット。ストレスによる膵細胞機能不全5が発生する活性酸素の高レベルへの慢性露出が示されている8の肝臓や脂肪組織でのインスリン抵抗性と同様。
このプロジェクトの全体的な目標は、膵臓の細胞内活性酸素の誘導に基づく彼らの糖尿病誘発電位のスクリーン化学物質に細胞ベースのアッセイを開発することです。膵臓は、代謝解毒を欠いているし、異物による損傷6,7の重要なターゲットであります。したがって、膵臓細胞で生成された ROS を直接測定することにより、この試金は化学的に誘導膵損傷の直接近似を提供しなければなりません。このメソッドを開発するには、マウス膵ランゲルハンス島の分離、化学物質、細胞培養条件下で分離膵島を培養し、読み出しとして化学誘導活性酸素生成を利用します。この手順はシンプルで孤立した小島に ROS を誘発する化学物質を識別するに効果的膵臓体外に固有の毒性発現機構の解明にはさらに開発できます。

<table><tbody><tr><td>10回;ハンクの平衡塩溶液&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 4型</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>ポリスクロース/ジアトリゾ酸ナトリウム溶液&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-ジクロロフルオレセイン (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>蛍光マイクロプレートリーダー&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Σ</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>アバーチン</td><td>Σ</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>ラット/マウス インスリン ELISA キット</td><td>ミリポア</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>96ウェルプレート用 遠心分離</td></tr>機 <tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>蛍光読み取り用</td></tr></tbody></table>

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

人間や動物の特定の環境化学物質への暴露は、2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の開発につながる膵臓 β 細胞の細胞損傷を引き起こす発見されています。化学的に誘導 β 細胞障害のメカニズムが明白でなく、複雑になる可能性があります、1 つの定期的な発見は、これらの化学物質への損傷を引き起こす過剰な活性酸素種 (ROS) の生成につながる酸化ストレスを誘発します。β 細胞。C57bl/6 マウスの膵島細胞および 96 ウェルの細胞培養プレートに培養膵島細胞は、潜在的な糖尿病誘発環境化学物質を識別するに分離されました。膵島細胞が化学物質を投与し、2', 7'-ジクロルフルオレッセン (DCFH-DA) 蛍光色素による活性酸素生成が検出されました。このメソッドを使用すると、我々 は [] ピレン (BaP) やポリ塩化ビフェニル (Pcb) そのビスフェノール A (BPA)、ベンゾを発見、彼らは潜在的膵島細胞の損傷を引き起こす可能性があります示唆 ROS の高レベルを引き起こすことができます。このメソッドは、糖尿病誘発物質をスクリーニングするために役立ちます。さらに、培養された膵島細胞膵臓細胞に毒性を化学的に誘導の in vitro解析の適応もあります。

健全な分離膵島の顕微鏡写真に示す図 2小島が (ただし、サイズ均一性ひずみに異なります) サイズを比較的均一に円形または楕円形をしています。次に膵島を分離し、文化島のインスリン分泌を刺激することでの in vitroアッセイにおける膵島機能を調べた。3.3 〜 16.7 mM グルコース9による C57BL/6 マウス孤立島から情報科学研究科試金の典型的な分析を図 3に示します。
プレート形式画面メソッドを使用して、膵島細胞 (図 4) で ROS の重要な誘導を引き起こしたいくつかの化学物質を同定しました。Β エストロゲンが膵島を10、<s...

ここで潜在的な糖尿病誘発異物化学物質を識別するために、化学物質によって ROS の帰納法をスクリーニングするためのマウスの膵島細胞を分離するためのプロトコルを提案する.

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

膵臓細胞は、2型糖尿病の発症に関連するROS誘発性損傷の敏感な標的です。膵臓細胞ベースのアッセイは、ROS誘導化学物質の同定に役立ちます。この技術の主な利点は、単離された膵島細胞を使用して、糖尿病誘発性が追加された可能性のあるROS誘導化学物質を簡単かつ効果的に同定することです。この方法は、グルコース刺激インスリン分泌などの膵臓の生理機能に対する化学物質の影響に関するin vitro分析にも使用できます。湾曲した一対の鉗子を使用して、十二指腸をオッディ括約筋の位置に近づけます。別の湾曲した鉗子のペアで、十二指腸壁をクランプして胆汁経路を塞ぎます。総胆管を見つけ、30ゲージの針と5ミリリットルの注射器を使用して、3ミリリットルのコラゲナーゼ溶液をゆっくりと注入します。次に、頭を近位に、足を遠位にするようにマウスを再配置します。注射後、総胆管と膵臓が膨らんでいることを確認してください。湾曲した鉗子と細いハサミを使用して、膨らんだ膵臓を取り出し、下行する結腸、腸、胃、脾臓から分離します。次に、3ミリリットルのコラゲナーゼ溶液が入った50ミリリットルのチューブに臓器を入れ、氷の上に保ちます。各50ミリリットルのチューブを摂氏37度の水浴に入れ、15〜20分間インキュベートします。チューブを渦巻かせ、次に4〜5個の消化器官を大きな滅菌シンクストレーナーにプールし、スコップを使用して膵臓を完全に分解します。23ゲージの針と洗浄液が入った10ミリリットルの注射器で、消化された細胞を画面から激しくピペッティングします。次に、洗浄液を50ミリリットルのチューブに集めます。チューブを97g、摂氏4度で1分間遠心分離し、上清をデカントします。チューブに25ミリリットルの洗浄液を加え、穏やかにボルテックスして組織を再懸濁します。次に、組織をスピンダウンし、上清をデカントします。ペレット状のティッシュが剥がれないように注意しながら、洗濯を3回繰り返します。膵島を精製するには、洗浄したティッシュペレットに10ミリリットルの精製溶液を加え、内容物を静かに再懸濁します。精製溶液に5ミリリットルの分離溶液を穏やかに重ねます。2つの溶液間で鋭い液体界面が維持されていることを確認します。チューブを560gで摂氏4度で15分間遠心分離し、ゆっくりと加速し、休憩を取らないようにします。次に、ピペットをインターフェースに挿入し、膵島層を収集します。先ほど示したように、膵島を洗浄する前に、溶液を新しい50ミリリットルのチューブに移します。最終洗浄液を取り除いた後、10ミリリットルの膵島培養液を加え、穏やかかつ完全に混合して膵島を再懸濁します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり100マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに移します。プレートを組織培養インキュベーターで12時間インキュベートします。その後、プレートを112gで遠心分離し、培地を取り出します。環境化学物質を膵島培養培地で希釈します。各化学希釈剤を100マイクロリットルずつプレートの別々のウェルに加えます。各ウェルの膵島を再懸濁し、プレートを摂氏37度で12時間インキュベートします。膵島の化学処理後、1x PBSを使用してサンプルを洗浄します。次に、ROSをクエンチし、プレートを摂氏37度で12時間インキュベートするための抗酸化剤として、5ミリモルのN-アセチルシステインまたはNACをウェルに加えます。96ウェルプレートを112gで遠心分離し、蛍光プローブの5マイクロモル溶液を加え、プレートを摂氏37度で60分間インキュベートします。PBSを使用して処理した膵島細胞を3回洗浄し、480ナノメートルのマイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。最後に、ROS誘導生体異物処理膵島および未治療膵島に対してグルコース刺激インスリン分泌(GSISアッセイ)を実施して、膵島の生理機能に対する生体異物の影響を測定します。ここに示されているのは、C57 Black/6マウスから単離された健康な膵島で、形状が円形または楕円形で、サイズが比較的均一です。このGSISアッセイでは、単離された膵島にグルコースを刺激してインスリンを分泌させることで、用量依存的な反応が観察されました。単離された膵島をここにリストされている生体異物で処理すると、アトラジン、BaP、BPA、PCBなどのいくつかの化学物質が活性酸素種の大幅な誘導を引き起こしました。しかし、NACの添加により、化学処理によりROSの生成を消光することができました。また、PCB126およびBPAで前処理した膵島は、対照群と比較してインスリン分泌の有意な減少を示し、膵β細胞の生理機能に損傷を与え、2型糖尿病を引き起こすROSの重要な役割を確認しました。一度習得すると、膵島の分離は適切に行われれば2時間で行うことができます。この手順を試行する際には、勾配遠心分離を使用して、他の膵臓の破片から膵島を浄化することが重要です。この手順に続いて、グルコース刺激インスリン分泌などの他の方法を実行して、膵島の生理学的機能に対する化学物質の影響などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、毒物学の分野の研究者が単離されたマウス膵島細胞の環境化学物質の糖尿病誘発性の可能性を探求する道を開きました。このビデオを見た後、マウスの膵臓膵島を分離し、これらの膵島細胞を同定に使用する方法についてよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マウス膵島単離

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。...

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。...

ハイコンテンツ<em&gt;インビトロ</em&gt;膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro...

酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

耐熱性工学の分野に特有の新奇向進化法は溶菌酵素のために開発され、結果的に検証されました。高温のインキュベーションの後、野生型タンパク質と比較した場合、ランダム突然変異誘発の唯一の1ラウンドの後、進化した溶菌酵素、PlyC...

耐熱性溶菌酵素の定向進化のための新しいスクリーニング法

学ぶマウス膵島細胞の分離法と活性酸素種誘導化学物質のスクリーニング技術。環境化学物質の糖尿病誘発リスクを評価するin vitroアッセイ手法を解説します。

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

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