Name: 導電性足場を調節して幹細胞を提供するには (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶ導電性ポリマー足場を用いた幹細胞の電気刺激とラットへの低侵襲移植法。脳卒中回復研究や細胞治療への応用可能性を探索する革新的なプラットフォームです。

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QRT PCR 機の使用ありがとう博士カティ andreasson 間違いなく天才 (神経内科・脳神経科学、スタンフォード大学)。仕事は (P.M.G.) に健康補助金 K08NS098876 の国立研究所およびスタンフォード大学医学部学部長員 (体臭) にによって支えられました。

すべての幹細胞と動物の手続きは研究所動物愛護 (SCRO 616、APLAC 31909) のスタンフォード大学の管理パネル、スタンフォード大学の幹細胞研究管理委員会によって承認されました。
1. ガラス基板エッチング
<ol><li>インジウム錫酸化物 (ITO) の準備-ガラスの導電面にマスキング剤を配置することによって覆われ、ガラスのスライド。 注: ほとんどの市販の透明テープは、マスキング剤として使用できます。<ol>
<li>刃を使用して余分なマスクを削除、ガラスに覆われた目的の最終的な伊藤設計の形状だけを残してします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>硝酸の 5% (v/v) と 45% (v/v) エッチング ソリューションを準備するヒューム フード内ガラス ビーカーに塩酸を組み合わせます。<ol>
<li>70 ° C でエッチング液の温度を維持するのにホット プレートと温度計を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エッチング液 70 ° C に達すると、過剰の ITO 層を取除くために 2 分のためのソリューションにマスク ITO ガラス スライドを配置します。 注: テープ マスキングは酸溶液への暴露から ITO 層を保護します。</li>
	<li>スライドをソリューションから削除し、脱イオン (DI) H2o. でそれをすすいでください。</li>
	<li>マルチメータを使用して残りの伊藤が維持されていることを確認するマスクおよび測定抵抗を慎重に取り外します。目的のエッチング領域のリードアウトは、約 0 Ω をする必要があります。</li>
</ol>2. ピロール溶液の調製
<ol><li>1000 mL のガラス瓶の中・ ディ ・ H2o. の 600 mL のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム (NaDBS) の 70 g を溶かす</li>
	<li>NaDBS が解散した後 14 mL 0.2 M ピロールと・ ディ ・ H2O の mL の 386 をソリューションに追加します。</li>
	<li>アルミ箔とソリューションをカバーし、4 ° C で保管</li>
</ol>3. めっきガラス基板上ヘのポリピロール
<ol><li>NaDBS は完全に再溶解されるまでは、部屋の温度にピロール解決を暖めます。 注: これは、約 15 〜 20 分かかります。</li>
	<li>ピロール溶液 25 mL をビーカーに注ぐ。</li>
	<li>マルチメータにエッチングのガラス基板を接続し、ピロール ソリューションにスライドが水没します。<ol>
<li>0 Ω 抵抗側がプラチナ メッシュ参照電極に向かって直面していることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPy マルチメータ (電流 3 mA/cm2で 4 時間制御) を用いた ITO 表面にめっきを開始する電流を適用します。</li>
	<li>デジタルマルチメータと洗って電気めっき-PPy ・ ディ ・ H2O 残留界面活性剤を削除するから ITO ガラスを削除します。</li>
	<li>かみそりの刃を使用して ITO ガラスからめっき PPy プレートを注意深く取り外します。<ol>
<li>常温 PPy プレートを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ポリジメチルシロキサン (PDMS) の準備
<ol><li>ヘラと計量皿を使用して、基本エージェントの 18 g を混ぜて硬化剤 2 g と 2 つ 10 cm × 8 cm ガラス金型に流し込みます。</li>
	<li>15 〜 20 分の真空チャンバーを使用して金型から泡を削除します。</li>
	<li>3 h の 70 ° C のオーブンで金型を配置します。</li>
	<li>いったん冷却、金型から、PDMS を削除するのに平らなヘラを使用します。</li>
</ol>5.体外刺激チャンバーの作製
<ol><li>オートクレーブ 1 時間 120 ° C で金属板 (WxL、2.5 cm × 12.5 cm) とフロー バルブします。</li>
	<li>チェンバー スライドをテンプレートとして使用して、PDMS の 2 つの部分をカットします。 注: PDMS のワンピースは、セル室の細胞部屋から 2 つの隣接する正方形の排気切替器との境界として機能します。もうひとつ、PDMS 商工会議所の境界の概要であります。<ol>
<li>カット内部をセル商工会議所、それは正方形形、セル室の図形と一致します。PDMS の両方の部分の全体の形状は長方形、チェンバー スライドのと一致することを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>層材料のトップに下から次のよう: (1) メタル プレート、 (切り抜き)、なし (2) PDMS (3) PPy プレート (PDMS に垂直)、 (切り欠き) PDMS (4) と (5) セルの商工会議所。</li>
	<li>一度完全に整列装置を一緒にクランプします。</li>
	<li>金属線の 2 つの 60 cm 部分をカットし、商工会議所の外側から突き出ている PPy 板の両端に 1 本のワイヤーを接続する銀ペーストを使用します。その線がインキュベーターの外側に装置を拡張するのに十分な長さを確認します。</li>
	<li>銀ペーストの硬化後、強化し、エポキシとワイヤーの接続をシールします。<ol>
<li>応用分野は、各商工会議所で同じであることを確認するテスターを使用して抵抗を記録します。</li>
		<li>注入、削除線;細胞培養チャンバーをアンクランプし、PDMS し、それらを導電性の足場から分離します。注入された足場の寸法は、約 1 × 3 × 0.25 mm です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ひと神経前駆細胞 (hNPCs) PPy 上のめっき
<ol><li>2 時間の紫外線の下で組み立て室を滅菌します。<ol>
<li>1 時間後回転組み立て室 90 °。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌後、PPy コーティング基板の 800 μ L でチャンバーの下部の表面をコート、1 h の 5% CO2で 37 ° C でインキュベーターで PPy プレート上を固めるため基板を許可します。</li>
	<li>1 時間後の部屋から上澄みを除去し、ウェルあたり DPBS + Ca、Mg の 1 mL で優しくすすいでください。 メモ: は、基材の剥離の原因になります、力強く PPy の表面を洗浄しないでください。</li>
	<li>新鮮な携帯メディアを使用して、機械的に穏やかなピペッティングで組織培養プレートからチャンバー用培養細胞を切り離して考えます。 注: セルは 90-100% 解離に合流をする必要があります。</li>
	<li>8000 × g で 5 分間遠心分離を用いた hNPC ペレットを収集します。</li>
	<li>診断を使用して、カウント、100,000 セル/cm2のボリュームに細胞を再懸濁します。</li>
	<li>各商工会議所よく (100,000 セル/cm2メディアの 1 ml) に 100,000 細胞をプレートします。</li>
	<li>5% で 37 ° C でインキュベーターに部屋を戻る CO2.
</li>
</ol>7. hNPCs の刺激
<ol><li>1 日播種後、チャンバーに細胞は、細胞に電気刺激を適用するのに波形発生器を使用します。</li>
	<li>刺激の前に各商工会議所からも古いメディアを削除し、新鮮なメディアの 800 μ L で補充します。</li>
	<li>メディアが変更された後チャンバーをインキュベーターに配置、インキュベーター、外ワイヤーを拡張し、波形発生器に接続</li>
	<li>注 mV、100 Hz と 1 h で方形波信号を細胞に刺激を適用されます。</li>
	<li>、刺激後ワイヤーを取り外して 5% CO2と 37 ° C で設定インキュベーターの別の日の両院を孵化させなさい。</li>
	<li>セル実行可能性および量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) 次の製造元のプロトコルを含む後続の生物学的解析を実行します。</li>
</ol>8. PPy体内注入
<ol><li>T 細胞欠損の遠位中大脳動脈 (dMCA) 閉塞ストローク モデルを実行として成人男性裸ラット (NIH RNU 230 ± 30 g) は前述2。注入 1 週間ポスト dMCA オクルー ジョンを実行します。</li>
	<li>手術の前日は、ケージ水ラットにアンピシリン (1 mg/mL) を与えます。</li>
	<li>使用して誘導室にラットを麻酔イソフルラン吸入による投与の 0.5 - 3 %mg/kg。</li>
	<li>つま先ピンチ反射応答の欠如によって、ラットの anesthetization を確認してください。<ol>
<li>動物は、麻酔下では、その膜の色、呼吸パターン、および直腸温 15 分毎に監視を継続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anesthetization を確認した後は、乾燥を防ぐためにラットの目に人工涙液を適用します。</li>
	<li>無菌が滅菌手袋、滅菌手術用ドレープ13を使用して、この手順の間維持されることを確認します。滅菌フィールド内で無菌手術器械を保ちます。</li>
	<li>麻酔下ラットですが、左の皮質上頭をドリルします。硬膜を開きます。<ol>
<li>マイクロ薄い手術用の針を使用して脳から硬膜を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>インプラント システムの in vitroラット大脳皮質から導電性足場。 注: 実験の日 3 hNPC めっき後体外から足場を注入しました。<ol>
<li>脳卒中病変の内側半影野で主にインプラントを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>足場を配置すると後、は、皮膚縫合の動きを防ぐためにインプラントの上 surgicel を置きます。</li>
	<li>縫合傷がシャット ダウンし、ブプレノルフィン SR 定位手術と dMCA の閉塞に伴う痛みを管理するための 1 mg/kg の用量でラット皮下注入します。</li>
	<li>意識を取り戻すと、回復ケージにラットを配置します。<ol>
<li>動物が離れないで意識ではありません。</li>
		<li>それは完全に意識を得ているまでは、他の人と動物を置かないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>体重減少、減少食品/水の摂取量、削減グルーミング/ボサボサ コート、自発運動の減少/増加、異常姿勢、脱水/スキン ・ テンティング、くぼんだ目、隠れ、自傷などの痛みの兆候を毎日動物を監視します。急速な呼吸、開いて口呼吸、けいれん、震え、震えと発声。<ol>
<li>食べる、飲む、グルーミング、体重; 表示されるまで毎日動物を監視します。毎週体重増加の後。</li>
	</ol>
</li>
	<li>飲んで食べてない、表示される任意の動物に CO2吸入と (のような動物が正常な酸素供給のポスト CO2吸入による復活しないようにする) euthanization の二次確認を介して初期の euthanization が発生して初期手術後の体重苦痛に表示されます。または運動皮質の赤字を予想よりも大きいため行動のテストを完了することができませんが表示されます。</li>
</ol>

<ol><li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Science+of+Stroke%3A+Mechanisms+in+Search+of+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li>
<li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke%3A+A+Phase+1%2F2a+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Stroke+Therapeutics%3A+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li>
<li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li>
<li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal%2FStem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
<li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+Biomaterials%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Cases%22%5BJournal%5D)">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li>
<li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation%3A+New+Perspectives+in+CNS+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li>
<li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li>
<li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li>
<li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li>
<li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075(2017).</li>
<li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li>
</ol>

著者はこの仕事を宣言する利害の対立があります。

成長の証拠として新規ストローク療法幹細胞の約束を実証しています。この約束は、少なくとも 40 進行中または完了した臨床試験とベッドサイドに幹細胞治療を進めるための主要な努力になりました。ストローク病理学では、幹細胞療法に向いている急性侮辱後回復を防止する神経変性プロセスがないためユニークな神経疾患を提供しています。幹細胞が強化された脳卒中の回復の正確なメカニズムは不明のまま。血管新生、シナプス形成、シナプスの改造はすべて重要であることに示されています。BDNF など THBS 1 シナプス形成に重要な分子が削除されると、脳卒中の回復は障害6,19です。hNPCs は、多数の動物モデル20,21脳卒中後の機能回復を改善しています。メカニズム、hNPCs の効果のまま完全に理解し、これらの細胞の最適な配信方法が知られています。HNPCs からリリースされた重要な分子を操作することができますシステムを開発するこ...

ストロークは、世界の死の 2 番目の主要な原因とアメリカ合衆国の死の 5 番目の主要な原因です。にもかかわらず、これらの高死亡率、脳卒中の回復のための治療現在無し医療選択肢の現在利用可能な1課題のまま。うちだけ 40 利用幹細胞の虚血性脳卒中を扱う 300 の臨床試験について現在あります。前の研究は、幹細胞治療にストローク修理2,3に有益な効果があることを示しています。脳由来神経栄養因子 (BDNF) やトロンボスポンジン 1 (THBS-1) 移植ひと神経前駆細胞 (hNPCs) から放出されたなどのパラクライン因子の増加に関連付けられているメカニズムを通して機能の回復機能の向上が示されています。シナプス形成、血管新生、樹状突起分岐、新しい軸索投射だけでなく、免疫系4,5,6を調節すること。ただし、幹細胞の最適な配信方法は、とらえどころのないままです。
脳に成功した幹細胞配信課題のまま。現在、幹細胞を提供する注射ハイドロゲルと高分子足場システムが導入されています。移植時に幹細胞を保護し、宿主の炎症反応と低酸素の条件7,8,9を含む過酷な脳卒中後の環境からの保護を提供するこれらの送付方法,10します。 ただし、最も一般的に使用される材料は、不活性細胞11の連続変調方式 (すなわち、電気刺激) の使用を制限します。電気刺激は分化、イオン チャネル密度、および幹細胞12の神経突起伸展に影響を与えるです。不活性ポリマーと比較して、導電性高分子は電気刺激と幹細胞2の操作を現在可能を運ぶことができます。ただし、電気刺激、(すなわち、 BDNF および THBS 1) 神経栄養因子の遊離を調節する正確なメカニズムはまだ完全に検討されます。
このプロトコルでは、導電性高分子の足場は、体外の電気刺激は、ポリピロール (PPy) から成る細胞培養系を構築する手順を示します。細胞培養系を作製方法により遷延皮質に幹細胞シード足場の後続の注入が可能です。このシステムのため我々 電気的前提、裏付け足場に幹細胞注入前に短期間のため。次の電気刺激は、低侵襲による頭蓋内細胞を運ぶ導電性高分子足場は正常に注入しました。

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ng/mL for working media</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>LIF Protein, Recom. Hum. (10 &micro;g/mL)</td> <td>EMD ミリポア</td><td>LIF1010</td><td>10 ng/mL ワーキングメディア</td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーン 3.9 kg</td><td>フィッシャーブランド</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーブランド</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>硝酸濃縮物 (認定) ACS、フィッシャーケミカル</td><td>フィッシャーブランド</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>伊藤ガラス</td><td>デルタテクノロジー</td><td>ズ CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム ドデシルベンゼンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ピロール</td><td>シグマ</td><td>131709-500ML</td><td>光と室温からピロール溶液を保護します</td></tr><tr><td>8 ウェル ガラス スライド チャンバー</td><td>Thermo Sci Nuc&nbsp;</td><td>125658</td><td>セルチャンバーを取り外し、滅菌状態に保ちます</td></tr><tr><td>平面ブラケット、3 "x1"</td> <td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>TWO PART SILVER PAINT 14G</td><td>電子顕微鏡科学&nbsp;</td><td>1264214</td> プラスチックプレートDPBS、1x、CaおよびMg、フェノールレッドジェネッセなしのプラスチック<td>プレートに2つの部分(1:1)を混合</td></tr><tr><td></td><td>します&nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA 神経細胞培養培地キット</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1ヒト神経前駆細胞拡張キット</td><td>アルナ・バイオメディカル&nbsp;</td><td>&nbsp;hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>非接触流量調整バルブ、ニッケルメッキ真鍮、3/32インチから5/8インチチューブ外径</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr>マルチ<tr><td>メータ</td><td>キーサイト&nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>Wavefoamジェネレーター</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Pt メッシュ</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>参照電極 寸法、1x1 cm</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存能力/細胞毒性キット、哺乳動物細胞用</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02718934_s1</tr><tr><td>THBS1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs00962908_m1</tr><tr><td>GAPDH</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>RNeasy ミニキット (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAシュレッダー (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 & マイクロ;L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>4369510</tr><tr><td>7-8週齢、オス、RNUラット</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethicon Silk Suture</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Original Absorbable Hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>ラボ標準定位固定装置、ラット</td><td>ストールティング</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>キンバリークラークプロフェッショナル&nbsp;セーフスキンパープルニトリル滅菌試験用手袋</td>フィ<td>ッシャーブランド</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドレープ</td><td>メドライン</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;シャンドン ステンレス製メス刃 ハンドル、ホールド No. 20-25 ブレード</td><td>フィッシャーブランド</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>ウォルター スターン メス ブレード シリーズ 300</td><td>フィッシャーブランド</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex リアルタイム PCR システム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>フレイジャー マイクロ ディスセクション フック</td><td>ハーバード デバイス</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

導電性足場を調節して幹細胞を提供するには

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

幹細胞療法が治療、エキサイティングなストロークとして浮上しているが、最適な配信方法は不明のまま。マイクロインジェクション法は脳卒中モデルで幹細胞を提供する何十年も使用されてきましたが、この手法は注入前に幹細胞を操作する能力の欠如によって制限されます。本稿では、幹細胞配信用導電性高分子足場の使用法を詳しく説明します。導電性高分子足場を用いた幹細胞の電気刺激は、細胞の生存、炎症反応とシナプスのリモデリングに関与する幹細胞の遺伝子を変更します。電気前処理後は、足場に幹細胞は遠位の中大脳動脈閉塞ラット モデルで頭蓋内移植されます。このプロトコルは、導電性高分子足場経由で幹細胞を操作するための強力な手法をについて説明し、さらに幹細胞を用いた治療法を開発するための新しいツールを作成します。

図 1に示す回路図は、hNPCs および潜在的なダウン ストリーム アプリケーションの電気刺激の全体的なワークフローを表します。幹細胞治療で現在の制限は、幹細胞が炎症や虚血性の条件を含む厳しい移植後環境にさらされていることです。そうこれらの困難な条件は、その治療効果14,15を制限します。この環境から hNPCs を保護する導電性足場の使用可能性があります電気的前処理による hNPCs 治療効果を増大させます。この幹細胞技術の最初のステップは電気めっきのアプローチ2,16を使用して導電性足場材料を開発。我々 の足場の生体適合性を特徴し、hNPCs と電気的前処理特性を最適化します。コントロールは、組織培養プレート上に成長した物質の幹細胞として定義されました。
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このプロトコルを記述するように導電性高分子足場の in vitro電気刺激および幹細胞播種の足場を使用しての注入その後体内の幹細胞の播種細胞培養系の作製、低侵襲技術。

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

この手順の全体的な目標は、導電性ポリマー足場上の幹細胞のin vitro電気刺激と、その後のin vivo移植のためのプラットフォームを作成することです。この方法は、幹細胞を調節する手段を提供することで、脳卒中研究や幹細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。主な利点は、幹細胞をin vitroで最適化し、その後移植できることです。この方法は脳卒中の回復に関する洞察を提供しますが、新しい細胞送達方法として他のシステムにも適用できます。一般に、この技術に不慣れなユーザーは、細胞室の組み立てに必要な精度と、頭蓋切除術に関連する技術のために苦労するでしょう。準備として、2.5 x 12.5センチメートルの金属板とフローバルブをオートクレーブします。次に、チャンバースライドをテンプレートとして使用して、PDMSを2枚カットします。1つのピースは、チャンバーの周囲の輪郭を描く役割を果たします。2番目のピースで、チャンバースライドの内側から隣接する2つのピースを切り取ります。どちらのピースも長方形で、チャンバースライドと一致する必要があります。次に、マテリアルを重ねます。金属板から始めて、次に切断されていないPDMS、次に垂直に配向したポリピロール板、次に切り欠きのあるPDMS、最後に細胞チャンバー。レイヤーを慎重に位置合わせし、cl 装置を一緒に。次に、金属線を2本の長さに切断して、装置からそれを含むインキュベーターの外側まで伸ばします。通常、60センチメートルの長さは十分な長さです。次に、チャンバーの外側から突き出たポリピロールプレートの両端に銀ペーストを使用してワイヤーを取り付けます。銀ペーストが硬化したら、エポキシを使用して接続部を補強し、シールします。次に、マルチメータを使用してアセンブリ全体の抵抗を記録します。適用されるフィールドは、各チャンバーで同じである必要があります。次に、細胞をアセンブリ上に播種し、テキストプロトコルに記載されているように電気的に刺激します。細胞を埋め込む前に、アセンブリからワイヤーを取り外してください。次に、セルチャンバーのクランプを解除し、PDMSを導電性スキャフォールドから分離します。これで、足場を埋め込む準備が整いました。手術の1日前に、対象の動物に飲料水中のアンピシリンを提供します。.手術当日は、ラットにイソフルランを麻酔し、つま先をつまんで麻酔を確認します。次に、ラットの目に人工涙液を塗布して、目を湿らせます。頭蓋骨を剃った後、動物をドレープし、無菌手術の準備をします。防護服を着用し、滅菌した道具を開梱し、頭皮を消毒します。頭蓋切除術の場合は、左皮質の上の硬膜まで穴を開けます。開口部をインプラントのサイズである1 x 3ミリメートルよりわずかに大きくします。次に、硬膜を開き、極細の外科用針を使用して硬膜を脳から取り除きます。TC培養インキュベーターからリグを取り外し、リグを無効にします。次に、in vitroシステムから導電性足場をラット皮質に慎重に移植します。次に、インプラントをサージクルで覆って固定するか、皮膚の閉鎖中にインプラントが動く可能性があります。次に、4-0シルク縫合糸を使用して傷口を縫合します。縫合が完了した後、ラットにブプレノルフィンSRを皮下注射します。次に、ラットが意識を取り戻すまで回復ケージに入れます。術後の手順は、テキストプロトコルで詳しく説明されています。ヒト神経前駆細胞を電気刺激に曝露し、細胞生存率アッセイで染色しました。緑色は生きている細胞を示しています。細胞は明らかに電気刺激に耐えることができました。脳卒中の回復に重要な神経前駆細胞から放出される因子を、定量的RTPCRを使用して1マイクログラムの全RNAから評価しました。デルタデルタサイクル閾値法を用いて結果を正規化した後、電気刺激への曝露がBDNFおよびTHBS1の発現をアップレギュレーションしたことを明らかにしました。この手順を見た後、導電性幹細胞の細胞培養システムを作成する方法と、その後それらの幹細胞をラットモデルに移植する方法を十分に理解しているはずです。一度マスターすれば、適切に行えば45分で手続きを進めることができます。この手順を試みている間は、適切な麻酔を確保するために、適切な呼吸パターンと膜の色について常に動物を監視することを忘れないでください。ラットや幹細胞を扱う作業は危険な場合があり、適切なPPEを着用するなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ導電性ポリマー足場を用いた幹細胞の電気刺激とラットへの低侵襲移植法。脳卒中回復研究や細胞治療への応用可能性を探索する革新的なプラットフォームです。

導電性足場を調節して幹細胞を提供するには

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