ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

この手順の全体的な目標は、胚形成、幼虫の移動、および腫瘍発生における細胞の電気的変化を観察できるトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作成することです。この方法は、発生生物学、生理学、およびがん細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。たとえば、胚形成中および腫瘍細胞における細胞電気シグナル伝達の基本的な役割は何か?この技術の主な利点は、細胞の電気シグナル伝達をin vivoでリアルタイムに追跡できることです。

テキストプロトコルに従ってTol2トランスポゼースmRNAと注射液を調製した後、注射の前の午後に、少なくとも2人の雄と2人の雌を含む4〜6個の繁殖タンクを設置しました。魚の排泄物の量を減らし、繁殖反応を誘発するために、午後に魚に餌を与えることは避けてください。翌朝、準備した注入液をマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。

魚の飼育水槽の仕切りを引っ張り、魚が交尾するのを待ちます。一般的に、魚は20〜30分以内に卵を産みます。待っている間、次のパラメーターを持つマイクロピペットプーラーを使用して、キャピラリーガラスから針を引き抜きます。

実験室用ワイプを使用して針の端を折り、斜めのエッジを作成します。胚の死亡率を減らすためには、直径が小さいことが好ましい。魚が卵を産んだら、直径10センチのシャーレに卵を集めます。

直ちに解剖顕微鏡下で、異常胚と魚の排泄物をすべて取り除きます。次に、受精した胚を調製した3%アガロース射出成形型にピペットで移します。胚を所定の位置に保つために、余分な水分を取り除きます。

すべての列が生存可能な胚で満たされたら、単一細胞がすべて針に対して水平方向に45度の角度になるようにそれらを配置します。これにより、後で注入がはるかに簡単になります。次に、手袋を着用したまま、20マイクロリットルのローディングピペットチップを使用して、準備したコンストラクトの5マイクロリットルを氷上のチューブから取り出します。

ピペットの先端を、折れた毛細管の後端に慎重に挿入し、先細りになり始めるところまでして、試薬をできるだけ先端に近づけてキャピラリーに排出します。それでも気泡が残っている場合は、先端が壊れないように針を振ってください。針をマイクロインジェクションニードルホルダーにまっすぐ挿入し、針が所定の位置に留まるまで慎重に締めます。

次に、角度を約45度に調整します。針を準備して取り付けたら、顕微鏡とガス圧タンクの電源を入れます。保持用として約0.5PSI、排出用として約30PSIを使用して注入量を調整します。

ペダルを踏むと、溶液が針から排出されることを確認してください。鉱油を滴下したステージマイクロメータを使用して、溶液の量と流量を直径約10マイクロメートルに調整します。背圧によって少量の溶液が針から滴り落ちることを確認してください。

背圧が足りないと、毛細管現象により液体が針に入り、mRNAが破壊されます。針が較正されたら、ゲルノッチの端を使用して受精胚の単一細胞に針を挿入し、胚を所定の位置に保持し、針が胚を動かさずに圧力を加えることを可能にするバッキングを提供します。針の先端がシングルセルに入ったら、ペダルを踏んで必要な量の溶液を放出します。

トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するためには、卵黄ではなく細胞に溶液を注入することが重要です。このプロセスをすべての胚に対して繰り返します。完了したら、廃棄用の3.4ミリリットルのトランスファーピペットと魚のシステム水を使用して、注入した胚をアガロースのノッチから洗い流すことにより、ラベル付きの皿に移します。

胚を摂氏28.5度のインキュベーターに保管して、成長させます。一日中戻って死んだ魚の胚を取り除き、魚の水の水を0.1%メチレンブルーに置き換えてください。注射後約6〜8時間後、10個の注入された魚の胚とホットショット法を使用してゲノムDNAを調製します。

翌朝、蛍光光源を備えた解剖顕微鏡を使用して、非卵黄組織にGFPを示す胚を選別します。これらの胚は、注入されたコンストラクトを含むべきである。Tol2物品税アッセイを実施して、前述のようにトランスポゾン活性を確認します。

切除した血漿を検出できる場合は、注入した魚の胚を保持し、それらを育てます。それ以外の場合は、Tol2 mRNA合成とマイクロインジェクションプロセスを繰り返して、Tol2物品税アッセイで良好な結果が得られます。ゼブラフィッシュの胚を画像化するには、F2世代の創始魚と野生型の魚を個々のペアで横断します。

ゼブラフィッシュのステージングガイドに従って、さまざまな望ましい発生段階で魚の胚を収集します。魚系水中の初期段階の魚の胚については、解剖スコープの下で、一対の鉗子を使用して慎重に絨毛膜を剥がし、除去します。廃棄移送ピペットを使用して、3%メチルセルロースを含む凹面ガラススライドにいくつかの胚を移します。

次に、解剖スコープの下にある針を使用して、胚を目的の位置に調整し、細胞GFP活性を観察します。体節期が12未満の胚の場合は、イメージング用の互換性のあるカメラとソフトウェアを備えた落射蛍光化合物顕微鏡を使用してください。体節12期を過ぎた胚には、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。

腫瘍細胞電圧を画像化するには、まず悪性末梢神経鞘腫瘍またはMPNSTの魚を特定します。直径10cmのシャーレに魚を入れ、ホールマウントイメージングを行います。最後に、イメージング後、腫瘍細胞の電気的活動を見る前に腫瘍を解剖します。

注入が成功すると、注入された胚の50%以上が体細胞にある程度のGFPを示し、そのほとんどがTol2トランスポゾン物品排出アッセイで陽性の結果を示します。ここでは、ゼブラフィッシュの初期胚発生における細胞周期全体にわたる膜電位の変化を調べました。このタイムラプスビデオに見られるように、細胞は切断溝が形成される前に過分極しました。

さらに、異なる組織は、1〜3日齢の魚の胚でさまざまな膜電位を示しました。例えば、体節と脊髄は、隣接する組織や臓器と比較して、一般的に過分極していました。この生後2日齢の魚の胚では、運動中に神経筋の電気的活動が示され、電気シグナル伝達に対応する色の密度が変化します。

がん細胞の生体電気特性を、ASAP1レポーターフィッシュと自然発生的なMPNSTを起こしやすいRPL35変異体と交配した胚で調べました。周囲の組織と比較して、腫瘍細胞はより分極化していました。このマイクロインジェクション技術は、一度習得すれば、適切に行えば約3時間で行うことができます。

この手順を試みる際には、理想的な結果を得るためには、ゼブラフィッシュの胚が1細胞期にある必要があることを覚えておくことが重要です。この技術の開発により、発生生物学および細胞生物学の分野の研究者が、ゼブラフィッシュやその他のモデル生物の生体内電気シグナル伝達の変化を探求する道が開かれます。このビデオを見れば、マイクロインジェクションによるトランスジェニックゼブラフィッシュラインの作り方を十分に理解できるはずです。