受容体リガンドの相互作用の解離定数の決定法として elisa 法の滴定
2018年2月15日
Elisa 法の滴定を実行する詳細なプロトコルを説明します。また、滴定 Elisa を評価し、マイクロタイター プレート固定受容体に水溶性リガンドの結合の解離定数を取得する新たなアルゴリズムが表示されます。
この滴定ELISAの全体的な目的は、新しいアルゴリズムを用いて、2つの結合パートナーの親和定数を再現性があり効率的な方法で決定することです。この方法は、タンパク質リガンド相互作用と受容体研究の分野だけでなく、医薬品研究や薬理学などの応用生命科学における重要な問題にも答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ELISAプレート上で受容体をリガンドで滴定し、新しい評価アルゴリズムを用いて、受容体リガンド相互作用の親和定数を簡単に決定できることです。
この手順を開始するには、Integrin Alpha 2 Aドメインのストック溶液をTBSマグネシウム塩化物バッファーで最終濃度5マイクログラム/ミリリットルに希釈します。この実演では、野生型と変異型の両方のIntegrin Alpha 2 Aドメインを使用します。ハーフエリアマイクロタイタープレートの1列の各ウェルに、Integrin Alpha 2 Aドメインコーティング溶液50マイクロリットルを充填します。
各滴定行を少なくとも重複2回行います。この例では、各滴定行を4重に実施します。プレートをホイルで密封し、4度セルシウスで一晩置きます。
翌日、コーティング溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー15マイクロリットルを充填します。洗浄溶液を取り除き、ウェルに新しい洗浄溶液を充填します。これらの洗浄は、物理的吸着によってプラスチック表面に固定されていない可溶性受容体分子を除去します。
次のステップは、非特異的な結合部位をブロックするために、各ウェルに50マイクロリットルの1パーセントBSA溶液をTBSマグネシウム塩化物バッファーで加えます。プレートを再密封し、室温で1時間インキュベートします。マイクロタイタープレートのウェルがBSAでブロックされている間に、リガンドであるロドセチンの連続希釈を準備します。
この場合、開始濃度は243エナメルエロデッドロドセチンで、希釈係数は2.3です。この実験の8つの滴定曲線のために、テストチューブ番号1に、一パーセントBSAのTBSマグネシウム塩化物中のロドセチン溶液の最高濃度で920マイクロリットルを調製します。テストチューブ番号2から11までラベル付けされた他の10個のテストチューブに、TBSマグネシウム塩化物中の一パーセントBSA溶液520マイクロリットルをピペットします。
テストチューブからテストチューブ2にロドセチン溶液400マイクロリットルを移し、チャッターを混合し、その後、この混合物から400マイクロリットルをテストチューブ3に移します。テストチューブ11までこの連続希釈を続けます。
この手順の成功のためには、ウェルが乾燥しないように、すべてのウェルを常に迅速に溶液で満たすことが重要です。1時間のインキュベーションが完了したら、マイクロタイタープレートのウェルからブロッキング溶液を取り除きます。すぐに、テストチューブ1からロドセチン溶液50マイクロリットルを1列のウェルに、テストチューブ2の溶液を2列のウェルに、そして11列まで加えます。
12列のウェルに、リガンドフリーコントロールとして、一パーセントBSAとTBSマグネシウム塩化物を50マイクロリットル加えます。プレートを再密封し、室温で1時間半インキュベートします。未結合のリガンド分子を除去するために、結合溶液を取り除き、各ウェルにHBSマグネシウム塩化液50マイクロリットルを充填します。
次に、HBSバッファーを取り除き、新しいHBSバッファーを加えます。受容体と結合したリガンドを化学的に固定するために、マイクロタイタープレートの各ウェルにHBSマグネシウム塩化物バッファー中の2.5パーセントグルタルアルデヒド溶液50マイクロリットルを充填します。マイクロタイタープレートを室温で10分間インキュベートします。
過剰なグルタルアルデヒドを除去し、固定溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー50マイクロリットルを充填して不活性化します。洗浄バッファーを取り除き、各ウェルに新しい洗浄バッファーを加えます。このアッセイを開始するために、マイクロタイタープレートのすべてのウェルから洗浄バッファーを取り除き、各ウェルに一パーセントBSA TBSマグネシウム塩化物に一対二千で希釈した一次抗体溶液50マイクロリットルを加えます。
プレートを再密封し、室温でインキュベートします。すべてのウェルから一次抗体溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー50マイクロリットルを加えます。TBSマグネシウム塩化物バッファーで3回洗浄します。
次に、各ウェルに一次抗体溶液50マイクロリットルを加えます。これはTBSマグネシウム塩化物中の一パーセントBSAで一対二千で希釈されています。プレートを再密封し、室温で置きます。ウェルから二次抗体溶液を取り除き、各ウェルにTBSマグネシウム塩化物バッファー50マイクロリットルを加えます。
3回洗浄します。3回目の洗浄の後、マイクロタイタープレートをティッシュクロスの上にタップして、すべての液体痕跡を除去します。マルチチャンネルピペットを使用して、マイクロタイタープレートの各ウェルにアルカリホスファターゼ検出溶液50マイクロリットルを迅速に加え、酵素的変換をできるだけ同時に開始します。
最も高いリガンド濃度のウェルの溶液が黄色になるまで、室温でプレートをインキュベートします。信号強度に応じて、インキュベーション時間は5分から1時間の間で変動する可能性があります。アルカリホスファターゼ検出溶液の順序で、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに1.5モルの水酸化ナトリウム溶液50マイクロリットルを加えてホスファターゼ基質の変換を停止します。
プレートを数分間放置して、両溶液の縞のない混合を確保します。ELISAリーダーを使用して、各ウェルの405ナノメートルでの光密度を測定します。生のデータテーブルを開いてデータ分析を開始します。
Excelファイルから列をコピーし、Graph Pad Prism Fiveを開き、メインメニューで新しいプロジェクトファイルを開き、新しいデータとグラフの下で、XY形式を選択します。Y軸の各値に対して、Y軸の単一ポイントを入力してプロットするオプションを選択し、それぞれXとy値としてGraph Pad Prismのデータシートにペーストします。405ナノメートルでの光密度値を列形式に変換します。
データシートでは、最初の列がX値として添加されたリガンドの濃度を表し、右側の列には8つの滴定曲線の信号値がY値として含まれています。半対数プロットが描かれる予定であるため、リガンドフリーコントロールの信号をカウントする最後の行、濃度ゼロは削除されます。Graph Pad Prismは、グラフセクションで見られるプロットを描画します。
X軸には、半対数スケーリングが選択されています。X軸は、405ナノメートルでのOD値として測定された信号値を示しています。シンボルのいずれかをダブルクリックすることで、それらを選択し、単純な形状と色でマークすることができます。
野生型の形態の滴定値は異なる赤色の
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概要
この記事では、受容体-リガンド相互作用の親和性定数の測定を行うための詳細な逓度法ELISAプロトコルを説明します。結果を効率的に評価するために新しいアルゴリズムが導入され、タンパク質相互作用と薬理学の研究を支援します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 薬理学
背景
- 受容体-リガンド相互作用の理解は様々な生物学分野で重要です。
- 従来の方法は効率性と再現性に欠ける可能性があります。
- 逓度法ELISAは結合親和性を測定するための体系的なアプローチを提供します。
- 新しいアルゴリズムにより、より正確なデータ評価が可能になります。
研究目的
- 親和性定数を決定するための信頼性の高い方法を開発すること。
- タンパク質-リガンド相互作用研究を促進すること。
- 医薬品応用のためのツールを提供すること。
使用された方法
- TBSマグネシウム塩化物バッファーでIntegrin Alpha 2 Aドメインを希釈すること。
- 受容体溶液でマイクロタイタープレートをコーティングすること。
- データ分析に新しい評価アルゴリズムを利用すること。
- 野生型と変異型Integrin Alpha 2 Aドメインの比較。
主要な結果
- この方法により親和性定数を容易に決定できます。
- 結果は異なる試行間での再現性を示しています。
- 新しいアルゴリズムは結合相互作用の正確な評価を提供します。
- 得られた洞察は医薬品研究と受容体研究に影響を与える可能性があります。
結論
- 逓度法ELISAは受容体-リガンド相互作用を研究するのに効果的です。
- 新しいアルゴリズムはデータ分析の効率性を大幅に改善します。
- このアプローチは様々な応用生命科学の研究を進展させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate determination of receptor-ligand dissociation constants is essential for target validation and lead optimization in drug discovery. This titration ELISA method, enhanced by a novel non-linear regression algorithm, enables reproducible affinity measurements without graphical estimation, supporting data-driven go/no-go decisions. The approach improves predictive confidence in early discovery by quantifying binding strength across ligand variants and receptor mutants.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables quantitative comparison of ligand binding affinity to wild-type and mutant receptors, supporting hypothesis testing of structure-activity relationships.
- Operational Value: Provides direct dissociation constant output from raw signal data, reducing variability in affinity ranking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized titration curves for multiple ligands simultaneously, enabling parallel screening of compound libraries against immobilized targets.
- Operational Value: Uses ELISA-compatible detection, allowing integration into existing immunoassay platforms for scalable affinity profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures binding-active receptor concentration alongside Kd, informing target engagement predictions in disease-relevant systems.
- Operational Value: Delivers statistically evaluable parameters from replicate titration curves, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative affinity data informs prioritization and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying how mutations or modifications alter ligand binding affinity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding signals that enable reliable compound evaluation across concentration ranges.
- Analytics: Outputs dissociation constant and receptor concentration via non-linear regression, providing comparable readouts for structure-activity analysis.
- Translational Research: Connects in vitro binding data to preclinical continuity by characterizing affinity shifts in mutant receptors relevant to drug resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for affinity profiling across diverse protein-ligand pairs, reducing reliance on low-throughput alternatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions through accurate, algorithm-driven Kd determination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of affinity measurements across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid affinity ranking of ligands and mutants, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of drug candidates based on quantitative binding data and receptor engagement potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, ELISA techniques, and non-linear regression analysis using software such as GraphPad Prism.
- Dependent on access to microtiter plate readers, pipetting systems, and incubation controls for reproducible ligand titration.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, blocking agents, and fixation protocols to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different receptor-ligand pairs, particularly regarding immobilization efficiency and ligand stability.
- Includes practical limitations such as potential epitope disruption from glutaraldehyde fixation, which must be empirically validated for each target pair.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Immobilization of the Receptor (Integrin α2A-domain) to a Microtiter Plate
2:09
Preparation of a Serial Dilution Row of the Ligand (Rhodocetin)
3:25
Binding of Ligand at Different Concentrations to Immobilized Receptor
5:03
Quantification of Receptor-bound Ligand by ELISA
7:06
Evaluation of the Titration Signals
10:58
Conclusion
9:30
Results: Rhodocetin Binds with Lower Affinity to Mutant Integrin α2A-domain
