Name: 強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9リボ核蛋白質複合体を用いたゲノム編集法。ヒト造血幹細胞やC.elegans、Parhyale hawaiensisなど多様な細胞と生物で標的ゲノム改変を実現し、オフターゲット効果を低減して遺伝性疾患治療への応用可能性を示します。

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私たちのラボとこれらの方法の開発への貢献のためのベイエリア ゲノム編集コミュニティの多くの前のメンバーに感謝いたします。批判的にこの原稿を読んで、ロス ・ ウィルソンに感謝します
アレクサンドル ・ マルソンの研究はジェイク Aronov からの贈り物によってサポートされ、国民の多数硬化の社会 (CA 1074-A-21) を付与します。アレクサンダー マルソン バローズ Wellcome の基金から医療科学者のキャリア賞を保持して、チャン Zuckerberg Biohub 捜査官です。ジェイコブ E. トウモロコシの研究は、再生医学の李の Ka Shing 財団、医学研究の遺産医療研究所、カリフォルニア工科大学によってサポートされます。Behnom Farboud ・ バーバラ ・ j ・ マイヤーの研究はハワード ヒューズの医学の協会の調査官であるバーバラ ・ j ・ マイヤーに日の出付与 R01 GM030702 によって一部で賄われて。エリン ・ ジャービスと Nipam h. パテルの研究は NSF grant IOS 1257379 によって一部で賄われてやエリン ・ ジャービスは、NSF GRFP と Philomathia 大学院フェローシップからサポートを認めています。

著者アレクサンダー マルソンとジェイコブ E. トウモロコシは、スポット ライト治療の共同創設者です。ジェイコブ E. トウモロコシはミッション治療アドバイザーと彼の研究室は、アストラゼネカ、ファイザー社から受託研究の支援を受けた。アレクサンダー マルソンはジュノ治療学協定、顧問と彼の研究室は、ジュノ治療、Epinomics、およびサノフィから受託研究の支援を受けた。彼の研究室は、Cas9 RNP 技術に関連する特許に申請しました。

堅牢なゲノム編集プロトコルを確立するセルの行または興味の生物で、最適化が必要し、経験的ないくつかの重要なパラメーターのテスト、このセクションで説明します。ここで紹介する一般的な方法のいくつかのバリエーションをしようとして推奨されています。このプロトコルの重要な制限は、これらのメソッドを他のセルに適用することや生物の研究、種によって異なる結果につながる可能性があります高効率遺伝子ノックアウトにつながる実験デザインは DNA の挿入を働きかけることはできません。したがって、ここで紹介され以下のようにトラブルシューティング メソッドで始まるをお勧めします。
ゲノム編集試薬品質のトラブルシューティング。 生成や高品質の試薬を購入は、プロトコルを編集すべてのゲノムの重要なステップです。Cas9 タンパク質をラボで精製または商業的に購入できます。多くのプロトコルが RNP のレシピで、Cas9 の最終濃度を注意してください、最適な遺伝子の活動を編集はソースによって異なりますが、個々 Cas9 タンパク質製剤の特定のアクティビティに依存します。ここで提示されたプロトコルを使用すると、一度検討 RNP Cas9 レベルの滴定によって最適な濃度を確立するために使用量を最適化する: 1 つによって引き起こされる不必要なターゲットを胸の谷間に非常に特定のターゲット DNA 切断を提供します。過剰な Cas940。
ガイド RNA の純度と均質性もゲノム編集成功22の決定要因をすることができます。購入した sgRNAs または crRNA と tracrRNA の個別のコンポーネントは、一般的に高品位の試薬、さまざまな化学修飾は RNA の劣化の問題を戦うためや RNP91に追加機能を吹き込むため可能です。化学修飾した gRNAs は、標準的なゲノム実験を編集に必要なことができない、いくつかのグループがはるかに高い場合や、彼らはプロセスをマスターした後に試して価値がある可能性がありますので、このような試薬により、効率性を編集観察 gRNA 劣化問題22,91に表示されます。In vitro転写と後続のゲルの浄化は、安価な代わりに、ルーチンのゲノム実験17,21,49,50を編集のために十分となります。さらに、同種の gRNA 集団体内など個々 のガイドのリボザイムと tRNA ベース切除を生成する一般的に適用される、体外にクリーナーを生成する RNA の準備を拡張する可能性がありますいくつかのアプローチ製品92。
ガイド RNA と DNA のドナーのデザインのヒント。 ガイド RNA 選択は、非常に効率的なターゲットでは、ターゲットを胸の谷間の可能性を最小限に抑えながらの編集の達成の重要な要因です。ガイドの選択を支援するためいくつかの研究は成功ガイド47,79,93,94、シーケンス機能をコンパイルするのに次世代シーケンサーと相まって高速画面を使用しています。 95,96。これらの機能は、予測アルゴリズムとガイド選択44,45,46,47,48を支援するオンライン ツールを開発する使用されています。このようなアルゴリズムは、ガイド RNA 発現の DNA ベースのシステムを使用して画面に接地されます。Pol III プロモーターを使用してガイドを表現し、彼らの表現が Pol III 転写、早期終了のウラシル97,98、トラックが発生した場合などに関連付けられている制限になりやすいため 99。ただし、結合の使用は体外で作られて-合成ガイド Rna これらの懸念をバイパスし、簡単にガイド設計上の制約。これらのアルゴリズムから登場し、非常に効果的なゲノムの編集、多数の調査で確認されている一般的な機能は、プリン、特にのグアニンは、ガイドのターゲット特定シーケンスの 3 ' 端の存在です。このガイドの機能は、哺乳類から線虫ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ65,100,101まで及ぶ有機体の間で非常に成功しています。また、線虫ガイドのターゲット領域の 3 ' 端に GG 型とガイドの設計は、非常に効果的なガイド Rna65を予測するための効果的な戦略。理想的は特定のアプリケーションに最も成功したを判断する並列で複数のガイドをテストします。
DNA 配列をゲノムに導入しようとすると、ドナーまたはテンプレート DNA の設計は重要なまたです。他の典型的な修理のテンプレート、線形二重鎖とプラスミド DNA54,55,102よりも確実に一本鎖オリゴヌクレオチド ドナー (ssODNs) が挿入されます。いくつかの遺伝子座で、非標的を補足 DNA の繊維を転置または長さ27,55で非対称である相同性腕を所有するいると ssODNs と HDR の効率を改善できます。修理テンプレートですがカットのサイトに挿入される目標とされたシーケンスが含まれていますので、手順は、Cas9 のゲノムの挿入前後にドナー DNA を切断を防ぐために取られなければなりません。これは挿入された遺伝子21,103の機能を維持しながら Cas9 による認識を回避する PAM シーケンスまたは種子地域にサイレント突然変異を作るします。PAM にも単一のヌクレオチドの変更がバインディング104を廃止する可能性がありますが、念のために少なくとも 4 つのヌクレオチドを変更しようとするとします。
意義と将来のアプリケーション: ゲノム編集 CRISPR Cas9 は、すべての生物の安易な遺伝子操作を有効にする強力な方法として浮上しています。Cas9 RNP で編集最初に少し手間がかかりますが、試薬、プロトコルはラボで確立されるを使用する簡単です。高い全体的な編集の効率、少ないオフターゲット効果24,25,26 HDR、を介して達成困難な遺伝子挿入を含むにつながるプラスミド DNA ではなく組み立て済み RNP でセルの編集,27,29します。 さらに、実験者は遺伝子発現、RNA 分解、タンパク質の折り畳み、および gRNA と別々 に合成されるセル22,23Cas9 分子間の関連付けの問題を回避します。また挿入突然変異誘発について安全上の懸念を回避 RNP 編集して臨床的に14] ウイルスの配信方法は、するときに発生する持続的な表現を使用します。これらの利点のため多くの科学者が前臨床試験の実施概念実証実験を支持する RNP のひと治療用編集します。体内と体外の両方の要件に基づくゲノム編集アプローチは、治療もさまざまな条件、デュシェンヌ型筋ジストロフィー105と鎌状赤血球症、27のような遺伝的疾患を開発HIV の29と癌の11。興味深いことに、Cas9 RNP はますます植物33,34,36の編集 'DNA 自由' を有効にするために、農業工学のための配信方法として採用されています。

fThe CRISPR Cas9 システムに1ゲノムのターゲット領域を変更できます。この迅速かつ安価な技術の基礎研究をもたらしましたし、パーソナライズされた疾患の治療、精密農業、内外2の開発の深遠な影響を作ることを約束します。CRISPR 編集は民主化ツールと、新しい研究室でシステムを実装するゲノム工学、基本的な分子生物学のスキルで特定の専門知識は必要ありません。遺伝子操作3,4のいくつかの代替手段で、以前難治性の生物を研究することができます。5 年だけでは、CRISPR ゲノム編集以上 200 の異なる脊椎動物、無脊椎動物、植物、微生物種をエンジニアに使用されています。
CRISPR 原核生物防御経路から適応部位特異的ゲノムの編集に必要なコア要素s. 化膿から通常の Cas9 タンパク質し、追加の核局在化信号 (NLS) とその特殊なコドン最適化RNA ガイド5,6。ここで説明されていない、他の Cas9 第オーソロガスや CRISPR 酵素も使えます。自然に発生する gRNA は 2 つの個別に転写部分、CRISPR RNA (crRNA) とトランス活性化から成る crRNA (tracrRNA)7。これらの Rna は、シングル ガイド RNA (sgRNA)8として知られている単一のコピーに融合することができます。デュアル ガイドもあるが、ほとんどゲノム編集者選択合理化された sgRNA9,10,11を定期的に使用します。実験者 protospacer 隣接するモチーフ (PAM) と呼ばれる、Cas9 の認識に必要な短いライセンス署名の隣に位置し、確保する 20 ヌクレオチド (nt) ゲノムの DNA のターゲットを選択し、相補的なシーケンス12 を含む gRNA をデザイン.
細胞内 RNP 複合検索そのゲノムのターゲット、gRNA 塩基対の相補的な DNA のストランドし、酵素を切断、両方 dna 二重鎖を生成するは2を破る。細胞修理機械は、少なくとも 2 つのルートのいずれかによって、DSB を修正: エラーが発生しやすい非相同末端結合 (NHEJ) 経路または相同監督修理 (HDR)、経由をシームレスにブレークのいずれかの側に相同性の ' 腕' を含んでいる DNA が組み込まれています。元修理経路塩基形成とそれに伴う遺伝子破壊に後者により実験者を挿入または DNA シーケンス1の変更に通常 します。
編集の効率と精度は、Cas9 と gRNA をセルに入力する手段によって異なります。これらのコンポーネントは、培養細胞、胚、または組立 RNP 複合13,14,15核酸の形で生物に配信場合があります。一般的な核酸ベースの配信方法は、ウイルス伝達、トランスフェクション、または mRNA またはプラスミッド DNA のエレクトロポレーションに含まれます。Cas9 タンパク質と RNA のガイドはセル内で生産し、複合体を形成するのに関連付けられています。
RNP の直接配信 Cas9 蛋白質および RNA のガイドの別の浄化が必要です。これは社内で行うことができます。 または蛋白質と sgRNA は、いくつかの商用ベンダーのいずれかから購入できます。取得されると、Cas9 と gRNA は酵素によって主務 RNP 複合体を形成するために混合し、受精卵/卵、脂質ベースのトランスフェクション16、またはエレクトロポレーションに直接注入によって細胞に導入します。RNP 編集の最初のレポートには、 c. の elegans生殖腺17への注入が関与しています。インジェクションは胚および全有機体の RNP 導入の手段効果的なエレクトロポレーションは、マウス18,19 , ラット20胚で実証されています。我々 は直接注入 RNP線虫 c. エレガンスの生殖腺およびp. hawaiensis胚のプロトコルについて説明してひと初代細胞を編集する際、RNP を配信するエレクトロポレーションの特殊な型をお勧めします。このメソッドは、nucleofection、最適化されたエレクトロポレーション プログラムおよびセル型固有のソリューションが含まれます、RNP 細胞質と核21を入力することができます。
ゲノム編集 RNP でいくつかの明確な利点を提供しています。タンパク質と RNA コンポーネントが完成、納品前に品質を確保することができますので、RNP 編集核酸ベースの配信に関連付けられている多くの落とし穴を回避できます。すなわち、宿主ゲノム DNA の Cas9 エンコード統合のリスクがない、mRNA は劣化にさらされることは、生体内でタンパク質や gRNA 式、折り畳み式、および協会22,23の問題を回避できます。さらに、毒性やプラスミド ベース式、セル24,25,26,27内 RNP の短い半減期の結果よりはるかに少ないオフのターゲット イベントの削減につながる RNP を使用します。
最後に、RNP 編集明白につながるひと細胞、初代培養細胞の様々 な編集率など、線維芽細胞、胚性幹細胞 (Esc)、誘導多能性幹細胞 (iSPCs)、HSPCs、および T 細胞16,24、 25,26,27,28,29;P. hawaiensis、線虫ショウジョウバエ3,17,30を含む無脊椎動物のゼブラフィッシュ、マウス、ラット31,32; のような脊椎動物種で植物のシロイヌナズナ・ タバコ、レタス、米、ブドウ、リンゴ、トウモロコシ ・小麦33,34,35,36; を含む種クラミドモナス、ペニシリウム、カンジダ種37,38,39。RNP プラスミド配信と比較を使用する場合、塩基形成の頻度が高くなることが、HDR を介した DNA の挿入は25,27,29を達成するために簡単にすることができます。
ここで説明したプロトコル Cas9 RNP を使用し、さまざまな生物学的システム40,41, 動作するように困難ではない細胞の特に中に適用は容易容易に適応できる、効果的なテクニックです。正確な遺伝的操作の確立されたシステムを使用しないで有機体と。まず、設計、取得、および別のモデル セル型の有機体の間でその使用をカバーする前に Cas9 RNP をアセンブルする方法について説明します。造血幹細胞/前駆細胞 (HSPCs)、nucleofection、同じメソッドを使用してこのプロトコルの 2 および 3 の手順で一緒に覆われているので T 細胞を編集します。Cの手順を編集します。線虫手順 4 および 5 で説明とP。hawaiensisの編集は、手順 6 と 7 で覆われています。最後に、以来、すべての生物で遺伝子編集の実験の成功は、遺伝子配列による評価が、すべての細胞や生物プロトコルで説明可能な解析方法を説明した手順のステップ 8 の通りです。

<table><tbody><tr><td>試薬/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAオリゴヌクレオチド</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-IDT</td><td>は、表1のガイドRNAを含むカスタムDNA配列を提供します</td></tr><tr><td></td><td>Synthego-Synthego</td><td></td><td>は、表1に含まれるターゲティング配列を含むカスタムsgRNAを含む、化膿性ブドウ球菌Cas9用の高品質のsgRNAを提供します</td></tr><tr><td>精製Cas9タンパク質(EnGen&nbsp;Cas9 NLS,&nbsp;S. pyogenes)</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>可能であれば、Cas9を社内で精製するか、地元のコア施設から購入することは、より安価なオプションです</td></tr><tr><td>正常な末梢血CD34+幹/前駆細胞</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium, With S-Carbonate, without L-glutamine, liquid</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade;ヒトT細胞分離キット</td><td>Stemcell</td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート、96ウェル、丸型</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS(Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reombinant Human IL-2</td><td>UCSF Pharmacy</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500パックIVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</em</td><td>>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>ペトリ皿中の線虫増殖培地寒天</td><td></td>-<td>-</td><td>Stiernagle, T (ref. 59) を参照</td></tr><tr><td>フィラメント付き標準ホウケイ酸ガラスキャピラリー:&nbsp;4 インチ (100 mm)、1/0.58 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>シングルバレル標準ホウケイ酸ガラス キャピラリー: 6 インチ (152 mm)、2/1.12 OD/ID&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B200-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス; 24 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE agarose</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pCFJ90 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr><tr><td>圧縮窒素</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mM 培養皿</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィラメント付きキャピラリーチューブ: 4 インチ (1.0 mm)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (100 回; 15 mm)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タングステン ワイヤー (直径 0.005 インチ)</td> <td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfluoroalkoxy alkane (PFA)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marine</td> <td>salt-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>" パスツールピペット</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>ヌ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クレアーゼフリー水</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>装置</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4Dヌクレオフェクター</td><td>ロンザ</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&nbsp;実体顕微鏡</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>生産終了。現行モデルはM80実体顕微鏡</td><td></td></tr>、<tr><td>Axio Vert35、逆位相差蛍光顕微鏡</td><td>、ツァイス</td>、<td>生産終了。現行モデルはAxio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>レーザーベースのマイクロピペットプーラー(C.エレガンスプロトコール用)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>ピコリットルマイクロインジェクター(C.エレガンスプロトコール用)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>3軸ジョイスティック油圧マイクロマニピュレーター</td><td>成茂インターナショナル</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>粗マニピュレーター</td><td>成重インターナショナル</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー(P.ハワイエンシスプロトコール用)</td><td>サッターインスツルメンツ&nbsp;</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター (P. hawaiensis プロトコール用)</td><td>成茂</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー ピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG寒天</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

強化されたゲノム細胞や生物の多様な cas9 リボ核蛋白質と編集

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

サイト固有の真核生物ゲノム編集 CRISPR (クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返されます)-Cas (CRISPR 関連) システムすぐにさまざまな生物学的質問を追求する研究者の間で当たり前となっています。ユーザーはほとんどの場合簡単にプログラムし直されたガイド RNA (gRNA) との複合体で化膿連鎖球菌由来 Cas9 タンパク質を採用しています。これらのコンポーネントは、細胞に導入され、二本鎖 DNA (dsDNA) ゲノムの相補的な領域とのペアリング ベースで酵素は二重鎖切断 (DSB) を生成する両方のストランドを裂きます。後続の修理は、ランダムな挿入または削除イベント (オクターリピート) または休憩のサイトで実験者によって提供される DNA の取り込みに します。
浄化された単一ガイド RNA と Cas9 蛋白質、形成、RNP に実装済み、細胞に直接配信の使用は、高効率遺伝子編集を実現する強力なアプローチです。遺伝子挿入、多くの場合達成するために挑戦する結果の率を高める特に RNP 編集します。プラスミドを介して配信と比較して、細胞内 Cas9 RNP の短残光は少ないオフのターゲット イベントに します。
その利点にもかかわらず CRISPR 遺伝子編集の多くのカジュアルなユーザーは、このテクニックに不慣れな。エントリへの障壁を下げるための明確な利点と多様なアプリケーションを強調表示のコンテキストの範囲で RNP 戦略を実装するための詳しいプロトコルを概説します。ひと初代細胞、T 細胞と造血幹細胞/前駆細胞 (HSPCs) の 2 種類の編集を取り上げます。またどのように編集可能 Cas9 RNP 最近クラシック モデル回虫線虫などを含む全体の生物の安易な遺伝子操作導入モデル甲殻類、 Parhyale hawaiensisを示します。

これらの実験をどのように組み立て済み Cas9 RNP は初代培養細胞および全有機体のゲノムを操作する使用ことができます。研究者浄化または Cas9 タンパク質と sgRNA を購入、事前、複合体を形成する 2 つのコンポーネントを組み合わせて、セルまたは関心の有機体に、RNP を紹介です。後に発生する (該当する場合) に生まれてくる次の世代の子孫の表現型のチェックや遺伝子型の細胞を収集する編集のための十分な時間を許可します。表現型は、機能アッセイ、式の試金、可視化 (目でまたは顕微鏡)、または実験によって、他の方法を介して観察可能性があります。
鎌状赤血球症を引き起こす β-グロビン変異を修正するために編集されている HSPCs することができます赤血球分化や健康の生産または鎌状ヘモグロビン27,87 (図 1 のなど A)。T 細胞の高親和性 IL-2 受容体遺伝子、CD25 をノックアウトする編集 (IL2RA) の表面染色と流れの cytometry88、分析および機能的 IL-2 刺激 (図 1Bシグナリング応答を検出するために分析できます。).T 細胞は、HIV 感染症89の有効性を含む、異なる表現型の評価が必要多くの臨床的に重要な方法で書き換えることができ、車 T の生体内で抗腫瘍効果細胞11。
線虫みみずは co CRISPR/共同 conversion のスクリーニング方法を使用して、2 つの座位62で同時に編集されています。使う 10参照の遺伝子が、ssODN を使用しての HDR は、テンプレートにより、簡単に得点支配使う 10ゲインの機能突然変異を修復します。ヘテロ F1dpy-10(gof)動物ローラー (Rol)、ホモdpy-10(gof)動物がみすぼらしい (使う)。表現型の存在は、これらの動物の発生編集する Cas9 を示し、Rol または使う F1動物の 2 つ目の軌跡の編集イベントの識別の確率を改善します。編集の実験が成功は Rol または使う9020 以上の F1子孫を降伏注入 P0ワームの 33-50% になります。非 Rol 動物に使う 10を野生型に戻り、関心のホモ編集の選択を選択することが可能ですし。親指のルールとして、co CRISPR 参照の遺伝子をターゲットと crRNA の濃度は、興味の遺伝子をターゲット、crRNA の半分をする必要があります。興味の遺伝子の編集は回復されていない、2 つの CRISPR Rna の比率が望ましい突然変異を回復する可能性を高めるに調整できます。たとえば、参照の遺伝子の位置で編集をまた所有しているワームの人口内の興味の遺伝子の編集を持つワームの割合増える参照遺伝子 crRNA と関連する関心の遺伝子の crRNA の量を増やします。共同変換周波数は異なりますが、料金は、通常、20 〜 60%、しばしば F1世代 (図 1C) ホモ編集を降伏します。
P. hawaiensisの孵化 (Abd B)腹部 B遺伝子をノックアウトする編集されているが明確な形態学的異常3 (図 1D) を表示します。この遺伝子は正しい腹部パターニングのため必要で、腹部に存在する呼吸器型ジャンプと歩行脚は、通常、スイミングとアンカーの脚を交換にその中断の結果。
ゲノム遺伝子型のレベルで結果を編集を決定するには、シーケンスまたはシーケンスの変更を検出するの in vitroアッセイが必要です。ここでは、私たちは私たちのモデル細胞の種類や生物から数量を編集する別のアプローチを強調表示代表的なシーケンス データを表示します。ここに示すすべてのメソッドは、任意の生物学的システムに適用できるため図ラベルが一般化されることに注意してください。
シーケンス ベースのアプローチは、技術的な複雑さおよび結果の深さで変わる。クローンの編集集団、容易に分離できる個々 の生物のゲノム DNA 抽出編集した個人を配置できます。Cas9 カット地点とその機能 (図 2A) を混乱させるだろう仮説 frameshifts 与えられた個々 のシーケンス変更標準サンガーのシーケンスの結果を明らかにします。シーケンス処理に使用するオンライン ツール別サンガー法を用いたアプローチです個々 の変異体78よりもむしろ混合集団に適用することができます。シーケンスは、全体的な編集の効率として優勢なシーケンス結果に近づけることができるオンラインのツールと分析されます。代表的なデータは、図 2Bのとおりです。
ここで説明する最も完全なシーケンス方法はディープ シーケンス (高スループットまたは次世代シーケンス処理とも呼ばれます)。このメソッドは、混合された人口の個々 のゲノムから DNA シーケンスを提供します。このようなデータは、さまざまな方法で示すことができます。ここでは、我々 は編集の結果 (図 2C) に基づいて編集されたセルから個別シーケンスの読み込みを分類しています。ほとんどの細胞は、通常遺伝子破壊の結果 NHEJ 経路を介して編集されています。他では、ターゲット遺伝子スワップ アウトされている HDR27を介して別のバージョンの。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg"> 表 1: 陽性コントロール予備ゲノム実験を編集します。このテーブルは、それぞれの細胞や生物はこのプロトコルで記述されている実験の編集初めてゲノムを実行に必要な重要な情報を示しています。プロトコルをテストするために使用できる正常な結果を得られない可能性がこれらのパラメーター、次または一度に比較用のベースラインとして実験者が、自分の興味の遺伝子を狙っています。F: を転送、r: 逆に、HDR: 相同性監督の修理。<a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg"> 図 1: Cas9 RNP 編集のひと初代細胞や生物に起因する表現型の代表。(A)これは成功したゲノム編集、後期赤芽球に区別される HSPCs 鎌状ヘモグロビンよりもより機能的なヘモグロビンが生成されます後ことを示す高速液体クロマトグラフィー トレース。正常に編集の細胞は胎児のヘモグロビン (HbF) だけでなく、健全なヘモグロビン (HbA、HbA2) を生産している、突然変異体の赤血球は鎌状ヘモグロビン (HbS) を生成します。任意の単位 (au) で吸光度のグラフを示します。デウィット et らに発表されたこのパネル27. それは科学の進歩のためのアメリカの協会から許可を得て転載。(B)条件ごとに、左側のこのパネルはCD25遺伝子が RNP でノックアウトされた後、T 細胞の表面染色で CD25 を表現しないことを示す流れ cytometry データを示しています。CD25 豊富は、y 軸上のセル サイズを x 軸にプロットされます。条件ごとに、右側は、このパネルは、IL-2 に誘導後リン Stat5 (pStat5) 数量を示しています。シグナリングは、IL-2 受容体 (CD25 KO) 欠席が削減されます。PStat5 豊かさは x 軸にプロットされ、IL-2 入力の 3 つのレベルから生じるデータが垂直方向に比較されます。(C)このパネル画面を示す線虫co CRISPR/共同 conversion 共同コンバージョン マーカーとして使う 10のターゲットします。2 ガイド Rna ターゲット 2 座、使う 10あなたのお気に入りの遺伝子 (yfg) は同じ P0-挿入された動物。使う 10の HDR 結果 Rol または使う表現です。Rol-使う F1動物の選択で 2 つ目の軌跡の編集を識別する機会が増えます。(D)このパネルは、野生型Parhyale hawaiensis孵化がある通常腹部水泳やアンカーの脚を示しています。アブド Bノックアウト孵化 (F0個人) 開発腹部胸部へ変換します。したがって、スイミングとアンカーの脚では、なくなっているし、通常胸部に関連付けられているジャンプおよび歩行の足に置き換えられます。<a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg"> 図 2: 結果分析メソッドの編集からの典型的な結果。(A)このパネルは、野生型のシーケンスと開いたリーディング ・ フレームをシフトすることによって遺伝子の機能を混乱させる 3 つの異なるオクターリピートなどを含む個々 の F1 P. hawaiensis生物から結果を配列、サンガーの例を示します。(B)これら潮結果の挿入およびシーケンスされた T 細胞のプールに Cas9 ターゲット ・ サイトで発生した削除イベントの範囲を示します。X 軸は、ヌクレオチドの特定の挿入削除の長さを示します。(C)これらのディープ シーケンスの結果を示さないゲノム編集 nucleofection または gRNA、なし、成功したそのまま Cas9 RNP で編集、HSPCs の DNA 修復結果でグループ化<a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP) は正確で効率的なゲノムの編集のための強力な方法です。ひと初代細胞や両方の古典的なモデル有機体の出現など、ここでは、私たちは細胞や生物の広い範囲にわたってその有用性を強調します。

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

このプロトコルの全体的な目標は、CRISPR/Cas9リボ核タンパク質複合体を使用して、さまざまな細胞や生物に標的ゲノム変更を加えることです。この方法は、モデル生物と非モデル生物の非修飾ゲノムにカスタムデザインの挿入、欠失、置換を生成する力を研究者に与えることで、基本的な生物学的問題に対処するのに役立ちます。プラスミドDNAの代わりにリボ核タンパク質またはRNP複合体を使用する主な利点は、効率が高く、オフターゲットイベントが減少することです。この技術の意味するところは、がん、HIV、遺伝病などと闘うための生体外療法にまで及びます。これは、ゲノム編集を使用して有害な突然変異を修正したり、細胞が有害な病気を撃退する能力を高めたりするために使用できるためです。したがって、この方法は、初代ヒト細胞、C.elegans、およびParhyale hawaiensisに関する洞察を提供することができます。これは、以前は難治性だった生物を含む他の何百ものシステムに遺伝的変化を起こすために適用できます。この手順は、テキストプロトコルに記載されているガイドRNAの設計と調製から開始します。総容量10マイクロリットルで、1〜2モル量のガイドRNAと200ピコモルのCas9タンパク質を混合することにより、RNP複合体を組み立てます。非常にゆっくりと、濃縮されたCas9をガイドRNAに約30秒間加え、ピペットですばやく円を描くようにします。最終的なCas9濃度を20マイクロモルにします。次に、各キュベットウェルに10マイクロリットルのRNPを追加します。テキストプロトコルに記載されているようにHSPCを調製した後、血球計算盤で細胞を数え、キュベットあたり150,000〜200,000個の細胞をエレクトロポレーションして遠心分離管に移します。チューブを重力の100倍で10分間回転させ、細胞をペレット化します。上清をピペットまたは掃除機で吸引し、気泡を取り除きます。キュベットウェルあたり20マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を穏やかに再懸濁します。次に、150、000〜200、000 HSPCを含む細胞の20マイクロリットルを、すでにRNPの10マイクロリットルを所有している各キュベットウェルに追加し、泡を作らずにピペッティングで上下によく混合します。最後に、キュベットをヌクレオフェクターに入れた後、エレクトロポレーションします。HSPCの場合は、パルスコードER-100を使用します。テキストプロトコルに記載されているように、アガロースパッドでのC.elegansの調製から始めます。アガロース注入パッドを置き、カバースリップを解剖スコープに取り付けます。ウォームピックを使用して、パッドの一方の端に沿ってハロカーボンオイルの小さなトラックを置きます。次に、オイルでコーティングされたウォームピックを使用して、いくつかのワームをNG寒天プレートから持ち上げ、オイルのトラックに入れます。まつげや猫のひげなどの細い毛をピペットに取り付けた状態で、ワームを平行に配置し、ワームをアガロースパッドにそっと押し込みます。マイクロインジェクション手順に慣れるまで、一度に1つのワームのみを注入します。所定の位置に配置されてパッドに取り付けられたら、ワームピックの先端からさらに数滴のハロカーボンオイルをワームに重ねます。取り付けられたウォーム付きのカバースリップを注射顕微鏡に置きます。低倍率で、テキストプロトコルに記載されているように、RNP溶液で満たされた注射針に対して垂直に線虫を配置します。高倍率に切り替えて、中期から後期のパキテンの核近くの領域に対応する生殖腺腕に隣接する針を再配置します。マイクロマニピュレーターを使用して、針をワームに対して動かし、キューティクルをわずかに押し下げます。次に、片手で顕微鏡ステージの側面を軽くたたいて、針をキューティクルに通します。注射パドルまたはボタンを押し、生殖腺アームを注射混合物でゆっくりと満たし、針を取り外します。もう一方の生殖腺アームでこの手順を繰り返します。線虫を注入したら、カバースリップとアガロースパッドを取り外し、解剖顕微鏡の下に置きます。引っ張られたキャピラリーピペットを使用して、M9バッファーをワームにピペッティングすることにより、ワームからオイルを置換します。この処理を行って、ワームを寒天から解放します。10分後、線虫がバッファー内で動き回っているときに、引っ張ったキャピラリーピペットを使用して、線虫をOP50細菌の入ったNG寒天プレートに移します。プレートを摂氏20度に2〜3時間置き、ワームが回復して動き回るまで待ちます。回収したら、ワームをOP50でNG寒天プレートに個別に移します。次に、プレートを摂氏25度のインキュベーターに移します。受精後0〜4時間で、最初に妊娠した女性に0.02%クローブオイルと海水で麻酔をかけることにより、単一細胞Parhyale胚を収集します。炎で引っ張られ丸みを帯びたガラスピペットと鈍い3番鉗子のペアを使用して、彼女の腹側のひなポーチから胚をそっとこすり落とします。圧縮窒素を使用して、マイクロインジェクターとマイクロマニピュレーターを使用して解剖顕微鏡でParhyale胚を注入します。マイクロローダーピペットチップを使用して、引っ張ったキャピラリーチューブの背面に1.5マイクロリットルの注入混合物をロードします。注射装置に針をセットした後、解剖スコープの下にある一対の鉗子を使用して針の先端を折ってください。ハロカーボンオイル700に注入し、気泡の直径を測定することにより、供給量を較正します。かみそりの刃を使用して硬化剤からトラフを切り取ります。フィルター滅菌した海水で半分を満たし、Parhyaleの胚をトラフに並べて注射します。マイクロインジェクションのセットアップを使用して胚を注入し、注入中に一対の鉗子で各胚を安定させます。注入後、ガラス製トランスファーピペットを使用して、フィルター滅菌した海水で半分満たされた新鮮な60ミリメートル培養皿に胚を移し、さまざまな段階で胚を解剖して固定します。長さ約0.5インチのタングステンワイヤーの曲がった部分をインスリン針の端に通すことにより、解剖針を作成します。解剖針のハンドルとして1ミリリットルの注射器を使用し、電流下で水酸化ナトリウムで針を研ぎます。3ウェルガラス皿の1ウェルを、PEMバッファー9部、10X PBS部1部、32%PFA1部の作りたての溶液で半分まで満たします。皿に3〜5個の胚を入れ、鋭利なタングステン針で突いて突き刺し、少し鈍い針で各胚に小さな穴を開けて安定させ、卵黄が流れ出て固定剤が流れ込むようにします。一対の鋭利なタングステン針を使用して、Parhyale胚を囲む外側の2つの膜をそっと引き離します。固定剤でそれらを解剖して胚をより頑丈にしますが、膜が胚に固定されないように迅速に働きます。これにより、膜の除去がより困難になります。抗体染色の場合は合計15〜20分、in situハイブリダイゼーションの場合は40〜50分間、胚を固定します。編集実験の結果は、実験的なアッセイを通じて評価するのが最適な場合があります。ここでは、野生型T細胞とCD25ノックアウト細胞の両方の代表的な結果を示します。フローサイトメトリーでは、Cas9 RNPで編集されていない細胞がCD25を発現することが示されています。しかし、CD25がノックアウトされた細胞は、このタンパク質を発現しません。大規模な摂動の場合、編集結果には明確な視覚的表現型が含まれる場合があります。たとえば、野生型のParhyale hawaiensisは、正常な腹部を持ち、水泳とアンカーの脚を持っています。Abd-B遺伝子を乱すと、腹部の遊泳脚とアンカー脚が、通常は胸部にのみ関連するジャンプ脚と歩行脚に置き換えられます。表現型のチェックに加えて、実験者は遺伝子型を分析して、全体的な編集効率を評価し、特定の遺伝的変化を検出する必要があります。単一クローンの場合、これは単純なサンガーシーケンシングによって達成できます。細胞の混合集団では、より高度なシーケンシング解析が推奨されます。例えば、TIDE は、RNP 編集プール内の個々の細胞で発生したすべての異なるインデルをマッピングできます。この手順を初めて試みるときは、表1にリストされているポジティブコントロールのいずれかを使用してみてください。実証済みのガイドRNAを使用すると、独自の実験を設計する前にRNPによる編集の感触をつかむのに役立ちます。

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Genetics

遺伝学

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シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

CRISPR-Cas9ゲノム編集システムは、モデル種や非モデル種で使用されている使いやすいゲノムエディタです。ここでは、非モデルの糸状アスコマイセテ菌の交配遺伝子に早期停止コドンを導入するために使用されたこのシステムのタンパク質ベースのバージョンを提示する。...

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このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

学ぶCRISPR/Cas9リボ核蛋白質複合体を用いたゲノム編集法。ヒト造血幹細胞やC.elegans、Parhyale hawaiensisなど多様な細胞と生物で標的ゲノム改変を実現し、オフターゲット効果を低減して遺伝性疾患治療への応用可能性を示します。

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

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