Name: デュアル骨髄脂肪細胞分化に及ぼす悪性黒色腫細胞由来因子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぼう、悪性黒色腫細胞と骨髄脂肪細胞の相互作用を解析する2次元共培養システムの構築方法を。この手法は骨転移メカニズムの解明と新規治療戦略の開発に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々 は骨髄間質細胞をご提供するため親切ドヴ ・ Zipori (ワイツマン科学研究所、レホヴォト、イスラエル) に感謝 14F1.1 ラインします。本研究は、中国国家自然科学基金 (第 81771729)、永川病院の重慶医科大学 (Nos からの補助金によって支えられました。YJQN201330;YJZQN201527)。

注: このプロトコルで使用されているすべてのセルは冷凍ストック細胞から解凍後少なくとも 3 世代にわたる栽培にする必要があります。
1. 悪性黒色腫細胞由来因子を収穫します。
<ol><li>
準備
	<ol>
<li>B16F10 細胞およびマウスのメラノーマ細胞株を取得します。 注: このプロトコル マウス黒色腫細胞株は中国科学院の幹細胞バンクから得られました。</li>
		<li>B16F10 細胞培養 (100 mL) のための完全な媒体を作る。ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 50 U/mL、ペニシリンとストレプトマイシンの 50 μ g/mL を添加したを使用します。</li>
		<li>B16F10 細胞 (50 mL) の飢餓の無血清培地を作る。DMEM FBS なし中、50 U/mL、ペニシリンとストレプトマイシンの 50 μ g/mL を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
悪性黒色腫エアコン メディア (CM) の準備します。
	<ol>
<li>100 mm の種子 2.0 × 105 B16F10 細胞皿 10 %10 mL FBS DMEM。その後、24 時間 5% CO2の雰囲気の中で 37 ° C の定温器で細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>セルが合流の約 80% に達したら、培養培地を削除、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1 x, pH 7.4) の 5 mL で 2 回洗浄し、10 ml の無血清培地、飢餓の媒体を置き換えます。</li>
		<li>18-24 h のためのインキュベーターにセルを返します。</li>
		<li>飢餓後、ピペットと馴化培地 (CM) を収集し、新鮮な 50 mL の遠心管にそれを転送します。 注: 馴化培地は B16F10 細胞培養上清です。B16F10 細胞が CM を収集する前に良好な状態であることを確認します。</li>
		<li>遠心分離機の 4 ° C で 1,000 x gで 5 分間 CM</li>
		<li>上澄みをピペットし、新鮮な滅菌チューブやボトルにそれを転送します。 メモ: は、管の下部にペレットをピペッティングしないでください。</li>
		<li>細胞の残骸を削除するには、滅菌ボトルやチューブの上に注射器に接続された 0.45 μ m フィルターを通過して CM をフィルターします。 注: 0.22 μ m のフィルターは、CM を濾過に最適。</li>
		<li>-20 ° C でフィルター処理された上澄みを使用するまで保存します。 注: 1 ヶ月以上の-20 ° C で培養上清に格納しないことお勧めします。また、脂肪細胞の分化のための時間のより長期間にわたって-80 ° C で CM を格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 悪性黒色腫細胞由来因子による骨髄脂肪細胞の誘導
<ol><li>
準備
	<ol>
<li>脂肪分化誘導培地28の 100 mL を作る。5 μ g/ml の 1 μ M デキサメタゾン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、インスリンの完全な DMEM を使用します。4 ° C で 2 週間にそれを蓄える</li>
		<li>脂肪細胞培養用培地の 100 mL を準備します。完全な DMEM を使用または 50% 黒色 CM インスリンの 5 μ G/ml を添加した混合します。</li>
		<li>オイル赤 O 原液を作る。オイル赤 O 10 mL のイソプロパノール (≥ 99.5%) の粉の 30 mg を溶解し、渦によってよく混ぜます。 注: が 4 ° C で 1 年間保存します。</li>
		<li>オイル赤 O 作業ソリューションを確認します。発煙のフードを 3:2 の比率で脱イオン水 (ステップ 2.1.3) からオイル赤い O 原液を希釈します。室温で 15 分間混合物を孵化させなさいし、使用前に 0.22 μ m のフィルターをフィルター処理します。 注: のみ、2 時間以内の新鮮な作業ソリューションを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脂肪細胞分化
	<ol>
<li>文化間質細胞は、マウス骨髄29 5% CO2の雰囲気の中で 37 ° C の定温器で 80% の confluency に完全な DMEM に 60 mm ディッシュから 14F1.1 をラインします。 注: または、プライマリの骨髄由来の間葉系細胞3014F1.1 に置換します。</li>
		<li>1-2 分のインキュベーターで 0.25% トリプシン溶液 1.5 mL でセルを trypsinize します。</li>
		<li>セルに 10 %fbs 培地 5 mL を追加し、ガラス検定; とセル数をカウント1-2 105/mL x 約細胞密度を調整します。</li>
		<li>5 × 104 /24 ウェル プレートのウェル 14F1.1 細胞の脂肪分化誘導培地の 0.5 mL の種子します。孵化の 2 日後、電池が合流の約 90% に達する。 注: この手順は非常に重要です。骨髄間質細胞は、脂肪細胞脂肪分化誘導培地なしに誘導することはできません。</li>
		<li>誘導培地を取り外して、洗浄をするたびに 1 mL の PBS で 2 回。</li>
		<li>脂肪細胞培養用培地 1 mL に変更し、脂肪細胞の成熟まで、細胞の培養を続行します。 注: 顕微鏡の下では、脂肪細胞が大小のシャボン玉のように見えるし、認識し非常に易い。通常、成熟脂肪細胞は 6番目または 8番目の日であります。</li>
		<li>オイル赤 O と成熟脂肪細胞を染色または量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 分析のため脂肪細胞を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脂肪細胞の染色
	<ol>
<li>洗って差別化された 14F1.1 は細胞の PBS で 2 倍、1 h の 3.7% のホルムアルデヒドでそれらを修正します。</li>
		<li>60% イソプロパノールで細胞を洗い、完全に乾かします。</li>
		<li>井戸にオイル赤い O 作業溶液 0.2 mL を追加し、0.5 ~ 2 時間室温でインキュベートします。</li>
		<li>非連結の色素を削除する水で細胞を洗浄します。</li>
		<li>光学顕微鏡の下で染められた脂肪細胞を写真します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 悪性黒色腫細胞の骨髄脂肪細胞の共培養
<ol><li>
準備
	<ol>
<li>成熟した骨の骨髄脂肪細胞を準備: 2 日間成熟した BM 脂肪脂肪分化誘導培地で 24 ウェル プレートに 14F1.1 細胞を誘導し、さらに 6-8 日間脂肪細胞維持培地でそれらを維持します。</li>
		<li>B16F10 細胞を準備: DMEM 培地 5 mL を 60 mm 料理 B16F10 細胞の培養します。</li>
		<li>膜挿入 (例えばtranswell) を湿らせて: 0.4 μ m 孔サイズの膜挿入に FBS 無料 DMEM 培地の 150 μ L を追加し、FBS 無料 DMEM 培地 500 μ L でいっぱい 24 ウェルの井戸にそれらを浸します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共設定
	<ol>
<li>各挿入の中をゆっくりとピペット。 メモ: メディアを削除する場合は、膜を破壊しません。</li>
		<li>3.2.1 のステップからシード 0.4 μ m の細孔内 B16F10 細胞 (0/103105106) を挿入します。</li>
		<li>3.1.1 のステップから成熟した骨髄脂肪細胞脂肪細胞維持培地の井戸に置き換えます。完全 DMEM 培地の 600 μ L。</li>
		<li>(ステップ 3.2.2) から (ステップ 3.2.3) から成熟した骨髄脂肪細胞培養実験の井戸に B16F10 細胞でいっぱい挿入を転送します。</li>
		<li>2 日間の 37 ° C および 5% の CO2の共培養系を孵化させなさい。</li>
		<li>培養 48 時間後、共のドライブベイ カバーを取り外すし、2 脂肪細胞を洗う 500 μ L の 1x PBS で x。 注: 必要な場合必要に応じて、分析用インサートの B16F10 細胞を収集します。</li>
		<li>オイル赤 O 作業ソリューションと脂肪細胞を染色または qPCR 分析のため脂肪細胞を収集します。 注: は、2.3 の手順で染色の手順を参照してください。</li>
		<li>光学顕微鏡の下で染められた脂肪細胞を写真します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. qPCR 脂肪細胞特異遺伝子の署名の分析
<ol><li>24 ウェル プレートのウェルあたり使える - RNA 分離試薬 0.5 mL を追加、どの成熟脂肪細胞を検出する準備ができています。</li>
	<li>RNA の抽出および cDNA 合成31の標準的なプロトコルに従います。</li>
	<li>コントロール、CEBPα/β、ppar γ、FABP4、レプチン、県 1、アディポネクチンは脂肪細胞特異的遺伝子の署名 (表 1) のため、18 歳未満と GAPDH のプライマーを使用します。</li>
	<li>サーマルサイクラーに次の反作用を実行: 95 ° C、20 s、95 ° C の 1 のための 40 のサイクルに続いて s、および 60 ° C、20 s。</li>
	<li>2-ΔΔCtメソッドを使用して、折り目変更32を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+niches+for+melanoma+cell+colonization+and+growth+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow.</a> Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).</li>
<li>Trotter, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-Lineage+Cells+Support+Growth+and+Dissemination+of+Multiple+Myeloma+in+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone.</a> The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).</li>
<li>Morris, E. V., Edwards, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bone+marrow+adipocytes+in+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis.</a> Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).</li>
<li>Diedrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+the+Warburg+phenotype+in+metastatic+prostate+tumors+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation.</a> Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).</li>
<li>Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+and+bone+marrow%3A+how+adipocyte-rich+organs+create+tumour+microenvironments+conducive+for+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression.</a> Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).</li>
<li>Chen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+increases+melanoma+cell+growth+in+the+bone+marrow+by+inducing+osteopontin+and+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6.</a> Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).</li>
<li>Balaban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis+links+obesity+to+breast+cancer+growth%3A+adipocyte-derived+fatty+acids+drive+breast+cancer+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration.</a> Cancer & Metabolism. 5, 1(2017).</li>
<li>Huang, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+malignant+growth+of+breast+tumours+with+monocarboxylate+transporter+2+expression+via+beta-hydroxybutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate.</a> Nature Communications. 8, 14706(2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI Insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocytes+stimulate+invasion+of+breast+cancer+MCF-7+cells+by+secreting+IGFBP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2.</a> PLoS One. 10 (3), 0119348(2015).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Herroon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+tumor+growth+in+bone+via+FABP4-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms.</a> Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).</li>
<li>Tabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Adipocytes+Facilitate+Fatty+Acid+Oxidation+Activating+AMPK+and+a+Transcriptional+Network+Supporting+Survival+of+Acute+Monocytic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells.</a> Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).</li>
<li>Wen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+activate+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+and+autophagy+to+promote+tumor+growth+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer.</a> Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593(2017).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocytes+in+bone+marrow+protect+myeloma+cells+against+chemotherapy+through+autophagy+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation.</a> Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+Stem+Cells+Evade+Chemotherapy+by+Metabolic+Adaptation+to+an+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).</li>
<li>Templeton, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Cell+Colonization+of+the+Human+Bone+Marrow+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche.</a> Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).</li>
<li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+3D+Culture+System+to+Differentiate+Visceral+Adipocytes+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro.</a> Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+3D-Culture+Approaches+to+Study+Interactions+of+Bone+Marrow+Adipocytes+with+Metastatic+Prostate+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84(2016).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro--a+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+among+stromal+cell+lines+from+mouse+bone+marrow+disclosed+in+their+extracellular+matrix+composition+and+interactions+with+normal+and+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells.</a> Blood. 66 (2), 447-455 (1985).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture%2C+and+Differentiation+of+Bone+Marrow+Stromal+Cells+and+Osteoclast+Progenitors+from+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Quantification+of+Plasma+MicroRNA+Levels+in+Cynomolgus+Monkeys%2C+Using+Quantitative+Real-time+Reverse+Transcription+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56850(2018).</li>
<li>Bozec, A., Hannemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Regulation+of+Adipocyte+Numbers+in+Adult+Organisms+Through+Differentiation+and+Apoptosis+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53822(2016).</li>
<li>Shafat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+blasts+program+bone+marrow+adipocytes+to+generate+a+protumoral+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment.</a> Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).</li>
<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
<li>Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+adipocyte-derived+CXCL1+and+CXCL2+contribute+to+osteolysis+in+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).</li>
<li>Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+metastasis+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal metastasis in the elderly.</a> European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+adipocyte+specification+and+necrosis+augment+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation.</a> Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).</li>
<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+promotes+breast+tumor+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).</li>
<li>Hirano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+adipogenesis+induction+by+conditioned+media+obtained+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells.</a> Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).</li>
<li>Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+arrangement+of+eukaryotic+cells+in+merged+hydrogels+combines+the+advantages+of+3-D+and+2-D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures.</a> Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).</li>
</ol>

著者申告するものがあります。

挿入して共培養系は、細胞間相互作用の研究に広く使用されています。2次元培養システムは、どのように二つの我々 はここで骨髄脂肪細胞の 2 つの異なった癌セル駆動の効果を示した生体外クロストーク、部分を観察する効果的な方法です。多くのラボでは、脂肪細胞と癌細胞6,12,27,39間のクロストークを調査するこのメソッドを活用しています。
一般に、したがって、2次元培養の細胞間クロストークの検討に直球です。しかし、さらなる研究の未分化細胞ラインの準備に関しては、いくつかのユニークな課題があります。ここで説明したプロトコルで骨髄間質細胞の機能状態は脂肪細胞分化の非常に重要です。プロトコルは、プライマリの骨髄間葉系幹細胞 14F1.1 細胞を置き換えるに修正できます。さらに、数日間 14F1.1 セル脂肪分化誘導培地での前...

骨転移は進行癌患者の間で広まっているが、根治療法はまだ使用できません。脂肪としてエネルギーを格納することに特化したを超えて脂肪細胞は骨髄や他臓器1,2,3,4,5,6で腫瘍の成長と転移をサポートできます。また、脂肪細胞はがん細胞生物学7,8,9,10と代謝4,11,12 の調節に重要な役割を果たしてください。 ,13,14,15,16、よくように骨転移1,4,12として。骨髄ニッチで脂肪細胞は癌細胞4,6,17の生物学的態度も影響します。骨髄脂肪細胞と癌 osteotropism 細胞間の相互作用は骨転移の理解のために重要です。しかし、少しは知られています。
現在の研究に基づいて、さまざまな方法は、2 または 3 次元 (2 D)/前のヴィヴォ文化17,18,19,20,21を含む脂肪細胞に適用されます。最近、Herroonらは、癌細胞22骨髄脂肪細胞の相互作用を研究する新しい 3 D 文化のアプローチを設計されています。3 D 共が生理学的な模倣するため最適な脂肪細胞と癌との間の相互作用が生体内で細胞、それは再現性に乏しく22,23から苦しんでいます。2次元培養システムと比較して、3 D の共培養系細胞形態21,22,24,25,26などの別の細胞表現型があります。さらに、孤立した海綿骨の組織片の前のヴィヴォ文化は、培養した骨髄細胞17から脂肪細胞の堅牢な副産物につながります。
これらの以前のモデルとは対照的しかし、2次元細胞培養モデル古典的な信頼性、および簡単な手法のままさっと候補分子と表現型の脂肪細胞やがんの変更細胞の in vitro1、 4,6,12,15,27.骨髄脂肪細胞と悪性黒色腫細胞間クロストークを理解、悪性黒色腫細胞の骨髄脂肪細胞の 2次元培養システムの詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>インビトゲン株式会社</td><td></td><td></td>11965092</tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash;044</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチル-キサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッド o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルインサート</td><td>ミリポア</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>培養インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mLfalcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Microscopy</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Olympus-200</td><td></td></tr> <tr><td>&mu;L ピペットチップ</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL ピペットチップ</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

デュアル骨髄脂肪細胞分化に及ぼす悪性黒色腫細胞由来因子

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

骨髄脂肪細胞と腫瘍細胞間クロストークは、骨転移の過程において重要な役割を再生可能性があります。さまざまな方法があります; 重要なクロストークを勉強ただし、共の二次元 transwell システムは古典的な信頼性の高い、このクロストークの研究のための簡単な方法。ここでは、骨髄の脂肪細胞と悪性黒色腫細胞の培養を示す詳細なプロトコルを提案する.それにもかかわらず、このような培養システム可能性がありますだけでなく骨髄脂肪細胞によるがん細胞の細胞シグナル伝達の研究に貢献、骨の新しい治療上のターゲットを明らかにすることが骨転移の研究機構の将来にも転移。

骨髄、脂肪細胞が腫瘍微小環境1,13,33,34,35に可溶性因子を介して腫瘍の進行をサポートするための初期段階で表示できるか破骨細胞形成6,12,36, 特に肥満6,12および/または加齢37のコンテキストをアクティブにします。私たちの以前の研究1では、...

ここでは、提案する、信頼性が高く、簡単な二次元 (2 D) 共培養系における骨髄脂肪細胞の悪性黒色腫細胞由来因子の二重効果を明らかにする腫瘍細胞と骨髄脂肪細胞間の相互作用の分化と骨転移機構の解明のための古典的な方法をまたポーズします。

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

この方法は、骨髄脂肪細胞の成長にどのような変化が誘発され、がん微小環境でのその発達など、骨転移研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の大きな利点は、実行が容易で、候補分子を迅速に取得できることです。この方法により、骨髄脂肪細胞とメラノーマ細胞との間のクロストークに関する洞察を得ることができます。また、骨芽細胞などの他の細胞タイプにも適用できます。まず、100ミリメートル皿に10ミリリットルのDMEMに10%FBSを補充したB16F10メラノーマ細胞を5回10回播種し、摂氏37度、CO2を5%で24時間インキュベートします。翌日、約80%コンフルエント細胞培養物を1回の洗浄につき5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、細胞培養インキュベーター内で10ミリリットルの無血清培養培地で細胞を18〜24時間飢餓状態にします。翌日、ピペットを使用して、調整された上清を50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離し、0.45ミクロンの細孔フィルターを備えたシリンジに培地をロードします。次に、溶液を滅菌容器に濾して残っている細胞の破片を取り除き、馴染み培地を摂氏マイナス20度で最大1か月間保存します。骨髄脂肪細胞を誘導するために、マウスF14 1.1骨髄間質細胞を60ミリメートル皿で培養し、完全なDMEMを80%の密度にします。培養の適切な段階で、1.5ミリリットルの0.25%トリプシン溶液で細胞を37°Cで1〜2分間収穫します。細胞が分離したら、10%FBSを添加した5ミリリットルの培地で酵素反応を停止し、新鮮な血清添加培地で細胞を10〜5ミリリットルあたりの細胞濃度の1〜2倍に調整します。24ウェルプレートのウェルあたり0.5ミリリットルの脂肪形成誘導培地に4番目の細胞に10回5回播種し、細胞をさらに2日間細胞培養インキュベーターに戻します。その後、上清を1ウェルあたり1ミリリットルの脂肪形成維持培地に交換し、脂肪細胞が成熟するまで細胞の培養を続けます。光学顕微鏡で細胞が小さいシャボン玉から大きなシャボン玉のように見える場合は、これらの成熟脂肪細胞をPBSで2回洗浄し、続いて0.2ミリリットルの3.7%ホルムアルデヒドに1時間固定します。固定セルを60%イソプロパノールですすぎ、ウェルを完全に乾かします。0.2ミリリットルのオイルレッドOワーキング溶液を細胞に加え、室温で30〜120分間インキュベーションし、細胞を水で洗浄して結合していない色素を除去し、光学顕微鏡で脂肪細胞をイメージングします。あるいは、成熟したら、各脂肪細胞培養ウェルに0.5ミリリットルのすぐに使用できるRNA単離試薬を添加し、適切なプライマーを使用して細胞の脂肪細胞特異的遺伝子シグネチャを確認します。次に、示された設定を使用してサーマルサイクラーで反応を実行します。骨髄由来脂肪細胞メラノーマ細胞共培養をセットアップするには、まず150マイクロリットルの無血清DMEMを0.4ミクロンの孔径のメンブレンインサートの内部チャンバーに追加し、各インサートをウェルあたり500マイクロリットルの無血清培地を含む24ウェルプレートの1ウェルに配置します。B16F10メラノーマ細胞を80%細胞培養から新鮮な無血清培地で実験的に適切な濃度に希釈し、各インサートの内部チャンバー内の培地を150マイクロリットルの細胞と交換します。次に、90%コンフルエントな成熟骨髄脂肪細胞培養の各ウェルの脂肪形成維持培地上清を600マイクロリットルの完全DMEMと交換し、メラノーマ細胞含有インサートを成熟脂肪細胞培養プレートの各ウェルに移します。すべてのインサートを移し替えたら、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。2日後、インサートを取り外し、各ウェルの底を500マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、脂肪細胞をOil Red Oワーキング溶液で染色するか、または実証されているように定量的PCRによって脂肪細胞遺伝子発現を分析します。腫瘍馴化培地で分化した成熟脂肪細胞には脂肪滴が含まれているため、分化した脂肪細胞はオイルレッドO染色によって容易に同定できます。これらの細胞の脂肪細胞特異的遺伝子シグネチャーは、定量的PCRによっても確認することができます。脂質貯蔵の減少は、多数の黒色腫細胞の存在下で共培養された脂肪細胞で観察され、脂肪細胞の表現型の脱分化が観察されます。これは、これらの以前は成熟していた細胞における脂肪細胞特異的遺伝子発現の減少によって証明されています。このビデオを見れば、2つの異なる細胞タイプ間の相互作用を研究するための2D共培養システムの設計方法とセットアップ方法について十分に理解できるはずです。

dual-effects-melanoma-cell-derived-factors-on-bone-marrow-adipocytes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、骨髄間質細胞(BMSC)の脂肪細胞への分化を示しています。2段階のプロセスでは、特定の成長因子とホルモンの存在下で、未分化のBMSCは最初に前脂肪細胞に分化します。グルコースとインスリンによる治療を含む第2のステップは、複数の脂肪滴を伴う成熟脂肪細胞の形成につながります。...

In vitroマウス骨髄間質細胞の脂肪細胞への分化

脂肪組織(AT)は全身の恒常性に影響を与える可能性があるため、脂肪細胞の分化と機能の分子メカニズムを理解することは重要です。私たちは、誘導された脂肪細胞のアポトーシスのモデルとして、脂肪細胞の恒常性、分化、および低酸素曝露を分析することにより、これらのプロセスに関する新しい洞察を得るためのプロトコルを提供します。...

分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

多細胞生物では、分泌された可溶性因子がパラクリンシグナル伝達の結果として異なる細胞タイプからの応答を誘発します。インサート共培養システムは、細胞間接触がない場合に分泌された可溶性因子によって媒介される変化を評価する簡単な方法を提供します。...

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。...

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

脂肪細胞分化を評価する従来の方法では遺伝子発現の変化に固有ではありませんが、安くて使いやすい。間葉系細胞の分化成熟脂肪細胞の血統の特定のマーカーを使用して定量化するアッセイを開発しました。このアッセイでは、基礎医学と臨床医学の間で多様なアプリケーションがあります。...

可視化と系統特異的マーカーと間葉系細胞脂肪細胞の微分の潜在性の定量化

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム...

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

以下の手順は、マウス背部皮膚における melanocytic...

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

このプロトコルにより、人工多能性幹細胞(iPSC)から純粋な脂肪細胞集団を作製することができます。レチノイン酸は、iPS細胞を脂肪細胞の産生に使用される間葉系幹細胞(MSC)に分化させるために使用されます。次に、ナイルレッド染色に基づくソーティングアプローチを使用して、純粋な脂肪細胞を取得します。...

脂肪細胞関連疾患を研究するためのヒトiPS細胞を純粋な脂肪細胞集団に確実に分化させる(英語)

このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in...

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

この記事では、黒色腫関連軟髄膜疾患 (M-LMD) の患者から収集された脳脊髄液循環腫瘍細胞 (CSF-CTC) の増殖に関するプロトコルについて説明し、M-LMD...

生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

学ぼう、悪性黒色腫細胞と骨髄脂肪細胞の相互作用を解析する2次元共培養システムの構築方法を。この手法は骨転移メカニズムの解明と新規治療戦略の開発に貢献します。

デュアル骨髄脂肪細胞分化に及ぼす悪性黒色腫細胞由来因子

さらに動画を探す