受容体リガンドの相互作用の解離定数の決定法として elisa 法の滴定

この滴定ELISAの全体的な目的は、新しいアルゴリズムを用いて、2つの結合パートナーの親和定数を再現性があり効率的な方法で決定することです。この方法は、タンパク質リガンド相互作用と受容体研究の分野だけでなく、医薬品研究や薬理学などの応用生命科学における重要な問題にも答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ELISAプレート上で受容体をリガンドで滴定し、新しい評価アルゴリズムを用いて、受容体リガンド相互作用の親和定数を簡単に決定できることです。

この手順を開始するには、Integrin Alpha 2 Aドメインのストック溶液をTBSマグネシウム塩化物バッファーで最終濃度5マイクログラム/ミリリットルに希釈します。この実演では、野生型と変異型の両方のIntegrin Alpha 2 Aドメインを使用します。ハーフエリアマイクロタイタープレートの1列の各ウェルに、Integrin Alpha 2 Aドメインコーティング溶液50マイクロリットルを充填します。

各滴定行を少なくとも重複2回行います。この例では、各滴定行を4重に実施します。プレートをホイルで密封し、4度セルシウスで一晩置きます。

翌日、コーティング溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー15マイクロリットルを充填します。洗浄溶液を取り除き、ウェルに新しい洗浄溶液を充填します。これらの洗浄は、物理的吸着によってプラスチック表面に固定されていない可溶性受容体分子を除去します。

次のステップは、非特異的な結合部位をブロックするために、各ウェルに50マイクロリットルの1パーセントBSA溶液をTBSマグネシウム塩化物バッファーで加えます。プレートを再密封し、室温で1時間インキュベートします。マイクロタイタープレートのウェルがBSAでブロックされている間に、リガンドであるロドセチンの連続希釈を準備します。

この場合、開始濃度は243エナメルエロデッドロドセチンで、希釈係数は2.3です。この実験の8つの滴定曲線のために、テストチューブ番号1に、一パーセントBSAのTBSマグネシウム塩化物中のロドセチン溶液の最高濃度で920マイクロリットルを調製します。テストチューブ番号2から11までラベル付けされた他の10個のテストチューブに、TBSマグネシウム塩化物中の一パーセントBSA溶液520マイクロリットルをピペットします。

テストチューブからテストチューブ2にロドセチン溶液400マイクロリットルを移し、チャッターを混合し、その後、この混合物から400マイクロリットルをテストチューブ3に移します。テストチューブ11までこの連続希釈を続けます。

この手順の成功のためには、ウェルが乾燥しないように、すべてのウェルを常に迅速に溶液で満たすことが重要です。1時間のインキュベーションが完了したら、マイクロタイタープレートのウェルからブロッキング溶液を取り除きます。すぐに、テストチューブ1からロドセチン溶液50マイクロリットルを1列のウェルに、テストチューブ2の溶液を2列のウェルに、そして11列まで加えます。

12列のウェルに、リガンドフリーコントロールとして、一パーセントBSAとTBSマグネシウム塩化物を50マイクロリットル加えます。プレートを再密封し、室温で1時間半インキュベートします。未結合のリガンド分子を除去するために、結合溶液を取り除き、各ウェルにHBSマグネシウム塩化液50マイクロリットルを充填します。

次に、HBSバッファーを取り除き、新しいHBSバッファーを加えます。受容体と結合したリガンドを化学的に固定するために、マイクロタイタープレートの各ウェルにHBSマグネシウム塩化物バッファー中の2.5パーセントグルタルアルデヒド溶液50マイクロリットルを充填します。マイクロタイタープレートを室温で10分間インキュベートします。

過剰なグルタルアルデヒドを除去し、固定溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー50マイクロリットルを充填して不活性化します。洗浄バッファーを取り除き、各ウェルに新しい洗浄バッファーを加えます。このアッセイを開始するために、マイクロタイタープレートのすべてのウェルから洗浄バッファーを取り除き、各ウェルに一パーセントBSA TBSマグネシウム塩化物に一対二千で希釈した一次抗体溶液50マイクロリットルを加えます。

プレートを再密封し、室温でインキュベートします。すべてのウェルから一次抗体溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー50マイクロリットルを加えます。TBSマグネシウム塩化物バッファーで3回洗浄します。

次に、各ウェルに一次抗体溶液50マイクロリットルを加えます。これはTBSマグネシウム塩化物中の一パーセントBSAで一対二千で希釈されています。プレートを再密封し、室温で置きます。ウェルから二次抗体溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー50マイクロリットルを加えます。

3回洗浄します。3回目の洗浄の後、マイクロタイタープレートをティッシュクロスの上にタップして、すべての液体痕跡を除去します。マルチチャンネルピペットを使用して、マイクロタイタープレートの各ウェルにアルカリホスファターゼ検出溶液50マイクロリットルを迅速に加え、酵素的変換をできるだけ同時に開始します。

最も高いリガンド濃度のウェルの溶液が黄色になるまで、室温でプレートをインキュベートします。信号強度に応じて、インキュベーション時間は5分から1時間の間で変動する可能性があります。アルカリホスファターゼ検出溶液の順序で、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに1.5モルの水酸化ナトリウム溶液50マイクロリットルを加えてホスファターゼ基質の変換を停止します。

プレートを数分間放置して、両溶液の縞のない混合を確保します。ELISAリーダーを使用して、各ウェルの405ナノメートルでの光密度を測定します。生のデータテーブルを開いてデータ分析を開始します。

Excelファイルから列をコピーし、Graph Pad Prism Fiveを開き、メインメニューで新しいプロジェクトファイルを開き、新しいデータとグラフの下で、XY形式を選択します。Y軸の各値に対して、Y軸の単一ポイントを入力してプロットするオプションを選択し、それぞれXとy値としてGraph Pad Prismのデータシートにペーストします。405ナノメートルでの光密度値を列形式に変換します。

データシートでは、最初の列がX値として添加されたリガンドの濃度を表し、右側の列には8つの滴定曲線の信号値がY値として含まれています。半対数プロットが描かれる予定であるため、リガンドフリーコントロールの信号をカウントする最後の行、濃度ゼロは削除されます。Graph Pad Prismは、グラフセクションで見られるプロットを描画します。

X軸には、半対数スケーリングが選択されています。X軸は、405ナノメートルでのOD値として測定された信号値を示しています。シンボルのいずれかをダブルクリックすることで、それらを選択し、単純な形状と色でマークすることができます。

野生型の形態の滴定値は異なる赤色の