大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

この方法により、研究者は発生免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに十分な数の細胞種を取得することができます。この手法の主な利点は、少数の選択マーカーに依存して、従来はex vivoで低数に見られる多数の細胞を単離できることです。この技術の意味は、多数の前駆細胞の分離を可能にするため、治療用骨髄移植にまで及びます。

プロトコルを開始するには、事前に準備したマウスの後肢と胴体を75%エタノールで飽和させ、湾曲した組織ハサミで股関節の周りの皮膚に浅い切り込みを入れます。次に、後ろ足を取り外して剥がします。鉗子を使用して、皮膚を腰から足首に向かってしっかりと引っ張って筋肉を露出させ、はさみを使用して皮膚のフラップを取り除きます。

大腿骨と股関節のすぐ上を切開し、骨を切開して後肢全体を取り除きます。滅菌済みのバイオセーフティキャビネットで作業し、脚を事前に準備したペトリ皿の1つに移します。ハサミを使って足首のすぐ下を切り、筋肉と弾力性のある結合組織をできるだけ慎重に取り除きます。

洗浄した骨を2番目に準備したシャーレに移します。次に、大腿骨、膝、脛骨を分離します。鉗子を使用して、脚を膝で保持し、骨髄、大腿骨の上部と脛骨の端に向かって骨腔内のかすかな赤い線を見つけます。

はさみで、骨髄が終わっているように見える場所のすぐ上で脛骨を切ります。膝関節のすぐ下を切り、膝関節のすぐ上に切ります。次に、大腿骨と脛骨から骨髄を洗い流します。

10ミリリットルのシリンジに50ミリリットルの円錐管からの完全な媒体を入れ、シリンジを23ゲージの針でキャップします。3番目に準備されたペトリ皿の上に鉗子で骨を保持し、針を骨管に挿入し、メディアを押し通して細胞を洗い流します。ボーンを通して色が見えなくなるまで、この手順を繰り返します。

骨端を粉砕して手順を続けます。2枚目のシャーレに入ったまま、鉗子で膝蓋骨をしっかりと持ち、注射器の先で膝をつぶします。骨端が赤くなくなるまで続けます。

シリンジを使用して、2番目と3番目のペトリ皿から細胞を50ミリリットルのチューブに移します。ピペッティングで静かに上下させて塊を砕き、気泡が発生しないようにします。細胞を遠心分離します。

次に、血清ピペットで上清を取り除き、ペレットをフリックして取り除き、赤血球を1ミリリットルの塩化アンモニウムカリウムまたはACK溶解緩衝液で室温で1分間インキュベートして溶解します。血清ピペットを使用して、40ミリリットルのHBSSバッファーを追加します。血清ピペットを使用して、70マイクロメートルのセルストレーナーで細胞をろ過し、新しい50ミリリットルの円錐管に入れ、細胞を遠心分離します。

血清学的ピペットを使用して、上清を除去し、組換えマウスGM-CSFの10ナノグラム/ミリリットルで10ナノグラム/ミリリットルの骨髄細胞を完全な培地で培養します。血清学的ピペットを使用して、細胞を組織培養プレートに移し、染色を進める準備ができるまで、5%二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。優しく、しかし徹底的に、細胞を上下にピペットで動かし、緩く付着した細胞を取り除きます。

血清ピペットを使用して、細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞を遠心分離します。上清を穏やかに注ぎ、血清ピペットで30ミリリットルのFACS洗浄緩衝液(SFWB)を加えてペレット化した細胞を洗浄します。その後、細胞を遠心分離し、洗浄を繰り返します。

次に、抗体メーカーの指示に従って細胞を懸濁し、染色します。1ミリリットルのFWB中に7番目の細胞に10の5倍を再懸濁し、蛍光色素で標識した抗Ly-6Cおよび抗CD115をそれぞれ2マイクログラム加える。CMPとMODCをさらに区別するには、2マイクログラムの抗CD11C抗体を追加します。

サンプルを氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、血清ピペットを使用して10ミリリットルのFWBを添加し、細胞を遠心分離します。上清を静かに注ぎ、血清ピペットで30ミリリットルのFWBを加えてペレット化した細胞を洗浄します。

細胞を遠心分離し、洗浄を繰り返します。細胞を懸濁する前に、チューブを十分にフリックしてペレットを外す。血清学的ピペットを使用して、FWBの1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞で細胞を再懸濁し、35マイクロメートルの細胞フィルターでろ過します。

血清学的ピペットを使用して、ろ過した細胞をポリペラインチューブに移し、チューブを氷上に置いて、選別する準備が整います。未染色のコントロールをセルソーターに通し、ゲートを適用して小さな破片や高粒度の粒子を除外します。単一の蛍光コントロールサンプルをセルソーターに通し、必要に応じてコンペンセーションを調整します。

マルチラベルサンプルのサンプルを実行し、4つの異なる母集団を観察します。ゲートを適用して、4 つの主要な母集団のそれぞれを分離します。十分な量の子牛胎児血清(FCS)を追加して、収集チューブを準備し、満杯になったときに少なくとも20%の最終濃度を達成します。

たとえば、5ミリリットルのチューブを使用する場合は、選別する前に1ミリリットルのFCSを追加し、総容量が5ミリリットルに達したらチューブを取り外します。メンブレンのターンオーバーと抗体の取り込みを防ぐために、ソート全体を通してすべてのサンプルを摂氏4度に保ちます。必要な数の細胞が収集されたら、血清学的ピペットを使用して細胞を新しい円錐管に移し、細胞を遠心分離します。

上清を慎重に除去し、細胞を10ミリリットルのFWBに再懸濁し、細胞を再度遠心分離します。FWBサスペンションを合計2回の洗浄を繰り返します。最後に、2回目の洗浄後に上清を取り除き、実験の設計に基づいて進めます。

できるだけ多くのチャネルを解析に利用できるようにするために、生存細胞は、非常に小さなイベントや非常に粒度の細かいイベントを除外し、前方散乱光と側方散乱光に基づいて定期的に選択しました。このゲーティング戦略が死細胞を確実に排除したかどうかを判断するために、サンプルを7-アミノアクチノマイシンD.Cellsで染色しました。収穫直後に分析した細胞には、骨髄から新たに単離された細胞に典型的なFSC、SSCゲートを適用したとき、7-AAD陽性細胞の約10%が含まれていました。同様の割合の死細胞が、培養のstay 1およびstay 3にも存在しました。

5日目までに、ゲート内の死細胞の数は5%に減少したため、このような生存率ゲートを使用することは、一般に5日目以降のソーティングに適しています。フローサイトメトリーでは、Ly6C陰性、CD115集団、CD3、CD45R陽性細胞内で、0日目から3日目まで強く持続することが明らかになりました。4日目には、少数のCD3、CD45R陽性細胞のみが残り、5日目と6日目までに、CD3、CD45Rを発現する細胞は存在しませんでした。したがって、GM-CSFでの培養後4日以内に、系統陽性細胞は基本的に存在せず、培養の5日目と6日目にはまったく検出されませんでした。

この手順を試みる際には、細胞の組成が培養の長さに依存することを覚えておくことが重要です。収穫後3日後に選別すると、初期段階の数が多く、後期段階が少なくなり、5日後に選別された培養物ではその逆になります。