エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

この外科的介入の全体的な目標は、エレクトロスピニング血管移植片をラット腹部大動脈に移植し、移植片の長期的な性能を評価することです。この方法は、Deling Kong教授と私たちのグループの他の同僚によって確立されており、構造や移植片の表面特性が血管再生に及ぼす影響など、エレクトロスピニング血管グラフトの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、再現性が高く、動物の生存率が高いことです。

また、動物モデルは低コストで管理が容易です。この作業は、同僚のWang博士が行います。まず、ポリカプロラクトンをメタノールとクロロホルムの1〜5混合物に溶解し、室温で12時間撹拌してポリマー溶液を調製します。

ポリマー溶液を10ミリリットルのガラスシリンジに装填し、鈍い21ゲージの針を装備します。次に、収集機器にステンレス鋼のマンドレルを置き、適切に接地されていることを確認します。25%ポリカプロラクトン溶液の場合、針先からコレクターまでの作動距離を17センチメートルに調整します。

次に、シリンジポンプの流量を毎時8ミリリットルに設定します。次に、電源の電圧を11キロボルトに設定し、40 RPMでマンドレル回転を開始して、電気紡糸されたファイバーを収集して適切なファイバー分布を実現します。すべての設定が完了したら、電源とシリンジポンプをオンにして、エレクトロスピニングファイバーの収集を開始します。

4.5分後、シリンジポンプ、電源、マンドレルモーターの電源を切ります。移植片をフード内で1時間乾かします。次に、無水アルコールを使用してマンドレルからグラフトを取り出し、真空中に一晩置いて残留溶媒を取り除きます。

移植片をエチレンオキシドで滅菌し、滅菌された生物学的封じ込めフードで乾燥させます。標準的な技術を使用して、グラフトの内腔のSEM画像を取得し、ImageJにインポートします。測定ツールを使用して、各画像の繊維径と平均細孔径の両方を測定し、サンプル間の一貫性を確保します。

グラフト材料の機械的特性に関する情報を得るには、まず、かみそりの刃を使用して管状の足場を3ミリメートルのセクションに切断します。次に、キャリパーを使用して足場の厚さを測定します。次に、足場を引張試験機のグリップにロードし、グリップ間の間隔が1ミリメートルになるようにします。

足場が破裂するまで、毎分10ミリメートルの速度で足場を軸方向に保持します。サンプルの引張強度と極限破断点伸びの両方を必ず記録してください。手術前に、着床手術の24時間前に、体重240〜270グラムの速い雄のSprague Dawleyラット

ラットに麻酔をかけ、付属のテキストプロトコルで説明されているように手術の準備をします。ラットの筋肉が弛緩し、呼吸が安定していることを確認することにより、適切な麻酔を確認します。次に、ラットを手術用顕微鏡の下に仰臥位に置きます。

手術用ハサミを使用して、4〜5センチメートルの長さの正中線開腹切開を行い、腹腔を露出させます。慎重に引っ込めて、生理食塩水で湿らせたガーゼで腸を包みます。手術用顕微鏡を覗きながら、隣接する組織から腹部大動脈を剥がします。

9-0モノフィラメントナイロン縫合糸を使用して、下行大動脈のすべての小さな枝を特定し、結紮します。次に、血管クランプを使用して、大動脈の1センチメートルの孤立した部分までクランプします。次に、マイクロハサミを使用して、クランプ間の腹部大動脈を横断します。

ヘパリン化生理食塩水を使用して大動脈の両端を洗い流し、残留血液を取り除きます。マイクロハサミを使用して、クランプされた大動脈の外膜を剥がします。次に、滅菌したグラフトの1センチメートルの長さのセクションを、大動脈の除去されたセクションによって作成されたギャップに配置します。

9-0モノフィラメントナイロン縫合糸を使用して、近位側の9時、3時、12時、6時の位置で8の字縫合パターンを使用して4つの吻合を構築します。次に、近位側の各縫合糸の間に他の 4 つの吻合を構築します。移植片を垂直に配置して、手術用顕微鏡下で8つのステッチ間の等間隔を示します。

近位縫合を終えた後、遠位側でこのプロセスを繰り返します。移植片が取り付けられたら、遠位クランプを取り外して血液が移植片に流れ込むようにしてから、近位クランプを取り外します。滅菌コットンボールを使用して、縫合箇所で観察された出血を止めるために圧力をかけます。

止血が起こるまで、約3分間押します。次に、腸を腹腔内に戻し、ゲンタマイシンを含む温かい生理食塩水を使用して腹腔を洗い流します。次に、筋肉層と皮膚層に3-0ナイロン縫合糸を使用して腹壁を縫い合わせます。

手術後の切開部にヨウ素は一度だけ使用してください。ネズミが完全に回復したら、他の人の会社に戻します。エレクトロスピニング溶液中のポリカプロラクトンの濃度は、繊維の直径とグラフトの機械的特性の両方に影響を与える可能性があります。

高濃度の25%溶液は、10%溶液よりも太い繊維と大きな細孔を持つ血管移植片を生成します。in vivoで3か月後、組織学的染色により、移植片の内腔に新しい組織の層が形成され、移植片自体にかなりの量のコラーゲンが沈着していることが明らかになりました。この新しい組織層には内皮細胞が敷かれており、その下に平滑筋細胞と円周方向に整列したエラスチンの両方の層があります。

in vivoで12か月後、新しい組織はよく統合されているように見え、内皮層と平滑筋層は無傷のままでした。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1〜2時間で完了することができます。この手順に続いて、カラードップラー超音波などの他の測定を実行して、このビデオを見た後、エレクトロスピニング血管グラフトの製造方法を十分に理解し、ラット腹部動脈置換モデルでそのin vivo性能を評価する方法などの追加の質問に答えることができます。