Name: エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶエレクトロスピニング法によるPCL人工血管の作製とラット腹部大動脈置換モデルでの長期的性能評価。構造と表面特性が血管再生に与える影響を解明し、高い再現性と動物生存率を実現する手法です。

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この作品は、NSFC プロジェクト (81522023、81530059、91639113、81772000、81371699、および 81401534) によって財政的に支えられました。

実験動物の使用は動物実験倫理委員会の南海大学によって承認され、ケアと実験動物の使用のためのガイドに従い実施します。
1. エレクトロスピニング PCL 移植片の作製
注: ここで、エレクトロスピニング法は、人工血管を作製する利用されました。
<ol><li>それぞれ、クロロホルム、メタノールの混合物で PCL を溶解することにより 25 wt % と 10 の wt % の PCL ソリューションを準備 (1:5 容積比) 12 時間 (RT) 室温で。</li>
	<li>10 mL ガラス製注射器に PCL ソリューションを読み込みます。</li>
	<li>21 G 針とシリンジを配置します。</li>
	<li>コレクション楽器にステンレス製マンドレル (長さ 25 cm、直径 2 mm) を配置します。</li>
	<li>25 wt % の PCL ソリューション、コレクターに針先端から 17 cm の作動距離、8 mL/h の流量と 11 の電圧を使用して厚い繊維移植、エレクトロスピニング パラメーターとして kV。シンナー-光ファイバー移植、10 wt %、コレクターに針の先端から 20 cm の作動距離、2 mL/h の流量および 18 の電圧の PCL ソリューションを使用エレクトロスピニング パラメーターとして kV。</li>
	<li>残留溶媒を除去するため一晩に真空で得られた移植が置かれることを確認します。手続きの前にすべての機器を消毒し、全体の無菌技術を維持します。</li>
	<li>注入前に 30 分の 75% エタノール 10 mL でそれらを浸すと、一晩で露出紫外線にグラフトを消毒します。</li>
	<li>繊維と細孔のサイズ測定: 走査電子顕微鏡 (SEM) 像に基づく ImageJ ソフトウェアを使用して平均繊維径を計算。</li>
	<li>機械足場のテスト:<ol>
<li>かみそりの刃を使用して長さで 3 mm セクションに鋼管足場をカットします。マイクロメータを使用して足場の厚さを測定します。</li>
		<li>100 名の負荷容量を持つ引張試験機に鋼管足場を配置します。</li>
		<li>破裂まで 1 mm 間クランプと縦 10 mm/分の速度で引っ張り足場をクランプします。引張強さと伸びの究極を測定します。初期の線形領域からヤング率を計算する (5% 歪み最大) 応力-ひずみ曲線の。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ラット大動脈移植モデル
注: すべての材料、手術で使用される楽器は、滅菌です。外科の間に演算子がガーゼのマスクと感染症を避けるために滅菌手袋を着ていることを確認します。部屋の温度は動物の体温を維持するために 27-30 ° C に保たれてを確認します。鎮痛に関するローカル IACUC ガイドラインに従います。
<ol><li>血管の受信者として 240 270 グラムの重量を量る男性スプレイグ ラットを使用します。ラットは手術前に、24 時間絶食して、確認します。24 時間絶食ラットの目的は空腸内の糞便、十分に地平線を広げるオペレーターの。</li>
	<li>ラットの首の後ろをつかんで、その頭を保つ springe 針を下腹部の腹腔内に挿入します。腹腔内投与によって抱水クロラール (330 mg/kg) と麻酔ラットを誘発します。</li>
	<li>ラットが筋肉と安定した呼吸を緩和して確保することによって適切な anesthetization を確認します。手術顕微鏡下でラットを仰臥位で配置します。</li>
	<li>麻酔中の乾燥を防ぐため目に眼獣医のワセリン軟膏を適用します。手術前に尾静脈注射によってヘパリン生理食塩液 (50 UI/mL) 抗凝固療法 (100 UI/kg) を管理します。</li>
	<li>かみそりの刃を使用して前方の腹部壁の毛を剃り落とすし、ヨード溶液および医療アルコール溶液を使用して肌をきれい。</li>
	<li>外科はさみで正中開腹切開を行うと確実に約 4-5 cm 長く、切開し、腹腔内を公開します。</li>
	<li>撤回し、優先的に食塩水で湿らせたガーゼで腸をラップします。</li>
	<li>腹部大動脈を慎重に分析します。</li>
	<li>識別し、9-0 モノフィラメント ナイロン縫合糸を使用してすべての小さな枝を結紮します。</li>
	<li>孤立した部分をクランプ (長さ 1 cm まで) の 2 つの血管クランプを用いた大動脈。大動脈は、20-30 分の固定に残ることができます。</li>
	<li>吻合部のサイトを作成するマイクロはさみを使用して 2 つのクランプの間に腹部大動脈を縦断面します。</li>
	<li>ヘパリン生理食塩水 (50 UI/mL) ソリューションを使用して残血を削除する大動脈の 2 つの端をフラッシュします。</li>
	<li>マイクロはさみを使用して外膜をはがします。</li>
	<li>9-0 モノフィラメント ナイロン縫合糸を使っての 8の字縫合パターンを内径 2 mm とのラットの腹部大動脈に長さ 1 cm グラフトを吻合します。</li>
	<li>まず、9、3、12、および近位側で 6 位置の順序に従って 4 つの吻合を構築し、4 針縫合糸 2 つ間で切り口を吻合します。近位部の縫合を終えた後に、同じ方法で遠位側を縫合します。 注: すべてのステッチがネイティブ側やや移植に埋め込まれていることを確認する必要です。</li>
	<li>近位部のクランプを外し、接木に流れ込む血液を許可する遠位クランプを削除します。</li>
	<li>滅菌綿球または小さなガーゼを使用して出血を止めるため縫合糸の末端を押してください。止血まで約 3 分間押します。</li>
	<li>腹腔内に腸を返します。</li>
	<li>ゲンタマイシン (320 U/mL) 暖かい生理食塩液を用いた腹腔内をフラッシュします。</li>
	<li>筋肉と皮膚の層でそれぞれ 3-0 ナイロン縫合糸を使用して腹壁を縫います。</li>
	<li>清潔で乾燥したケージにラットを置き、動物の体の温度を維持するためにケージの下で加熱パッドを入れてください麻酔から回復するラットの待ちます。それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで動物に出席します。</li>
	<li>後意識を取り戻すことは、食品と水で単一のケージでラットを置きます。手術後の感染を防ぐために傷口にヨウ素を適用します。それが完全に回復するまで、他の動物の会社にネズミを返します。</li>
	<li>あらかじめ決められた時点で制度のガイドラインによるとラットを安楽死させます。</li>
</ol>

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<li>Rnjak-Kovacina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+porosity+and+pore+size+of+electrospun+synthetic+human+elastin+scaffolds+for+dermal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).</li>
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<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
<li>Tara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-organized+neointima+of+large-pore+poly%28L-lactic+acid%29+vascular+graft+coated+with+poly%28L-lactic-co-epsilon-caprolactone%29+prevents+calcific+deposition+compared+to+small-pore+electrospun+poly%28L-lactic+acid%29+graft+in+a+mouse+aortic+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model.</a> Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).</li>
</ol>

著者は金融利害の対立があります。

再生の重要な細胞浸潤は、生体内で血管16の改造。限られた細胞浸潤は頻繁に細胞の血管壁への移行を妨げるグラフトの比較的小さな毛穴に関連します。この困難に対処するため大規模な細孔構造を持つエレクトロスピニング PCL 血管を準備する修正法を開発しました。詳しくは、細孔径は処理のパラメーターによって容易に制御できる線維厚の増加に伴い増加しました。結果、宿主細胞が簡単に体内注入後この多孔体血管の壁に浸透し、手術後 12 ヶ月間で明白なセル回帰せず比較的高いレベルで残っている、セル。
ネイティブ動脈主に成っている 3 つの層、内皮、, 中膜と外膜。抗血栓性インターフェイスとして内皮血管の長期開存性を維持する上で重要な役割を果たしています。本研究では、3 ヶ月で移植における血管内皮形成が観察されました。さらに、平滑筋細胞のいくつかの層から成るチュニカ メディアは、血管機能を調節し、動脈の適切な機械的性質を提供することで非常に重要。本研究では、厚い繊維、エレクトロスピニング PCL 移植し、機能チュニカ メディア...

合成ポリマーから作られた血管は、心血管疾患 (スッテパー) の治療のためのクリニック広く使用されています。残念ながら、小口径人工血管の場合 (D < 6 mm) は、成功した製品が、しばしば血栓症、内膜増殖症などにつながる減らされた血流速によって引き起こされる低開存のために利用合併症1。
ティッシュ ・ エンジニア リングは、長期的な開存性と血管再生の足場誘導と再構成に基づく恒常性を実現するために別の方法を提供します。詳しくは、血管移植三次元テンプレートとしてことができるメカニカル ・ サポートやガイダンスを提供構造維管束組織と影響の細胞機能、細胞接着、移行、増殖などの再生時に、細胞外マトリックス2の分泌。今までは、維管束組織工学用各種合成樹脂を評価されています。これらの高分子の中で poly(ε-caprolactone) (PCL) は良いセルの互換性と数ヶ月から 2 年間3に至るまで劣化を遅らせるために集中的に検討されている.優れた構造健全性開存、増加だけでなく、継続的に細胞浸潤と血管新生ラット大動脈モデル4,5,6、PCL 血管静電紡糸法による処理が展示されて、最大 6 ヶ月の壁を移植します。しかし、細胞と毛細血管と石灰化、回帰を含む不利な組織の改造もで観測した長い縦長を 18 ヶ月。
Cellularization 血管移植の組織再生を決定し、修繕7キー要因であります。エレクトロスピニング、汎用性の高い手法として採用されている広くナノ繊維構造8血管移植の準備のため。残念なことに、比較的小さな細孔構造はしばしばその後の組織再生を制限エレクトロスピニング血管で不十分な細胞浸潤に します。この問題を解決するには、様々 なテクニックは、細孔径と塩/高分子溶出9,10、コレクター装置、レーザー放射11 による治療後の変更を含む、全体的な気孔率を高めるため試行されています。、等。実際には、エレクトロスピニング移植 (ファイバー径、孔径、気孔率を含む) の構造は処理条件12,13に密着します。エレクトロスピニング、中に繊維の直径は、高分子溶液、流量、電圧などの濃度など、パラメーターを変更することにより容易に制御できます。14,15としたがって、細孔径と気孔率がそれに応じて強化され。
我々 は最近、多孔体構造 (5-7 μ m の直径 30-40 μ m の細孔の繊維) と変更された PCL エレクトロスピニング移植を報告しました。ラット腹部大動脈を置き換えることによって体内注入は、3 ヶ月手術後16で開存、として良好な血管内皮形成と平滑筋再生率が高いを示した。もっと重要なは、不利な組織の石灰化とセルの回帰を含む改造が認められなかったのも移植の 1 年後。

<table><tbody><tr><td>ポリ(&��;-カプロラクトン)(PCL)ペレット(Mn=80,000)</td><td>シグマ</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td>天<td>津化学試薬会社</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>アルコール天</td><td>津化学試薬会社</td><td>1083</td><td></td></tr>クロ<tr><td>ロホルム天</td><td>津化学試薬会社</td><td>A1007</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td>天<td>津Fengchuan会社</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley ラット</td><td>軍事医学</td><td></td><td></td>アカデミーの実験動物センター</tr><tr><td>正常生理食塩水</td><td>河北 Tiancheng 製薬会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロラール水和物</td><td>天津瑞金 化学会社</td><td>2223</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム注射</td><td>天津生化学 製薬会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン注射</td><td>江蘇省蓮水製薬会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス抗アルファ - SMA一次抗体</td><td>アブ</td><td>カムab7817</td><td></td></tr><tr><td>マウスアンチスムースMYH一次抗体</td><td>アブカム</td><td>ab683</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>ポリクローナル抗ラットエラスチン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab23748</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗フォン・ヴィレブランド因子一次抗体</td><td>アブカム</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150117</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>5% 正常ヤギ血清</td><td>中山ゴールデンブリッジ</td><td>ZLI9022</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E)</td><td>北京leagene</td><td>バイオテクノロジーDH0006</td><td></td></tr>マッ<tr><td>ソンのトリクローム</td><td>北京leagene</td><td>バイオテクノロジーDC0032</td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff-van Gieson(VVG)</td><td>北京leagene</td><td>バイオテクノロジーDC0059</td><td></td></tr>フォン<tr><td>Kossa</td><td>北京leagene</td><td>バイオテクノロジーDS0003</td><td></td></tr>糸<tr><td>と外科用縫合針、3-0シルク</td><td>上海金環医療用品会社</td><td>G3002b</td><td></td></tr><tr><td>糸付き外科用縫合針、9-0シルク</td><td>上海金環医療用品会社</td><td>H901</td><td></td></tr></tbody></table>

エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

ここでは、マクロポーラス PCL 人工血管を作製し、腹部大動脈置換のモデルラットを用いた評価プロトコルを記述するプロトコルを提案する.エレクトロスピニング血管は頻繁、グラフトに細胞浸潤を制限し、再生とネオ動脈の改造を妨げる比較的小さな毛穴を所有しています。本研究では厚い繊維 (5-6 μ m) と孔径が大きい (~ 30 μ m) PCL 血管を修正処理テクニックを使用して作製しました。腹部大動脈ラットモデルにおける注入によるグラフトの長期的なパフォーマンスを行った。超音波は、グラフト残った動脈瘤や狭窄注入の 12 ヶ月後も発生せず特許を示した。多孔体構造はセル成長を改善し、こうして推進組織 3 カ月で再生成されます。さらに、12 ヶ月後の血管壁内石灰化などの不利な改造の兆候だった。したがって、エレクトロスピニング PCL 血管処理変更した多孔体で保持長期的な注入のため動脈代替可能性を秘めて。

PCL 移植手術後 3ヶ月と 12 ヶ月で仔だったし、ヒアリン マッソン、その行動・ ヴァン ・維 (VVG)、コッサ、蛍光染色法による α-SMA のヘマトキシリンとエオシン (H &amp; E) の標準的な組織学的手法による分析MYH、vWF とエラスチン。組織学的イメージは、正立型顕微鏡を使用して撮影された、ﬂuorescence 顕微鏡を用いた蛍光抗体法により画像が撮影されました。
すべてのデータは、平均 ± SD. 表現されました。2 尾対学生のt-テストの違いを比較に使用されました。Pの値 &lt; 0.05 が統計的に重要であると考えられていた。
新規エレクトロスピニング PCL 移植最適化構造、厚い繊維と孔径が大きいと正常に、本研究で作製しました。平均繊維径が従来より変更された移...

PCL 血管太い繊維と、大きな細孔を製造するため腹部大動脈置換のラットモデルにおける生体内でのパフォーマンスを評価するためのプロトコルを記述する変更されたエレクトロスピニング法を紹介します。

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

この外科的介入の全体的な目標は、エレクトロスピニング血管移植片をラット腹部大動脈に移植し、移植片の長期的な性能を評価することです。この方法は、Deling Kong教授と私たちのグループの他の同僚によって確立されており、構造や移植片の表面特性が血管再生に及ぼす影響など、エレクトロスピニング血管グラフトの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、再現性が高く、動物の生存率が高いことです。また、動物モデルは低コストで管理が容易です。この作業は、同僚のWang博士が行います。まず、ポリカプロラクトンをメタノールとクロロホルムの1〜5混合物に溶解し、室温で12時間撹拌してポリマー溶液を調製します。ポリマー溶液を10ミリリットルのガラスシリンジに装填し、鈍い21ゲージの針を装備します。次に、収集機器にステンレス鋼のマンドレルを置き、適切に接地されていることを確認します。25%ポリカプロラクトン溶液の場合、針先からコレクターまでの作動距離を17センチメートルに調整します。次に、シリンジポンプの流量を毎時8ミリリットルに設定します。次に、電源の電圧を11キロボルトに設定し、40 RPMでマンドレル回転を開始して、電気紡糸されたファイバーを収集して適切なファイバー分布を実現します。すべての設定が完了したら、電源とシリンジポンプをオンにして、エレクトロスピニングファイバーの収集を開始します。4.5分後、シリンジポンプ、電源、マンドレルモーターの電源を切ります。移植片をフード内で1時間乾かします。次に、無水アルコールを使用してマンドレルからグラフトを取り出し、真空中に一晩置いて残留溶媒を取り除きます。移植片をエチレンオキシドで滅菌し、滅菌された生物学的封じ込めフードで乾燥させます。標準的な技術を使用して、グラフトの内腔のSEM画像を取得し、ImageJにインポートします。測定ツールを使用して、各画像の繊維径と平均細孔径の両方を測定し、サンプル間の一貫性を確保します。グラフト材料の機械的特性に関する情報を得るには、まず、かみそりの刃を使用して管状の足場を3ミリメートルのセクションに切断します。次に、キャリパーを使用して足場の厚さを測定します。次に、足場を引張試験機のグリップにロードし、グリップ間の間隔が1ミリメートルになるようにします。足場が破裂するまで、毎分10ミリメートルの速度で足場を軸方向に保持します。サンプルの引張強度と極限破断点伸びの両方を必ず記録してください。手術前に、着床手術の24時間前に、体重240〜270グラムの速い雄のSprague Dawleyラット。ラットに麻酔をかけ、付属のテキストプロトコルで説明されているように手術の準備をします。ラットの筋肉が弛緩し、呼吸が安定していることを確認することにより、適切な麻酔を確認します。次に、ラットを手術用顕微鏡の下に仰臥位に置きます。手術用ハサミを使用して、4〜5センチメートルの長さの正中線開腹切開を行い、腹腔を露出させます。慎重に引っ込めて、生理食塩水で湿らせたガーゼで腸を包みます。手術用顕微鏡を覗きながら、隣接する組織から腹部大動脈を剥がします。9-0モノフィラメントナイロン縫合糸を使用して、下行大動脈のすべての小さな枝を特定し、結紮します。次に、血管クランプを使用して、大動脈の1センチメートルの孤立した部分までクランプします。次に、マイクロハサミを使用して、クランプ間の腹部大動脈を横断します。ヘパリン化生理食塩水を使用して大動脈の両端を洗い流し、残留血液を取り除きます。マイクロハサミを使用して、クランプされた大動脈の外膜を剥がします。次に、滅菌したグラフトの1センチメートルの長さのセクションを、大動脈の除去されたセクションによって作成されたギャップに配置します。9-0モノフィラメントナイロン縫合糸を使用して、近位側の9時、3時、12時、6時の位置で8の字縫合パターンを使用して4つの吻合を構築します。次に、近位側の各縫合糸の間に他の 4 つの吻合を構築します。移植片を垂直に配置して、手術用顕微鏡下で8つのステッチ間の等間隔を示します。近位縫合を終えた後、遠位側でこのプロセスを繰り返します。移植片が取り付けられたら、遠位クランプを取り外して血液が移植片に流れ込むようにしてから、近位クランプを取り外します。滅菌コットンボールを使用して、縫合箇所で観察された出血を止めるために圧力をかけます。止血が起こるまで、約3分間押します。次に、腸を腹腔内に戻し、ゲンタマイシンを含む温かい生理食塩水を使用して腹腔を洗い流します。次に、筋肉層と皮膚層に3-0ナイロン縫合糸を使用して腹壁を縫い合わせます。手術後の切開部にヨウ素は一度だけ使用してください。ネズミが完全に回復したら、他の人の会社に戻します。エレクトロスピニング溶液中のポリカプロラクトンの濃度は、繊維の直径とグラフトの機械的特性の両方に影響を与える可能性があります。高濃度の25%溶液は、10%溶液よりも太い繊維と大きな細孔を持つ血管移植片を生成します。in vivoで3か月後、組織学的染色により、移植片の内腔に新しい組織の層が形成され、移植片自体にかなりの量のコラーゲンが沈着していることが明らかになりました。この新しい組織層には内皮細胞が敷かれており、その下に平滑筋細胞と円周方向に整列したエラスチンの両方の層があります。in vivoで12か月後、新しい組織はよく統合されているように見え、内皮層と平滑筋層は無傷のままでした。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1〜2時間で完了することができます。この手順に続いて、カラードップラー超音波などの他の測定を実行して、このビデオを見た後、エレクトロスピニング血管グラフトの製造方法を十分に理解し、ラット腹部動脈置換モデルでそのin vivo性能を評価する方法などの追加の質問に答えることができます。

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生物学

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エレクトロスピニングラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

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