チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

これらの方法は、優れた官能基耐性と良好な収率を有するチオエンまたはチオインクリックケミストリーの使用により、チオエーテルテザリング環状ペプチドの生成を簡素化します。この技術の主な利点は、チオエーテルテザーが微量な修飾部位を提供し、ペプチド合成修飾後の安定ペプチドの化学空間を大幅に拡大することです。手順を開始するには、50 ミリグラムのRink Amide MBHA樹脂で満たされたカラムを、ベンチトップ真空マニホールドと窒素またはアルゴンガスラインの両方に3方向ストップコックを介して取り付けます。

1〜2ミリリットルのジクロロメタンを樹脂の床に加え、不活性ガスの泡の流れで混合物を穏やかに攪拌して10分間樹脂を膨潤させます。終了したら、ゴム製のピペットバルブで樹脂を排出します。次に、1〜2ミリリットルのN末端Fmoc脱保護溶液を樹脂に加えます。

不活性ガスで10分間泡立たせて混合物を穏やかに攪拌し、その後、ゴムピペットバルブで樹脂を排出します。同様に、カラムを 1 〜 2 ミリリットルの DMF で洗浄し、続いて 1 〜 2 ミリリットルの DCM で洗浄します。保護解除シーケンスを一度繰り返します。

次に、0.125ミリモルのFmoc保護アミノ酸と50.5ミリグラムのHCTUを0.5ミリリットルのDMFとポリプロピレン容器に混ぜ合わせます。混合物を1分間振とうして、固形物を溶解します。次に、43.5マイクロリットルのDIPEAを加え、容器をさらに1分間振とうして、0.25モルの活性化アミノ酸溶液を得ます。

洗浄したレジンにこの溶液を加え、不活性ガスを混合物に1〜2時間泡立てます。その後、結合したアミノ酸残基を脱保護して洗浄します。このようにしてアミノ酸をペプチド鎖に結合させ続け、線状ペプチドを形成します。

固相ペプチド合成を使用して、モノ-S-5残基から3単位分離されたトリチル保護システイン残基を含む直鎖ペプチドを支持する樹脂を調製します。50ミリグラムのペプチド含有樹脂に1〜2ミリリットルのトリチル脱保護溶液を加えます。混合物に窒素ガスを10分間泡立てます。

脱保護液を水気を切り、DCMの1〜2ミリリットル分でレジンを3回洗浄します。脱保護手順を6回、または溶液が黄色で表示されなくなるまで繰り返して、システインを完全に脱保護します。システインのTrt基の完全な脱保護は、次の光反応ステップにとって非常に重要です。

レジンを1〜2ミリリットルのDMFとDCMで順番に洗います。その後、1〜2ミリリットルのメタノールに樹脂を2分間浸漬し、樹脂を収縮させます。メタノールを排出し、窒素ガスで樹脂を5分間乾燥させます。

乾燥樹脂を計量紙で10ミリリットルの丸底フラスコに移します。窒素をスプラージしたDMFの2ミリリットルに樹脂を懸濁します。次に、5.6ミリグラムのMMPと38ミリグラムのMAPを光開始剤として追加します。

フラスコに攪拌棒を置き、フラスコをゴム製の中隔でキャップします。フラスコ雰囲気を窒素ガスで3回パージし、合計で約5分間パージします。反応フラスコをUVAランプ、不活性窒素ガス入口、攪拌板を備えたフォトリアクター

混合物の攪拌を開始し、フォトリアクターを閉じます。フォトリアクターをアルゴンで10分間パージします。その後、アルゴンの流量を1分あたり1リットルに設定し、室温で1時間UVA光を照射します。

HPLCで反応をモニターします。終了したら、環状ペプチドを洗浄、切断、精製します。ガンマ置換モノ-S-ファイブ残基を含む線状ペプチドを有する樹脂を50ミリグラム調製します。

レジンをDMFとDCMで順番に洗浄します。メタノールで樹脂を収縮させ、窒素ガスで乾燥させます。次に、10ミリリットルの丸底フラスコに、窒素をまき散らしたDMFの2ミリリットルに樹脂を懸濁します。

混合物に5.6ミリグラムのMMP、3.8ミリグラムのMAP、および25.7ミリグラムのFmoc保護システインを加えます。.フラスコに攪拌棒を追加し、ゴム製のセプタムで密封し、フラスコの雰囲気を窒素ガスでパージします。その後、不活性窒素ガス充填フォトリアクターにUVA光を照射し、室温で1〜2時間撹拌します。

LC-MSで反応をモニターします。光反応が完了したら、結合したペプチドを洗浄し、マクロラクタミゼーション反応を行います。その後、アミノ酸と環状ペプチドのカップリングを再開して、目的の構造を形成します。

終了したら、ペプチドを切断して精製します。末端チオールを含む残基から3単位分離された末端アルキンを持つ残基を含む線状ペプチドを含む樹脂を50ミリグラム調製します。樹脂からペプチドを切断し、1ミリリットルの冷たいジエチルエーテルで沈殿させます。

ペプチド混合物を12, 000倍gで2分間遠心分離する。上清を静かにデカントし、さらにミリリットルの冷たいジエチルエーテルを追加します。洗浄をさらに2回繰り返し、ペプチド残渣を真空下で乾燥させます。

丸底フラスコで50ミリリットルの窒素をまき散らしたDMFに残留物を溶解します。ペプチド溶液に3.2ミリグラムのDMPAを加え、反応混合物を通して窒素を10分間泡立てます。不活性雰囲気は、溶液相での効果的なチオイン光反応に厳密に必要です。

また、紫外線照射時に硫黄の酸化が観察されました。その後、不活性窒素ガス充填フォトリアクターで室温で30分から1時間攪拌せずにUVA光を照射します。終了したら、環状ペプチドを分離して精製します。

このペプチドの樹脂上での環化により、線状ペプチドと同一の分子量を有するチオエーテルテザー結合された1、5環状ペプチドが生成された。環状生成物のHPLC保持時間は、直鎖ペプチドの保持時間よりも2分短かった。良好な変換は、他のいくつかの短いペプチドのオンレジンサイクル化についても観察されました。

線状ペプチドは、光誘起チオール-インヒドロチオ化を介してペプチドステープルを受ける能力についてスクリーニングされました。2 cの低収率は、20員大環状に収縮する際に、北末端でチイルラジカルを捕捉するための立体配座の好みに起因していました。ペプチド1のaと1のbはどちらも、8員の硫化ビニル架橋を持つ2つの異性体を生成しました。

製品ペプチド2 a-Aおよび2 a-Bは、保持時間が異なり、異なる照射時間で異なる比率で産生されました。陽子NMR分光法は、2つのa-Aが硫化ビニルのE-異性体であり、2つのa-BがZ-異性体であることを示しました。Z異性体は、ペプチド2 d、2 e、および2 fを形成する際の主要な生成物であり、これは7員の硫化ビニル架橋の形成中の立体配座選好に起因していました。

円二色性分光法は、ペプチド2 aおよび2 bのすべての形態にランダムコイルを示し、ペプチド2 dにらせん状立体配座を示しました。私たちは、光誘起チオエンおよびチオインクリックケミストリーを使用して、チオエーテルおよび硫化ビニルテザーペプチドを構築するための一連の化学プロトコルを開発しました。私たちは、それが研究コミュニティに役立つと信じています。