強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

このプロトコルの全体的な目標は、CRISPR/Cas9リボ核タンパク質複合体を使用して、さまざまな細胞や生物に標的ゲノム変更を加えることです。この方法は、モデル生物と非モデル生物の非修飾ゲノムにカスタムデザインの挿入、欠失、置換を生成する力を研究者に与えることで、基本的な生物学的問題に対処するのに役立ちます。プラスミドDNAの代わりにリボ核タンパク質またはRNP複合体を使用する主な利点は、効率が高く、オフターゲットイベントが減少することです。

この技術の意味するところは、がん、HIV、遺伝病などと闘うための生体外療法にまで及びます。これは、ゲノム編集を使用して有害な突然変異を修正したり、細胞が有害な病気を撃退する能力を高めたりするために使用できるためです。したがって、この方法は、初代ヒト細胞、C.elegans、およびParhyale hawaiensisに関する洞察を提供することができます。

これは、以前は難治性だった生物を含む他の何百ものシステムに遺伝的変化を起こすために適用できます。この手順は、テキストプロトコルに記載されているガイドRNAの設計と調製から開始します。総容量10マイクロリットルで、1〜2モル量のガイドRNAと200ピコモルのCas9タンパク質を混合することにより、RNP複合体を組み立てます。

非常にゆっくりと、濃縮されたCas9をガイドRNAに約30秒間加え、ピペットですばやく円を描くようにします。最終的なCas9濃度を20マイクロモルにします。次に、各キュベットウェルに10マイクロリットルのRNPを追加します。

テキストプロトコルに記載されているようにHSPCを調製した後、血球計算盤で細胞を数え、キュベットあたり150,000〜200,000個の細胞をエレクトロポレーションして遠心分離管に移します。チューブを重力の100倍で10分間回転させ、細胞をペレット化します。上清をピペットまたは掃除機で吸引し、気泡を取り除きます。

キュベットウェルあたり20マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を穏やかに再懸濁します。次に、150、000〜200、000 HSPCを含む細胞の20マイクロリットルを、すでにRNPの10マイクロリットルを所有している各キュベットウェルに追加し、泡を作らずにピペッティングで上下によく混合します。最後に、キュベットをヌクレオフェクターに入れた後、エレクトロポレーションします。

HSPCの場合は、パルスコードER-100を使用します。テキストプロトコルに記載されているように、アガロースパッドでのC.elegansの調製から始めます。アガロース注入パッドを置き、カバースリップを解剖スコープに取り付けます。

ウォームピックを使用して、パッドの一方の端に沿ってハロカーボンオイルの小さなトラックを置きます。次に、オイルでコーティングされたウォームピックを使用して、いくつかのワームをNG寒天プレートから持ち上げ、オイルのトラックに入れます。まつげや猫のひげなどの細い毛をピペットに取り付けた状態で、ワームを平行に配置し、ワームをアガロースパッドにそっと押し込みます。

マイクロインジェクション手順に慣れるまで、一度に1つのワームのみを注入します。所定の位置に配置されてパッドに取り付けられたら、ワームピックの先端からさらに数滴のハロカーボンオイルをワームに重ねます。取り付けられたウォーム付きのカバースリップを注射顕微鏡に置きます。

低倍率で、テキストプロトコルに記載されているように、RNP溶液で満たされた注射針に対して垂直に線虫を配置します。高倍率に切り替えて、中期から後期のパキテンの核近くの領域に対応する生殖腺腕に隣接する針を再配置します。マイクロマニピュレーターを使用して、針をワームに対して動かし、キューティクルをわずかに押し下げます。

次に、片手で顕微鏡ステージの側面を軽くたたいて、針をキューティクルに通します。注射パドルまたはボタンを押し、生殖腺アームを注射混合物でゆっくりと満たし、針を取り外します。もう一方の生殖腺アームでこの手順を繰り返します。

線虫を注入したら、カバースリップとアガロースパッドを取り外し、解剖顕微鏡の下に置きます。引っ張られたキャピラリーピペットを使用して、M9バッファーをワームにピペッティングすることにより、ワームからオイルを置換します。この処理を行って、ワームを寒天から解放します。

10分後、線虫がバッファー内で動き回っているときに、引っ張ったキャピラリーピペットを使用して、線虫をOP50細菌の入ったNG寒天プレートに移します。プレートを摂氏20度に2〜3時間置き、ワームが回復して動き回るまで待ちます。回収したら、ワームをOP50でNG寒天プレートに個別に移します。

次に、プレートを摂氏25度のインキュベーターに移します。受精後0〜4時間で、最初に妊娠した女性に0.02%クローブオイルと海水で麻酔をかけることにより、単一細胞Parhyale胚を収集します。炎で引っ張られ丸みを帯びたガラスピペットと鈍い3番鉗子のペアを使用して、彼女の腹側のひなポーチから胚をそっとこすり落とします。

圧縮窒素を使用して、マイクロインジェクターとマイクロマニピュレーターを使用して解剖顕微鏡でParhyale胚を注入します。マイクロローダーピペットチップを使用して、引っ張ったキャピラリーチューブの背面に1.5マイクロリットルの注入混合物をロードします。注射装置に針をセットした後、解剖スコープの下にある一対の鉗子を使用して針の先端を折ってください。

ハロカーボンオイル700に注入し、気泡の直径を測定することにより、供給量を較正します。かみそりの刃を使用して硬化剤からトラフを切り取ります。フィルター滅菌した海水で半分を満たし、Parhyaleの胚をトラフに並べて注射します。

マイクロインジェクションのセットアップを使用して胚を注入し、注入中に一対の鉗子で各胚を安定させます。注入後、ガラス製トランスファーピペットを使用して、フィルター滅菌した海水で半分満たされた新鮮な60ミリメートル培養皿に胚を移し、さまざまな段階で胚を解剖して固定します。長さ約0.5インチのタングステンワイヤーの曲がった部分をインスリン針の端に通すことにより、解剖針を作成します。

解剖針のハンドルとして1ミリリットルの注射器を使用し、電流下で水酸化ナトリウムで針を研ぎます。3ウェルガラス皿の1ウェルを、PEMバッファー9部、10X PBS部1部、32%PFA1部の作りたての溶液で半分まで満たします。皿に3〜5個の胚を入れ、鋭利なタングステン針で突いて突き刺し、少し鈍い針で各胚に小さな穴を開けて安定させ、卵黄が流れ出て固定剤が流れ込むようにします。

一対の鋭利なタングステン針を使用して、Parhyale胚を囲む外側の2つの膜をそっと引き離します。固定剤でそれらを解剖して胚をより頑丈にしますが、膜が胚に固定されないように迅速に働きます。これにより、膜の除去がより困難になります。抗体染色の場合は合計15〜20分、in situハイブリダイゼーションの場合は40〜50分間、胚を固定します。

編集実験の結果は、実験的なアッセイを通じて評価するのが最適な場合があります。ここでは、野生型T細胞とCD25ノックアウト細胞の両方の代表的な結果を示します。フローサイトメトリーでは、Cas9 RNPで編集されていない細胞がCD25を発現することが示されています。

しかし、CD25がノックアウトされた細胞は、このタンパク質を発現しません。大規模な摂動の場合、編集結果には明確な視覚的表現型が含まれる場合があります。たとえば、野生型のParhyale hawaiensisは、正常な腹部を持ち、水泳とアンカーの脚を持っています。

Abd-B遺伝子を乱すと、腹部の遊泳脚とアンカー脚が、通常は胸部にのみ関連するジャンプ脚と歩行脚に置き換えられます。表現型のチェックに加えて、実験者は遺伝子型を分析して、全体的な編集効率を評価し、特定の遺伝的変化を検出する必要があります。単一クローンの場合、これは単純なサンガーシーケンシングによって達成できます。

細胞の混合集団では、より高度なシーケンシング解析が推奨されます。例えば、TIDE は、RNP 編集プール内の個々の細胞で発生したすべての異なるインデルをマッピングできます。この手順を初めて試みるときは、表1にリストされているポジティブコントロールのいずれかを使用してみてください。

実証済みのガイドRNAを使用すると、独自の実験を設計する前にRNPによる編集の感触をつかむのに役立ちます。