カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

この手順の全体的な目標は、制御された環境条件下で成虫の線虫の動的プロセスを縦断的に画像化し、線虫の行動応答と線虫の遺伝子発現の動態を追跡することです。この方法は、動物が中核行動、遺伝子発現、記憶、学習の違いなど、環境の変化にどのように適応するかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、動的に制御された環境下での個々の動物の多重縦断的観察と、適応の複数の側面の高解像度での同時サンプリングが可能になります。

この手法の意味するところは、高精度の動力学データを取得することで、数学的モデリングや複雑な仮説の定式化とテストを容易にすることができるため、動物の適応の定量的理解にまで及びます。手順のためにデバイスをセットアップするには、最初に出口シリンジの先端を50センチメートルのシリンジチューブに接続します。アダプターニードルを作成するには、ペンチを使用して20ゲージのニードルハブからニードルシャフトを1/2インチの針で引っ張り、ブンゼンバーナーを使用して残りのプラスチック残留物を取り除きます。

針の両端をペンチで保持し、実験装置の形状に従ってアダプター針を曲げ、針を出口シリンジチューブのもう一方の端に半分差し込みます。次に、1つのバッファーインレットシリンジチップを三方弁に直接接続し、バッファーインレットシリンジを1メートルのシリンジチューブに接続します。アダプター針をチューブの開放端に半分挿入し、バッファー交換シリンジをシリンジの先端を介して50cmのシリンジチューブに接続します。

シリンジチューブを三方弁の残りのポートに接続し、バルブを閉じます。アダプターニードルを使用して、先ほど示したように、ウォームインレットシリンジを1メートルのシリンジチューブに接続します。その後、S-mediumですべての材料を2回すすぎ、すすぎたシリンジとチューブに新しいS-mediumを充填し、気泡を取り除くように注意します。

次に、コンセントシリンジチューブをデバイスのコンセントに接続し、コンセントシリンジチューブの端にあるアダプター針をコンセントポートに差し込みます。出口から少量のS-mediumを注入して、S-mediumがバッファー入口とワーム入口の両方から出てくるまでデバイスを充填します。バッファーインレットシリンジチューブをデバイスのバッファーインレットポートに接続し、ウォームインレットを直径1インチ30秒のステンレス鋼ダウエルピンで塞ぎます。

電動ステージを備えた倒立型蛍光顕微鏡にマイクロ流体デバイスを取り付け、シリンジポンプを顕微鏡の近くのシェーカーにテープで固定して、ポンプが揺れないようにします。次に、バッファーインレットシリンジをシリンジポンプにロードし、S媒体の連続的な流れを毎分3マイクロリットルの流量でデバイスに供給するようにポンプを設定します。細菌をマイクロ流体デバイスにロードするには、まず、大腸菌OP50の高密度懸濁液を新しいシリンジにロードします。

シリンジを垂直に回し、バレルを数回タップして、シリンジの上部にあるすべての気泡を収集します。オービタルシェーカーの電源を切り、バッファーインレットシリンジの三方弁を閉じます。バッファーインレットシリンジをバクテリア充填シリンジと交換し、細菌懸濁液が少しバッファー交換システムに入り、OP50充填シリンジまたはバルブに気泡が残らなくなるまで、シリンジの上部に集めた空気をすべて押し出します。

バルブを閉じた状態で、バクテリアを装填したシリンジをシリンジポンプに接続し、オービタルシェーカーをオンにします。振とう速度を約200RPM、流量を毎分100マイクロリットルに設定します。OP50バッファがデバイス全体に広がったら、流量を毎分3マイクロリットルに戻します。

装置に線虫を装填するには、まず、650マイクロリットルの低結合マイクロ遠心チューブに100マイクロリットルの新鮮なOP50懸濁液を充填し、ワームピックを使用して、20〜30匹の年齢同期した若成体寄生虫を線虫増殖培地寒天プレートからチューブに個別に移す。ウォームインレットシリンジとシリンジチューブに新しいOP50懸濁液を充填し、約500マイクロリットルの懸濁液をマイクロ遠心チューブに注入します。次に、ウォーム懸濁液をウォームインレットシリンジチューブに引き込み、ウォームインレットシリンジをウォームインレットに接続します。

すべてのワームをワームインレットシリンジチューブからマイクロ流体デバイスに注入し、ウォームインレットシリンジとシリンジチューブを外します。ウォームインレットをピンで塞ぎ、バッファーインレットシリンジをメカニカルポンプから外します。バッファーインレットシリンジを使用してワームを手動でチャネルに移動し、アウトレットシリンジを使用して必要に応じてワームの動きを逆にします。

動物を積み込むには、いくつかの調整が必要です。シリンジプランジャーを優しく押してチャネルに合わせ、やや強く押してワームを奥まで押し込みます。次に、実験を開始する前に、ワームが新しい環境に2〜3時間順応するのを待ちます。

ワームはチャネルに限定されていますが、固定されていません。ほとんどの線虫は実験中、その水路に留まりますが、一部の線虫は逃げたり、微小亀裂に巻き込まれたりすることがあります。ここでは、デバイス内で10時間にわたる単一の代表的な線虫の明視野画像を観察できます。

免疫応答遺伝子1プロモーターの下でGFPを発現するトランスジェニック線虫を用いて、P.Aeruginosa、PA14感染時には、病原体への曝露の最初の5時間で線虫の体中部および尾部でGFP発現が観察され、その後5時間で強固な全身発現に増加する。各線虫の全蛍光を感染後の時間の関数としてプロットすると、免疫応答遺伝子の1回の誘導のダイナミクスと、誘導のタイミングと程度における線虫間の変動性がわかります。各チャネルで線虫が産んだ卵のタイムラプスイメージングにより、各線虫が産んだ卵の累積数を感染後の時間の関数としてプロットでき、動物から動物への変動性、および感染が進行するにつれて病原体による産卵の減少を捉えることができます。

習得すれば、マイクロ流体デバイスは1時間で準備し、ロードすることができます。装置が装填され、線虫が順応すると、特定の薬剤や目的の化学的手がかりなどの他の試薬を線虫に送達して、線虫の神経細胞および遺伝システムの制御に関する追加の質問に答えることができます。開発後、私たちと共同研究者は、この技術を用いて、線虫の摂食行動や、さまざまな環境下での熱ショック感染や飢餓に対する線虫の遺伝的応答を解剖しました。

このビデオを見た後、マイクロ流体デバイスを使用して縦断的なエッセイを実行する方法について十分に理解しているはずです。