嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡
2018年3月21日
このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々 の嗅覚ニューロンをアクティブに使用されます。幼虫の動きが同時に追跡、デジタル記録、カスタムで作成されたソフトウェアを使用して分析します。
この方法論の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫の嗅覚ニューロンの同時光遺伝学的刺激に応答してナビゲーション行動を分析することです。この方法は、嗅回路機能の包括的な分析を可能にし、嗅覚回路機能が行動応答にどのように変換されるかについての研究を補完します。この技術の主な利点は、従来の匂い勾配の代わりに光を使用して個々の嗅覚ニューロンを活性化することによる特異性と時間制御です。
実験を開始するには、光を奪われた行動アリーナを構築します。厚さ3mmの黒色のプレキシガラスアクリルシートで作られた、89 x 61 x 66センチメートルのボックスを構築します。ボックスをビヘイビアルームのテーブルトップに置きます。
次に、ブラックボックスの天井中央にIR Longpass 830ナノメートルフィルターと8mmF1.4 Cマウントレンズを装着したモノクロUSB 3.0 CCDカメラを取り付けます。テーブルトップに2つの赤外線LEDストリップを配置して、暗いアリーナで幼虫を照らします。次に、22センチ×22センチメートルの正方形のアルミニウム板を入手して、LEDプラットフォームを構築します。
プレートの中央に金属カッターを使用して、CCDカメラの周りに十分な大きさの穴を開けます。金属板を赤いLEDストリップライトで覆います。LEDライトストリップワイヤを直列にはんだ付けし、ストリップワイヤをRaspberry Pi 2Bマイクロプロセッサによって制御されるフォトカプラリレーに供給します。
次に、CCDカメラの周囲にLEDプラットフォームを取り付けます。次に、フォトカプラーリレーをLEDストリップに接続する前に、Raspberry PiプロセッサにUbuntu MATE Raspbian Jessie Linuxベースのオペレーティングシステムをインストールして構成します。LEDストリップとフォトカプラに電力を供給するための電源を接続します。
動作領域のCCDカメラの周囲のさまざまなポイントに均質な放射照度があることを確認します。分光計を使用してアリーナの表面の絶対放射照度を確保し、アリーナの表面全体でメートルあたり約1.3ワットの二乗になるように決定します。標準的なフライフードのフライを摂氏25度、相対湿度50〜60%で、12時間、12時間の明暗サイクルで維持します。
CsChrimsonを1対のORNで発現するためには、UAS-IVS-CsChrimson系統の処女雌をORX-GAL4系統の雄に交配します。交配したオスとメスのハエが48時間交配して卵を産むことを許可された後、成虫を新鮮なバイアルに移します。卵を含む食品バイアルの表面に、蒸留水に溶解した89ミリモルのスクロースに、ジメチルスルホキシドまたはDMSOに溶解した400マイクロモルのオールトランスレチナール(ATR)を含む混合物を400マイクロリットル加えます。
卵を含む食品バイアルにATRを添加したら、バイアルをさらに72時間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、高密度の15%スクロース溶液を使用してフライフードの表面から3番目の幼虫を浮かべて抽出します。P1000マイクロピペットを使用して、ショ糖溶液の表面に浮かぶ幼虫を1, 000ミリリットルのガラスビーカーに分離します。
毎回ガラスビーカーで800ミリリットルの新鮮な蒸留水を交換して、幼虫を4回洗います。最終洗浄後、幼虫を10分間休ませてから、行動アッセイにかけます。ビヘイビアアッセイでは、ビヘイビアルーム内の温度と湿度を一定に保ちます。
22cm×22cm四方のシャーレに150ミリリットルの溶かした1.5%アガロースを注ぎ、幼虫の這う培地を調製します。アガロースを固化させ、ペトリ皿で1〜2時間冷却してから、挙動アッセイで使用します。アガロースが固まった後、準備した3番目の幼虫のうち20個以下をペトリ皿の中央に移し、蓋でペトリ皿を覆います。
CCDカメラの下のビヘイビアアリーナにペトリ皿を置きます。850ナノメートルの赤外線LED光源をオンにして、ビデオ内の幼虫を視覚化します。CCDカメラを起動して、幼虫の動きを記録します。
最後に、データの処理と分析に移ります。CsChrimsonを発現するORN 7aを光で刺激すると、対照動物と比較してランレングスが有意に減少しました。逆に、CsChrimsonを発現するORN 42aを光で刺激すると、対照動物と比較してランレングスが有意に増加しました。
ORN 42aでは、光刺激の時間的パターンが異なると、異なる行動反応が引き起こされることがわかった。この手法は、一次嗅覚受容体ニューロンで実証されましたが、この手法では、投影ニューロンや局所ニューロンなどの下流ニューロンが幼虫の行動に与える影響を測定するなど、将来のさまざまなアプリケーションも可能になります。この技術により、幼虫の嗅覚回路機能を包括的に解剖する道が開かれることを期待しています。
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概要
このプロトコルでは、嗅覚ニューロンへの光遺伝学的同時刺激に対するショウジョウバエ幼虫のナビゲーション行動を解析します。波長630 nmの光を用いて、レッドシフト型チャネルロドプシンを発現する特定の嗅覚ニューロンを活性化させることで、嗅覚回路の機能と行動応答の詳細な研究を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 行動神経科学
- 光遺伝学
- ショウジョウバエ遺伝学
背景
- この手法により、嗅覚回路の機能が行動反応とどのように相関しているかを探究することが可能になります。
- 従来の匂い勾配ではなく光を用いることで、活性化の時間的な制御が可能となります。
- このアプローチにより、Drosophilaの嗅覚系における特定のニューロンの解析が容易になります。
研究目的
- 嗅覚回路の機能を精密に解析すること。
- 標的ニューロンへの刺激に対する幼虫の行動反応を観察すること。
- 個々の嗅覚ニューロンがナビゲーションの選択にどのように影響するかについての知見を提供すること。
使用した手法
- 本研究では、幼虫の移動解析のためにカスタム設計された行動アリーナを使用します。
- 嗅覚受容ニューロン（ORN）にCsChrimsonを発現させたショウジョウバエ幼虫に光刺激を与えました。
- 行動アッセイには、アガロース這行培地の調製と、幼虫の移動のビデオ録画が含まれます。
- 重要なステップには、アリーナの構築、装置の設置、および特定の条件下での幼虫の準備が含まれます。
主な結果
- 特定の嗅覚受容体ニューロンへの光刺激により、幼虫の走行距離に有意な変動が生じ、行動応答が異なることが示された。
- 刺激の異なる時間的パターンにより、ナビゲーション行動に及ぼす影響が異なることが明らかになった。
- 本手法は、幼虫の行動に対する下流ニューロンの影響を今後探索する上で有用である。
結論
- 本研究は、嗅覚回路とその行動への影響を分析するための新しいアプローチを例証しています。
- これにより、研究者は生体内のコンテキストにおいて、標的ニューロンの具体的な役割を調査することが可能になります。
- これらの知見は、感覚処理および行動におけるニューロンメカニズムの理解を深めるものです。
よくある質問
産業界における重要性
本手法では、嗅覚刺激をオプトジェネティクス（光遺伝学）による制御に置き換えることで、嗅覚回路の機能を精密に解析することが可能となり、行動読み取り値を特定のニューロン活性に関連付ける必要があるという、ターゲットバリデーションにおける重要な課題を解決します。これにより、個々の嗅覚受容ニューロンがナビゲーション行動に寄与する役割を切り分けて評価できるため、初期創薬段階におけるメカニズム的なリスク低減（de-risking）が実現し、ターゲット選定における予測信頼性が向上します。このアプローチは、分子ターゲットから回路レベルの表現型までのトランスレーショナルな連続性を強化するものであり、神経科学に重点を置いた創薬プログラムにおけるターゲットのリスク低減に有用です。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 特定の嗅覚ニューロンの活性化を定義された行動出力に結びつけることで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 光刺激を用いてニューロン標的の機能的検証を行うための、再現性のあるシステムを提供する。
- 科学的価値： 個々の嗅覚受容ニューロン（ORN）を単独で操作し、幼虫のナビゲーション行動における役割を明確にすることで、生物学的なリスク低減をサポートする。
スクリーニングとアッセイ開発
- 科学的価値： 定量的な行動リードアウト（例：走行距離の変化）を生成し、ニューロン変調効果の標準化された評価を可能にする。
- 運用的価値： 嗅覚回路機能の遺伝学的または薬理学的変調因子のスクリーニングに向けた、拡張可能なアッセイプラットフォームを構築する。
- 科学的価値： オプトジェネティクス刺激を用いることで、匂い物質の揮発性や提示のばらつきを排除し、アッセイの標準化を促進する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：遺伝学的に操作可能な生物を用いて、感覚から行動への変換プロセスを解析することを可能にし、疾患に関連したシステムモデリングを支援します。
- 運用的価値：哺乳類での検証前に、神経標的が行動に及ぼす影響を評価するための、前臨床試験に適合したワークフローを提供します。
- 科学的価値：上流の神経活動がどのように下流の行動表現型に変換されるかを明らかにすることで、メカニズムに基づいたリスク低減を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期探索の連続的なプロセスに組み込まれており、行動表現型解析によるターゲット検証を支援するとともに、測定可能な出力を駆動する神経標的を明確にすることで、リード化合物の同定に寄与します。
- 基礎生物学研究： 幼虫のナビゲーション行動を駆動する個々の嗅覚ニューロンの機能について、仮説検証を可能にします。
- スクリーニング： 化合物や遺伝的モジュレーターの評価に適した、定量的で再現性のある行動指標（走行距離）を提供します。
- 分析： 追跡可能な行動アウトプットと、刺激条件下と対照条件の間の統計的比較を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： ニューロン回路の活動と行動反応を結びつけ、より高次なモデルへの外挿をサポートします。
- 汎用的再利用： 嗅覚およびその他の感覚回路におけるニューロン標的を体系的に調査するための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経活性化と行動結果の関連付けにおける曖昧さを軽減し、予測の信頼性を高める。
- 運用上の価値：変動しやすい臭気刺激の代わりに光遺伝学的制御を用いることで、再現性と標準化を向上させる。
- 戦略的価値：標的と行動表現型の間のより明確な機序的関連性を提供することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：創薬に関連する系で検証された行動への影響に基づき、リスク調整後の標的優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- Drosophilaの遺伝学、光遺伝学、および行動解析設計に関する専門知識が必要です。
- 行動アリーナ、赤外線（IR）照明、CCDカメラ、およびRaspberry Piベースの刺激制御システムなどの専門的な機器に依存します。
- 幼虫の調製、アガロース培地の調製、およびビデオトラッキングプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なるニューロンタイプ（例：投射ニューロン、局所ニューロン）や発生段階へ適用を拡張する際は、調整上の検討事項が含まれます。
- モデルシステムにおける遺伝学的アクセシビリティおよび網膜給餌の必要性に制限されており、非Drosophilaシステムへの拡張性は制約される可能性があります。
