Name: ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍細胞の電気的活動可視化法。Tol2トランスポソンを用いた遺伝子導入により、発生生物学とがん細胞生物学における細胞電気信号のリアルタイム追跡を可能にする革新的な手法です。

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この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞数 R35GM124913、パデュー大学 PI4D インセンティブ プログラム、および PVM 内部競争の下で健康の国民の協会のサポートされていた基本的な研究資金プログラムです。内容は著者の責任と資金調達エージェントの公式見解を必ずしも表さない。メダカ Tol2 構築、ASAP1 構造体のマイケル ・ リンありがとう川上浩一、 ubiプロモーターのレナード ・ ゾンを Addgene を構築します。

ゼブラフィッシュ、AAALAC 承認の動物施設に収容され、パーデュー大学動物ケアおよび使用委員会 (PACUC) によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。
1. メダカ Tol2 トランスポゾン プラスミド構築準備
注: メダカ Tol2 トランスポゾン、メダカに発見されたは、ゼブラフィッシュ研究コミュニティ8,9で広く使用されています。正常にゲートウェイ ・部位特異的組換えベース クローン システムに採用されており、メダカ Tol2 キット10として知られています。メダカ Tol2 キットも遺伝子導入の効率を向上させながら、カスタマイズされた式の構造物の作成のより便利な方法ことができます。したがって、このシステムの活用し、検証されたユビキチンプロモーターを使用して ASAP111をドライブするユビキタス ASAP1 式ゼブラフィッシュ行を作成する簡単な決断だった。
<ol><li>中間エントリ ASAP1 構造を作成: pDONR221 ASAP1<ol>
<li>Addgene から pcDNA3.1/Puro CAG ASAP1 (プラスミド #52519)、遺伝的コード化の電圧センサー ASAP1 構成要素を取得します。ASAP1 コーディング領域を増幅するには、プライマー (図 1) の 5' 端に attB 配列の両脇にカスタマイズされたプライマー (attB1 ASAP1F、attB2 ASAP1R) を使用して PCR を設定します。Phusion DNA ポリメラーゼはその高効率化のために選ばれた、以前に公開されたプロトコル12に基づいて PCR 条件を最適化します。</li>
		<li>TAE は、200 μ L のヒント、正規ピペットを使用してゲル 1% に 50 μ L の PCR の製品を読み込むし、約 30 分間水平ゲルタンクで 160 V で電気泳動を行います。</li>
		<li>UV transilluminator の下でゲルをチェック (353 nm)、以前に公開された13,14、UV transilluminator 下刃/メスを使用して目的のバンドを消費税し、含んでいるゲルの DNA のサンプルを入れてきれいな 1.5 mL 遠心機チューブ。</li>
		<li>ASAP1 PCR の製品のゲルの浄化を実行します。製造元の指示に従って商業 DNA ゲル精製キットを使用して摘出したゲルの DNA を回復し、水の 20 μ L に DNA を溶出します。サンプルとして 1 μ L をとり、分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。空白のコントロール15として水を使用してソフトウェアの指示を流れ。</li>
		<li>100 を取る ng の PCR の製品の浄化し、150 混ぜる ng のテの 10 μ L の pDONR221 プラスミドのバッファー (10 mM トリス、1 mM EDTA pH 8.0)16。反応に BP Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>2 日目、反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。</li>
		<li>変換を実行します。反応を転送し、有能なエシェリヒア属大腸菌のセルし、30 分間氷の上細胞をインキュベート Top10 の 50 μ L でそれをミックスします。その後、転送 1 分の 42 ° C の水浴に反応管はすぐにチューブを削除し、2 分間氷の上を孵化させなさい。次に、37 ° C のシェーカーにチューブを入れて、1 時間インキュベートします。</li>
		<li>チューブを取り出して、カナマイシン LB プレート上に細胞をプレートします。次に、プレート一晩 (16-18 h) 37 ° c. で孵化させなさい</li>
		<li>シングルと十分に分離コロニーをピックアップし、3 ml の LB 培地の 14 mL 細胞培養管にそれらを接種します。37 ° c 250 rpm (1 分あたり回転) の回転速度とシェーカーで一晩文化それら。</li>
		<li>Miniprep の次の命令マニュアル17商業 miniprep キットを使用してを実行します。</li>
		<li>3-4 プラスミドをシーケンス サンガーと肯定的な pDONR221 ASAP1 を識別するシーケンスは M13F と M13R の配列のプライマーを使用してクローンします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロインジェクションのメダカ Tol2 コンストラクトを作成する: pDestTol2-ubi-ASAP1<ol>
<li>シーケンスを検証 pDONR221 ASAP1 クローンと測定分光光度計の次に空白制御15として水を使用してソフトウェア命令を使用してその DNA 濃度を選択します。</li>
		<li>PDONR221 ASAP1 の 100 μ g を取るし、メダカ Tol2 キット 5 終わりプラスミドの 100 μ g と混ぜる (pENTR5'_ubi、Addgene #27320) 100、p3E polyA (メダカ Tol2 キット #302) の μ g と pDestTol2pA2 の 150 μ g (メダカ Tol2 キット #394)。8 μ L に容量を調整チューブ 1.5 mL 容マイクロで TE バッファー (トリス、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 10 mM) を使用し、2-5 秒の簡単な渦でよく混ぜます。プラス、LR Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>2 日目、10 μ L ピペットを使用して反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。</li>
		<li>変換を実行して (手順 1.1.7-11) 上記のように肯定的なクローンを識別します。</li>
		<li>測定シーケンスの DNA の集中を確認15分光光度計を用いた pDestTol2 ユービーアイ ASAP1 クローン (図 1 b)。通常、濃度は 200ng/μ L の周りです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. メダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA と注射溶液を準備します。
<ol><li>連勝大腸菌グリセロール ストック (100 μ g/mL アンピシリン) と LB プレート pCS2FA トランスポザーゼ プラスミド (メダカ Tol2 キット #396) の滅菌接種ループを使用して。インキュベーターの 37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日、単一コロニーを拾うし、lb (100 μ g/mL アンピシリン) 3 mL に滅菌 10 μ L ピペット チップを使用してそれを接種します。一晩 250 rpm の回転速度とシェーカーで 37 ° C で培養します。</li>
	<li>その取扱説明書に続く商業 miniprep キットを使用してE. 大腸菌文化 miniprep を実行します。14,000 rpm で 1 分遠心分離機による TE バッファーの 30-50 μ L にプラスミド DNA を溶出し、その DNA 濃度を分光光度計で測定します。</li>
	<li>私にプラスミッドの 1-2 μ g のエンドヌクレアーゼをリニア化し、浄化のクリーニング キットがなかった後の取扱説明書を次の DNA と DNA 消化。5 μ L の水に 1 分 14,000 rpm で遠心分離で DNA を溶出します。予想される濃度は約 200-300 ng/μ L。</li>
	<li>生体外のトランスクリプションを実行しないと私は商業 SP6 転写キットを使用して DNA のテンプレートとして pCS2FA トランスポザーゼを線形化します。</li>
	<li>反応が完了すると、mRNA 商業 RNA クリーニング キットの製造元の指示に従ってメダカ Tol2 転移を浄化します。最後に、mRNA を 20 μ L RNAase 無料水に溶出し、分光光度計で RNA 濃度を測定します。予想される濃度は 1-3 μ g/μ L のサンプルは、必要な場合-80 ° C のフリーザーで保存できます。</li>
	<li>20 ng/μ L pDestTol2-ユービーアイを混合することによってマイクロインジェクション ソリューションを準備-ASAP1 とメダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA (100 ng/μ L) ピペットで遠心管に。繰り返し融解と凍結、分注 6 μ L チューブ/による核酸の劣化を防止し、将来使用するため-80 ° C のフリーザーで保存します。</li>
</ol>3. マイクロインジェクション
<ol><li>注入前に午後 4-6 繁殖タンク男性少なくとも 2 名と女性 2 名を設定します。これらの魚は、午後に取り込まれないする必要があります。この手順は魚の無駄の量を減らす、繁殖応答を誘導しながらも、次の朝をそれらをきれいにする時間を節約します。</li>
	<li>次の朝、削除準備注射液 (pDestTol2-ubi-ASAP1 構造とメダカ Tol2 mRNA)-80 ° C のフリーザーから氷の場所と。</li>
	<li>魚のタンクを繁殖の仕切りを引き、魚の仲間を許可します。一般的に、魚は分割線から撤退した後 20-30 分以内の卵を産みます。そうでない場合は、1-2 時間以上を待ちます。いくつかの魚は、すべての卵を置くかもしれない。この場合、魚の胚のコレクションのこの実験を繰り返します。</li>
	<li>待っている間、針の先端の鉗子、またはワイパーは繊細なタスクに分割することにより面取りを作成する角度で壊れたで準備があることを確認します。<ol>
<li>次のパラメーターを使用してマイクロ ピペット引き手を引いて、毛細管ガラスから針: 熱 545;プル 60;速度 80;時間 250;圧力 500。(接眼部径推定法の定規) と郭清範囲の下に鉗子で角約 45 ° で鉗子を保持することによって針を破る。マイクロインジェクター設定によって変数をすることができます必要なニードル径が小さい直径、胚の死亡率を減少させるため推奨。</li>
	</ol>
</li>
	<li>魚は、卵を産んでいる、一度 10 cm 径シャーレでそれらを収集し、郭清範囲にそれらをもたらします。すべて異常な胚を削除および魚の無駄。</li>
	<li>ピペットに準備された 3% の agarose 注入受精卵型します。場所に胚を保つために余分な水を削除します。</li>
	<li>すべての行は、実行可能な胚で満ちている、一度単一のすべてのセルが約 45 ° の角度で水平方向にある針に向かって同じ方向を向くように配置します。これする注入が簡単に後で。</li>
	<li>手袋を着用しながら 20 μ L ロード ピペットを使用して、ヒントし、氷のチューブから準備された構成の 5 μ L を削除します。</li>
	<li>慎重に先端近くに試薬を痛まなくて、タッパーを出すまで壊れた毛管チューブのバック エンドに先端を挿入します。空気の泡がある場合、は、先端を壊さないようにして、針を振る。</li>
	<li>マイクロインジェクション針ホルダーにまっすぐ針を挿入し、針の位置に固定されるまで慎重に締め。約 45 ° までの角度を調整します。</li>
	<li>針が準備し、添付、顕微鏡およびガス圧力タンクを入れます。商業 CO2タンクは通常この目的に適しています。保持と射出圧力で噴射量を調整: 0.5 psi の保持のため、放出の 30 の psi を近似します。必ずペダルを押すときに解決策が出てくることを確認してください。</li>
	<li>ボリュームおよび 〜 150 μ m の解決策の流れ調整鉱物油のドロップでステージ マイクロメータを使用する (約 2 nL)。背圧針のうち点滴少量できるようになることを確認します。十分な背圧がない場合、毛細管は針を入力して mRNA を破壊する液体になります。</li>
	<li>針が校正され、受精胚の単一のセルにコンストラクトを注入を開始します。 注: これは大量の練習、忍耐力と繊細さ、細胞膜を貫通しにくいためかかります。セル、卵黄はない、トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するために薬液を注入することが重要です。これは morpholino 注入から異なります。どっち針に入る限り構造体は、セル、セルの問題ではないです。セルではなく卵黄に注入される場合、遺伝子は非常に低い成功率を持ちます。単一セル段噴射も重要であるまたは体細胞キメラ魚が作成されます。これは生殖細胞に入る遺伝子の可能性が低くなります。</li>
	<li>胚の場所で保持でき、胚を動かさずに圧力を適用するのに針の支持を提供するためにゲルのノッチのエッジを使用します。針の先端は、単一のセル、ソリューションの適切な量を解放するためにペダルを押します。胚のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>完了したら、魚システム水と使い捨て 3.4 mL 転送ピペット agarose の切り込みからそれらを洗浄によってラベル付けされた皿に注入された胚を転送します。胚を開発できるようにする 28.5 ° C の定温器に格納します。死んだ魚の胚を取り外し終日戻って確認し、魚の水に 0.1% メチレン ブルーと水を交換します。</li>
	<li>注入後、約 6-8 時間取る 10 個々 の注入は胚を魚し、名手法18を使用してそれらからゲノム DNA を準備します。</li>
	<li>次の朝は、卵黄以外の組織における GFP を示す胚を整理する蛍光光源を解剖顕微鏡を使用します。これらの魚の胚は、注入されたコンス トラクターを含める必要があります。</li>
	<li>19を前述のように、トランスポゾン動作をチェックするメダカ Tol2 消費税分析を実行します。摘出したプラスミドを検出できる場合保持、注入された胚を魚し、それらを上げます。摘出したプラスミドを検出されない場合は、メダカ Tol2 物品税法の肯定的な結果を達成するまでメダカ Tol2 mRNA マイクロインジェクションの合成とプロセスを繰り返します。</li>
</ol>4 遺伝子組換え ASAP1 魚、Tg の確立 (ubi: ASAP1)
<ol><li>ゼブラフィッシュ本20で前述した成人に注入された魚 (F0世代) を上げます。これは通常約 4 ヶ月がかかります。</li>
	<li>シングル大人 F0に魚を取るし、反対の性別の野生型魚シングル クロスします。後の日に繁殖した魚の胚を収集します。0.1% メチレン ブルーと水の魚で 28.5 ° C の定温器で収集した魚の胚を維持。</li>
	<li>3 日目、GFP フィルターと蛍光解剖顕微鏡の下に魚の胚を確認します。存在する場合、緑の魚の胚を整理し、F1世代遺伝子組換え魚、Tg として大人にそれらを上げる (ubi: ASAP1)。 注: 親の F0魚のほとんどは細菌ライン遺伝子キメラ メンデル比は想定されていません。</li>
	<li>野生型の魚の単一の F1成魚をクロスし、魚の胚を収集します。緑の魚の胚を整理し、F2世代魚として大人にそれらを上げます。 注: 緑と非緑の魚の胚に近くなるはず 1:1 単一の遺伝子があるか。</li>
	<li>悪性末梢神経鞘腫瘍 (鞘) のような腫瘍の電気潜在的な変更を表示するクロス F2世代 Tg (ubi: ASAP1) rpl35hi258/重量魚と魚。目に見える腫瘍が 6-8 ヶ月大人21,22を開始することが知られています。</li>
</ol>5. イメージング
<ol><li>ゼブラフィッシュ胚の画像、複数の F2世代創始者に魚を取る個々 のペアで野生型魚とそれらを交差します。ステージング ガイド23ゼブラフィッシュによると異なる必要な発達段階で魚の胚を収集します。</li>
	<li>魚の胚の初期段階で、皮をむくし、慎重に 10 cm 径シャーレ魚システム水で郭清範囲下組の鉗子を用いた胚の絨毛を削除します。</li>
	<li>3.4 mL 使い捨て可能な移動のピペットを使用して 3% セルロースと凹面ガラスのスライドにいくつかの魚の胚を転送します。蛍光郭清範囲の下に針を使用して携帯電話の GFP のアクティビティを表示する目的の位置に胚を調整します。</li>
	<li>魚の胚 (12 体節期以前) の移動の段階では、スライドに転送する前に魚の胚を麻酔するのに 0.05 %tricaine 酸イマチニブを使用します。簡単に言えば、彼らはスイミングとボディ バランスの損失を停止するまで魚の胚が魚水 0.05 %tricaine 酸イマチニブに出現しました。また、スライドに 0.05 %tricaine メシル酸、セルロースとのドロップを追加します。</li>
	<li>未満 12 体節期魚胚、互換性のあるカメラとソフトウェア イメージング用エピ蛍光顕微鏡を使用します。12 体節胚の魚よりも古い、蛍光解剖顕微鏡を使用します。</li>
	<li>腫瘍のセル電圧をイメージ、最初鞘腫魚を識別します。その後、0.05 %tricaine 酸イマチニブで魚を麻酔します。全体のマウント用に、10 cm 径シャーレに魚を置きます。腫瘍細胞の電気的活動を表示するには、魚腫瘍のうち全台紙のイメージング後解剖にしたことがあります。</li>
</ol>

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萌芽期の開発および人間の病気中の細胞およびティッシュ レベル電気活動が長い時間前に発見されたが生体内での動的電気的変化とその生物学的役割まだ主は不明のまま。電気的変化を定量化を視覚化して主要な課題の 1 つです。パッチ ・ クランプの技術は単一のセルを追跡するため、休憩が、彼らは多くの細胞で構成されているために、脊椎動物の胚への応用は限られました。現在の電圧の化学染料も、感度、特異性、および毒性のために理想的ではありません。GEVIs の発明に関する最近の取り組み私たち体内細胞の電気活動を可視化する新しいパスを提供し、リアルタイムで。ここでは、我々 はゼブラフィッシュ電気記者ライン、Tg の作成のプロセスを示した (ユービーアイ:ASAP1)。
ゼブラフィッシュ胚における監視できる細胞の電気的活動を示す記者魚行を使用して、.電気の電圧変化は、初期胚の中に細胞周期に関連性の高い。我々 は、その過分極が起こる胸の谷間溝/細胞分裂 (図 3) の形成の前に観察しました。これは...

生体電気は、イオン チャネルと1の細胞膜にあるポンプを介する内因性電気信号を指します。細胞膜と結合電気潜在的な現在の変化の間でイオン交換が興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスを通知するに不可欠です。さらに、生体電気とイオン勾配エネルギー貯蔵、生合成および代謝産物の輸送を含む他の重要な生物学的機能のさまざまながあります。生体信号は、体軸、細胞周期、細胞分化1などの胚パターン形成の調節因子としても発見されました。したがって、シグナリングのこのタイプの誤規制から生じる多くの人間の先天性疾患を理解するために重要です。パッチク ランプは、単一のセルを記録するため広く使用されています、萌芽期の開発の生体の中に複数のセルの同時モニタリングのための理想には程遠いです。また、電圧敏感な小さな分子はまた生体内特異性、感度、毒性などのアプリケーションに最適ではありません。
多様性の創出遺伝子蛍光電圧インジケーター (GEVIs) を提供していますこの問題を克服するために新しいメカニズムをエンコードでき、萌芽期の開発の研究を簡単に適用にもかかわらず、本来神経を監視するためだった2,3のセルします。現在利用可能な GEVIs の 1 つは加速センサーの活動電位 1 (ASAP1)4です。それは電圧敏感なホスファターゼと円形に置換された緑色蛍光タンパク質の電位センサー ドメインの細胞外ループで構成されます。したがって、ASAP1 は、細胞電位変化の可視化 (偏波: 明るい緑色; 脱分極: ダーク グリーン)。ASAP1 が 2 ms オンとオフ反応ありサブスレッショルド潜在的な変更4を追跡することができます。したがって、この遺伝子解析ツールは生きているセルのリアルタイム生体監視機能の有効性の新しいレベルのことができます。萌芽期の開発で多くの人間の病気、癌などの生体電気の役割のさらなる理解が新しいに光を当てるメカニズム, 病気の治療と予防のために重大であります。
ゼブラフィッシュは、発生生物学、がん5,6を含む人間の病気の研究に強力な動物モデルを実証されています。彼らは、人間とオーソログ遺伝子の 70% を共有して同様の脊椎動物の生物学7。ゼブラフィッシュは、比較的簡単なケア、ラージ クラッチ サイズ卵、扱いやすい遺伝学、簡単な遺伝子、透明な外部萌芽期の開発、それらの生体内イメージング5,6の優れたシステムを作るを提供します。既に現在の突然変異体の魚行の大規模なソースと完全に配列されたゲノム、ゼブラフィッシュは科学的発見の比較的無制限の範囲を提供します。
生体内でリアルタイム電気細胞の活性を調べるためには、私たちはゼブラフィッシュ モデル システムと ASAP1 の活用します。本稿では、メダカ Tol2 トランスポゾン遺伝子導入を用いたゼブラフィッシュ ゲノムに電圧蛍光バイオ センサー ASAP1 を組み込む方法について説明し、萌芽期の開発、魚幼虫の動きの間にそしてライブ腫瘍細胞の電気活動を可視化します。.

<table><tbody><tr><td>14mL細胞培養チューブ</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>大腸菌培養</td></tr><tr><td>アガロース電気泳動タンク</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>フクロウ B2</td><td>DNA栄養症</td></tr><tr><td>アガロースRA</td><td>アムレスコ</td><td>N605-500G</td><td>注射ゲルを作るため</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F プライマー</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>ASAP1 サブクローニング用コード領域増幅</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R プライマー</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>ASAP1 サブクローニング用コード領域増幅</td></tr><tr><td>明視野解剖スコープ</td><td>ニコン</td><td>SMZ 745</td><td>デコレーション、マイクロインジェクション、マウント</td></tr><tr><td>カラーカメラ</td><td>ツァイ</td>ス <td>アクシオカム MRc</td><td>魚胚画像記録</td></tr><tr><td>凹型スライド</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>イメージングプロセス中に魚の胚を保持するため</td></tr><tr><td>使い捨てトランスファーピペット 3.4 ml</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>13-711-9AM</td><td>魚の胚と水移動</td></tr><tr><td>エンドヌクレアーゼ酵素、ない</td><td>I NEB</td><td>R0189L</td><td>プラスミドDNAの線形化用</td></tr><tr><td>エピフューレッセント化合物スコープ</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>魚胚イメージング</td></tr><tr><td>Epifuorescent stereo dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>魚胚イメージング</td></tr><tr><td>蛍光光源</td><td>Lumen dynamics</td><td>X-cite seris 120</td><td>蛍光顕微鏡用光源</td></tr><tr><td>鉗子 #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>デコレーションと針折る</td></tr><tr><td>ゲートウェイ BP Clonase II 酵素ミックス</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>ゲートウェイ BP組換えクローニング</td></tr><tr><td>ゲートウェイLRクロナーゼIIプラス酵素</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>12538120</td><td>ゲートウェイLR組換えクローニング</td></tr><tr><td>ゲルDNAリカバリーキット</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>DNAゲル精製</td></tr><tr><td>ローディングチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td>キャピラリー針への注入液のローディング用</td></tr><tr><td>メチルセルロース (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>魚の胚のマウント</td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M9140</td><td>ペトリ皿での真菌の発生を抑制</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションモールド</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td>注射中に魚の胚を保持するためのアガオルスモールドトレイを準備するには</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>WPI</td><td>空気圧ピコポンプ PV820</td><td>マイクロインジェクションインジェクター</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>WPI</td><td>マイクロインジェクター MM3301R</td><td>マイクロインジェクション操作</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター器具</td><td>P-1000</td><td>毛細管調製用</td></tr><tr><td>針 鉱物油</td><td>アムレスコ</td><td>J217-500ml</td><td>注射量校正用</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>AM1340</td><td>mRNA in vitro転写</td></tr><tr><td>単色カメラ</td><td>ツァイス</td><td>AxioCam MRm</td><td>魚の胚の画像記録</td></tr><tr><td>プラスミドMiniprepキット</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>少量のプラスミドDNAを調製</td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>イメージングプロセス中に魚または魚の胚を保持するため</td></tr><tr><td>RNA クリーン&Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>mRNA in vitro転写後のmRNAクリーニング</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNAおよびRNA濃度の測定用</td></tr><tr><td>ステージマイクロメーター</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>マイクロインジェクションボリュームキャリブレーション</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>遺伝子クローニング用DNA増幅</td></tr><tr><td>薄壁ガラスキャピラリー</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>キャッピラリー針を作るための生ガラス</td></tr><tr><td>Tol2-exL1プライマー</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 excise assay</td></tr><tr><td>Tol2-exR primer</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAG</td><td>Tol2 excise assay</td></tr><tr><td>TOP10 ケミカルコンピテント大腸菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>遺伝子クローニング</td></tr><tr><td>中の形質転換に使用トリカインメシル酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>魚または魚の胚の麻酔用</td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>DNAの可視化</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>遺伝子クローニングの形質転換プロセス用</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

生体電気、イオン チャネルを介する内因性電気シグナル伝達と細胞膜にあるポンプなど興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスおよび他の多くの生物学的プロセスのシグナル伝達に重要な役割を果たしている萌芽期発達のパターン。しかし、生体内で電気的活動は、脊椎動物の胚発生の監視の必要性があります。遺伝的コード化蛍光電圧インジケーター (GEVIs) の進歩はこのような課題に対してソリューションを提供する可能にしました。ここでは、確立された電圧インジケーター、ASAP1 を用いたトランスジェニック電圧インジケーター ゼブラフィッシュを作成する方法について説明 (加速センサーの活動電位 1)、例として。メダカ Tol2 キットとユビキタス ゼブラフィッシュ プロモーター、ユービーアイは本研究で選ばれました。我々 はまた、ゲートウェイ サイト固有のクローニング、メダカ Tol2 トランスポゾンを用いたゼブラフィッシュ遺伝子と正規 epifluorescent 顕微鏡を使用して初期段階魚胚および魚腫瘍イメージング プロセスのプロセスを説明します。この魚のラインを使用すると、ゼブラフィッシュ胚発生と魚の幼虫の動きの間に細胞の電気電圧の変化があることがわかった。さらに、いくつかのゼブラフィッシュ悪性末梢神経鞘腫瘍の周囲の正常組織に腫瘍細胞が一般に偏極が比較して観察されました。

成功した射出、以上 50% 注入魚胚体細胞に緑の蛍光性の程度が表示され、それらのほとんどはメダカ Tol2 トランスポゾン消費税法 (図 2) によってプラスになります。2 4 世代のアウトなしの野生型魚 (まで蛍光魚 50%、メンデルの予想比) とクロス後、遺伝子導入魚は、萌芽期の開発の間に細胞の膜電位を追跡するイメージングの実験のために使用されました。まず、膜電位変化は、ゼブラフィッシュ初期胚の発達段階の中に細胞周期を通じて調べた。胸の谷間形成 (3 a を図-3、および補足のビデオ 1) 前に細胞が過分極が観察されました。また、さまざまな組織を示したさまざまな膜電位 1-3 日で古い魚の胚。(図 3 Dより、3 g)。たとえば、距離と脊索が一般的に過分極、隣接組織/臓器と比較しています。Z...

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で。

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

この手順の全体的な目標は、胚形成、幼虫の移動、および腫瘍発生における細胞の電気的変化を観察できるトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作成することです。この方法は、発生生物学、生理学、およびがん細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。たとえば、胚形成中および腫瘍細胞における細胞電気シグナル伝達の基本的な役割は何か?この技術の主な利点は、細胞の電気シグナル伝達をin vivoでリアルタイムに追跡できることです。テキストプロトコルに従ってTol2トランスポゼースmRNAと注射液を調製した後、注射の前の午後に、少なくとも2人の雄と2人の雌を含む4〜6個の繁殖タンクを設置しました。魚の排泄物の量を減らし、繁殖反応を誘発するために、午後に魚に餌を与えることは避けてください。翌朝、準備した注入液をマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。魚の飼育水槽の仕切りを引っ張り、魚が交尾するのを待ちます。一般的に、魚は20〜30分以内に卵を産みます。待っている間、次のパラメーターを持つマイクロピペットプーラーを使用して、キャピラリーガラスから針を引き抜きます。実験室用ワイプを使用して針の端を折り、斜めのエッジを作成します。胚の死亡率を減らすためには、直径が小さいことが好ましい。魚が卵を産んだら、直径10センチのシャーレに卵を集めます。直ちに解剖顕微鏡下で、異常胚と魚の排泄物をすべて取り除きます。次に、受精した胚を調製した3%アガロース射出成形型にピペットで移します。胚を所定の位置に保つために、余分な水分を取り除きます。すべての列が生存可能な胚で満たされたら、単一細胞がすべて針に対して水平方向に45度の角度になるようにそれらを配置します。これにより、後で注入がはるかに簡単になります。次に、手袋を着用したまま、20マイクロリットルのローディングピペットチップを使用して、準備したコンストラクトの5マイクロリットルを氷上のチューブから取り出します。ピペットの先端を、折れた毛細管の後端に慎重に挿入し、先細りになり始めるところまでして、試薬をできるだけ先端に近づけてキャピラリーに排出します。それでも気泡が残っている場合は、先端が壊れないように針を振ってください。針をマイクロインジェクションニードルホルダーにまっすぐ挿入し、針が所定の位置に留まるまで慎重に締めます。次に、角度を約45度に調整します。針を準備して取り付けたら、顕微鏡とガス圧タンクの電源を入れます。保持用として約0.5PSI、排出用として約30PSIを使用して注入量を調整します。ペダルを踏むと、溶液が針から排出されることを確認してください。鉱油を滴下したステージマイクロメータを使用して、溶液の量と流量を直径約10マイクロメートルに調整します。背圧によって少量の溶液が針から滴り落ちることを確認してください。背圧が足りないと、毛細管現象により液体が針に入り、mRNAが破壊されます。針が較正されたら、ゲルノッチの端を使用して受精胚の単一細胞に針を挿入し、胚を所定の位置に保持し、針が胚を動かさずに圧力を加えることを可能にするバッキングを提供します。針の先端がシングルセルに入ったら、ペダルを踏んで必要な量の溶液を放出します。トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するためには、卵黄ではなく細胞に溶液を注入することが重要です。このプロセスをすべての胚に対して繰り返します。完了したら、廃棄用の3.4ミリリットルのトランスファーピペットと魚のシステム水を使用して、注入した胚をアガロースのノッチから洗い流すことにより、ラベル付きの皿に移します。胚を摂氏28.5度のインキュベーターに保管して、成長させます。一日中戻って死んだ魚の胚を取り除き、魚の水の水を0.1%メチレンブルーに置き換えてください。注射後約6〜8時間後、10個の注入された魚の胚とホットショット法を使用してゲノムDNAを調製します。翌朝、蛍光光源を備えた解剖顕微鏡を使用して、非卵黄組織にGFPを示す胚を選別します。これらの胚は、注入されたコンストラクトを含むべきである。Tol2物品税アッセイを実施して、前述のようにトランスポゾン活性を確認します。切除した血漿を検出できる場合は、注入した魚の胚を保持し、それらを育てます。それ以外の場合は、Tol2 mRNA合成とマイクロインジェクションプロセスを繰り返して、Tol2物品税アッセイで良好な結果が得られます。ゼブラフィッシュの胚を画像化するには、F2世代の創始魚と野生型の魚を個々のペアで横断します。ゼブラフィッシュのステージングガイドに従って、さまざまな望ましい発生段階で魚の胚を収集します。魚系水中の初期段階の魚の胚については、解剖スコープの下で、一対の鉗子を使用して慎重に絨毛膜を剥がし、除去します。廃棄移送ピペットを使用して、3%メチルセルロースを含む凹面ガラススライドにいくつかの胚を移します。次に、解剖スコープの下にある針を使用して、胚を目的の位置に調整し、細胞GFP活性を観察します。体節期が12未満の胚の場合は、イメージング用の互換性のあるカメラとソフトウェアを備えた落射蛍光化合物顕微鏡を使用してください。体節12期を過ぎた胚には、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。腫瘍細胞電圧を画像化するには、まず悪性末梢神経鞘腫瘍またはMPNSTの魚を特定します。直径10cmのシャーレに魚を入れ、ホールマウントイメージングを行います。最後に、イメージング後、腫瘍細胞の電気的活動を見る前に腫瘍を解剖します。注入が成功すると、注入された胚の50%以上が体細胞にある程度のGFPを示し、そのほとんどがTol2トランスポゾン物品排出アッセイで陽性の結果を示します。ここでは、ゼブラフィッシュの初期胚発生における細胞周期全体にわたる膜電位の変化を調べました。このタイムラプスビデオに見られるように、細胞は切断溝が形成される前に過分極しました。さらに、異なる組織は、1〜3日齢の魚の胚でさまざまな膜電位を示しました。例えば、体節と脊髄は、隣接する組織や臓器と比較して、一般的に過分極していました。この生後2日齢の魚の胚では、運動中に神経筋の電気的活動が示され、電気シグナル伝達に対応する色の密度が変化します。がん細胞の生体電気特性を、ASAP1レポーターフィッシュと自然発生的なMPNSTを起こしやすいRPL35変異体と交配した胚で調べました。周囲の組織と比較して、腫瘍細胞はより分極化していました。このマイクロインジェクション技術は、一度習得すれば、適切に行えば約3時間で行うことができます。この手順を試みる際には、理想的な結果を得るためには、ゼブラフィッシュの胚が1細胞期にある必要があることを覚えておくことが重要です。この技術の開発により、発生生物学および細胞生物学の分野の研究者が、ゼブラフィッシュやその他のモデル生物の生体内電気シグナル伝達の変化を探求する道が開かれます。このビデオを見れば、マイクロインジェクションによるトランスジェニックゼブラフィッシュラインの作り方を十分に理解できるはずです。

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

JoVE Journal

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