Name: 人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ 心外膜由来細胞の分離と培養法。ヒト心臓組織を用いて上皮間葉転移や細胞増殖を研究し、心臓発生と疾患における心外膜の役割を解明する。この技術は臨床応用への翻訳にも貢献する。

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この研究はオランダ組織科学的研究 (NWO) (イタリアヴェネツィア 016.146.079)、LUMC 研究フェローシップ AMS と LUMC Bontius スティヒティング (MJG) の両方でサポートされます。

人間の組織標本で実験にはライデン大学医療センター倫理委員会で承認され、ヘルシンキ宣言に準拠しています。細胞文化フロー キャビネットの滅菌装置のすべての手順が実行されます。
1. 準備
<ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM 低グルコース) と中 199 (M199) を 1:1 の比率で混合することによって追求メディアを準備します。10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS、56 ° C で 25 分の不活化熱) を追加 100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/mL を補足します。あらかじめ暖かい EPDC 37 ° C の水浴中。</li>
	<li>あらかじめトリプシンを暖かい 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C の水浴中。</li>
	<li>ゼラチンで井戸をコートします。各ウェルに 0.1% ゼラチン/PBS を追加し、37 ° C で少なくとも 15 分版を孵化させなさい必要な細胞培養プレートのためのガイドラインを表 1にまとめます。細胞をメッキする前にすべての流体を慎重に取り外します。</li>
	<li>ストック溶液 10 mM SB431542 (SB) DMSO (注意) を希釈を準備します。50 μ L の因数は、円錐の底のポリプロピレン製遠心チューブ、エッペン チューブのような-20 ° C で保存SB 因数を一度だけ解凍できることに注意してください。</li>
</ol>2. 検索や成人および胎児心臓標本の記憶
<ol><li>15 mL と 50 mL のチューブで手術中に除去に直接人間の大人心耳を保存 10 %fbs、100 U/mL ペニシリンおよび 4 ° C で 100 mg/mL ストレプトマイシンを含む高グルコース DMEMサンプル サイズで 3-5 cm は、一般的に、最大保存することができます郭清後 48 h。</li>
	<li>分離後 24 h 最大 4 ° C で EPDC 媒体で人工妊娠中絶材料から得られた胎児の心を格納します。このプロトコルの 12-22 週間の間の妊娠期間でサンプルを使用します。心外膜の隔離のため、心臓全体を使用できることを注意してください。</li>
</ol>3. 心外膜層の分離
<ol><li>流キャビネット、PBS の 100 mm 細胞培養皿を準備し、蓋に PBS の独立した液滴 (〜 200 μ L) を配置します。5 mL に予め温めておいた追求中 15 mL チューブを入力します。</li>
	<li>場所細胞培養皿にティッシュ PBS でいっぱい。組織はプロシージャの間によく湿らされたことを確認します。</li>
	<li>顕微鏡を使用して、多くの削除できるだけ組織サンプルから心外膜層鉗子を使用して剥がして。 注: 非常に薄い透明なレイヤー (図 1 a) 心臓の外側に密着、心外膜を認識できます。これは分離が阻害されますから心外膜脂肪組織と血管の混入を避けてください。</li>
	<li>蓋の上の PBS の液滴の心外膜組織の断片を収集します。</li>
	<li>メス (図 1 b) を使用してまたは小さな鉗子の先端が鋭いを使用して小さな断片 (0.5 mm3) に心外膜組織を切断します。作品が、P1 を渡すことに注意してください 000 ピペット先端部 (ステップ 3.6)。</li>
	<li>心外膜組織にトリプシンの 1 つの mL を追加し、作品と P1, 000 ピペット先端部とトリプシンを収集します。1.5 mL の円錐形遠心管 (図 1) に組織を転送します。</li>
	<li>〜 60 rpm で揺れながら 10 分の 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>風呂の水からチューブを外し、70% エタノールで管の外側を清掃します。</li>
	<li>(図 1) の管の底に沈むし、トリプシンを不活化する 5 mL EPDC 媒体を含んでいる 15 mL チューブに心外膜細胞を含む上清を慎重に転送する組織を許可します。</li>
	<li>1 mL のトリプシン、円錐形遠心分離機管の残りのティッシュを補充して上下に軽くピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>3.7 に 3.10 の手順を 2 回繰り返します。最後のステップでトリプシン培養の 30 分の合計後上澄みと残りの心外膜組織に転送 EPDC 媒体を含んでいる管。</li>
	<li>追求中のすべてのセルが収集されると、優しく通過懸濁液 10 mL シリンジ 19 ゲージの針で機械的に細胞 (図 1E) を分離する新しい 15 mL チューブに。 注: を妨げ得ること針を防ぐために針をソリューションを通過する前に上下にピペッティングによる懸濁液を均一に確認します。</li>
	<li>さらに細胞を分離するには、21 g 針付き 3.12 手順を繰り返します。</li>
	<li>50 mL チューブの上に 100 μ m セル ストレーナーを置き、10 mL のピペットを使用してすべての残りの塊 (図 1 f) を削除するストレーナーに心外膜細胞を含む培地を転送します。</li>
	<li>こし器に 5 mL EPDC 媒体をピペッティングして残留細胞を収集するストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>15 mL チューブに 50 mL の管から細胞懸濁液をピペットで移しなさい。以来、細胞はチューブの底に沈む、ピペッティングする前にソリューションを軽く振る。 注: この手順は必要ではありません、小さい管は遠心分離後、ペレットの可視化を支援します。</li>
	<li>(図 1) 室温で 5 分間 200 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>上澄みを除去し、追求中 (表 1) の必要量で (図 1 H) 細胞ペレットを再懸濁します。 注: 胎児 EPDCs EPDC 培 ALK5 キナーゼ阻害剤 (EPDC + SB) の 10 μ M を直接使用します。大人の細胞は、最初の通過中に SB なしメッキできます。</li>
	<li>ゼラチン コーティング培養皿 (図 1I) に細胞懸濁液をプレートします。井戸のサイズは、心外膜組織サンプル (表 1) のサイズによって決まります。低密度で EMT の発生を誘発することに注意してください。</li>
	<li>37 ° c、5% CO2細胞培養プレートにアタッチするを許可するように、少なくとも 48 時間のためのインキュベーターにセルを配置します。</li>
</ol>4. EPDCs の文化
<ol><li>少なくとも 3 日ごと EPDC + SB 媒体を補充します。</li>
	<li>顕微鏡を使用して、少なくとも 3 日間、細胞を検査します。細胞培養プレートが細胞で完全に覆われているとき密度、すなわちに到達、表面比 1:2 のセルを通路します。Confluency に達する 〜 5-10 日を取ることができますに注意してください。<ol>
<li>例えば、ガラス ピペット、ピペットまたは吸引システムを使用してメディアを吸い出しなさい。</li>
		<li>PBS をセルに追加することによって、細胞を丁寧に洗います。ゆっくり版は渦巻きし、PBS を吸引します。</li>
		<li>プレートにトリプシンを追加します。優しくトリプシン セルはすべてをカバーし、37 ° C で 1 分のプレートをインキュベートするプレートを回転します。 注意: 可能な限り小さなトリプシンとして使用 (表示: 200 μ L/6 ウェル ウェル プレート)</li>
		<li>プレートの底から細胞を機械的に切断するプレートをタップします。顕微鏡を使用して、細胞が切断したかどうかを視覚的に確認します。ない場合は、余分な分インキュベート細胞培養プレート。</li>
		<li>セルに追求 + SB 中の必要量を追加、上下、ピペッティングで再懸濁し、細胞懸濁液を新しいゼラチン コーティング培養プレートに転送します。 注: 一般的には、細胞に保存できます 8 の通路まで石畳形態。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. EPDCs で EMT の誘導
<ol><li>EMT を誘導して、トリプシンと転送新しいゼラチンにセル、4 で説明したように EPDC + SB 中に、表面比 1:2 の井戸をコーティングし、37 ° C、5% CO2で少なくとも 24 時間インキュベート細胞を分離します。</li>
	<li>チェック場合合流は 50-70% と EPDCs ある石畳の形態であるかどうかです。 注: の Confluency EMT を受ける EPDCs の能力に影響します。</li>
	<li>細胞から培地を吸引させ、慎重に PBS のセル (4.2.1 - の手順を参照してください 4.2.2)。</li>
	<li>1 ng/ml TGFβ3 EPDC 培地で細胞を刺激し、37 ° C、5% CO2の 5 日間でインキュベーターで配置します。刺激の中に TGFβ3 を含む追求中が持たない補充するに注意してください。</li>
	<li>セルを毎日監視します。5 日後、EMT を受けた細胞は紡錘形の形態 (図 2 a) によって認識されます。</li>
	<li>文化追求中に SB の TGFβ 添加せず 4 で説明されている方法に従って紡錘形 EPDCs。一般に、紡錘形 EPDCs 注は、20 の通路まで培養することができます。</li>
	<li>免疫蛍光染色と EMT の発生を検証ファロイジン、間葉系のマーカー αSMA またはビメンチンに対する抗体を使用して F-アクチン繊維の応力 (図 2 b) の形成を検出するまたは EMT 関連遺伝子 (の qRT PCR を使用して例えば、WT1, ペリオスチン Col1A1、αSMA、N-カドヘリン、MMP3、カタツムリ、ナメクジ) (図 2および表 2)。</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
<li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-Derived+Heart+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li>
<li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li>
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<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li>
<li>Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li>
<li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation%2C+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li>
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<li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li>
<li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692(2012).</li>
<li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
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<li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells%3A+a+novel+model+to+study+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li>
<li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li>
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</ol>

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ここで人間の成人および胎児心に由来する一次心外膜細胞を分離するための詳しいプロトコル文化について述べる。これらの細胞の広範な評価は、以前に公開された17をされています。我々 は両方のセルタイプを ALK5 キナーゼ阻害剤 SB431542 による培養上皮の石畳のような細胞として維持できることを示しています。EMT は開発およびポスト傷害応答中に体内の心外膜活性化の不可欠な部分です。TGFβ の追加でこのメソッドを使用して、EMT を研究できます。重要なは、SB が削除されると、大人の EPDCs だけ刺激17時に EMT を受ける中胎児 EPDCs が急速に自発的な EMT を受けるを以前見ました。胎児 EPDCs でこれらのプロセスを勉強して最適な損傷後大人の心外膜をアクティブにする方法を理解する上で役立つ可能性があります。
提案手法は、手術中に得られた患者の材料に依存します。したがって、1 つはいずれかにより患者の変動や手術室の材料を収集する速度である分離した、材料...

心外膜、封筒、心は、極めて重要な心臓の開発と修理 (スミッツらの見直しのための単一細胞上皮層1). 発達、心外膜に起因 proepicardial 器官の開発の中心部の底部にある小さな構造。マウス、および 4 週間後の概念で、人間の発達の日 E9.5、周辺細胞はこのカリフラワー構造からの移行し、開発心筋2をカバーを開始します。単一の上皮細胞層が形成され、一度心外膜細胞の一部は上皮間葉転換 (EMT) に行われます。EMT、中に細胞は細胞接着斑などの上皮性特性を失うし、それらの発展途上の心筋に移行する能力を与える間葉系の表現型を得る。後者の 2 つのセルが形成された心外膜派生セル (EPDCs) が線維芽細胞、平滑筋細胞、および可能性のある心筋細胞、内皮細胞3を含むいくつかの心筋細胞タイプに区別できます。集団のまま (スミッツらの見直し議論の対象と4). さらに、心外膜、その成長と血管新生5,6,7、8を規制する心筋に有益なパラクリン シグナル。複数の研究は、障害の心外膜形成が心筋9,10, 血管11及び伝導システム12、強調、エッセンシャルで発育障害につながることを実証しています。心の形成に心外膜の貢献。
大人の心、心外膜は休眠層として存在が、それは虚血13の時に再開になります。心外膜再ポスト傷害のいくつかを繰り返すプロセス説明にもかかわらず増殖と EMT14などを含む心臓の開発の小さい効率的に。興味深いことに、正確なメカニズムは十分に理解されていないが修復への貢献を心外膜変更 VEGF-A mRNA16心の改善の結果、例えば、サイモシン β415と治療によって改善できるまたは心筋梗塞後の機能。心外膜は、傷ついた心臓の内因性修復を高めるために興味深い細胞ソースとみなされます。
心臓発生のメカニズムは頻繁に締めくくっているけが、中にあまり効率的な方法ではあるが。心外膜の活性化を求めて、それは決定し、胎児および大人の心外膜の全容量を比較できますは重要です。また、治療の観点から、動物実験だけでなく人間の心外膜の応答に関する知識を拡張、重要です。ここでは、分離し、細胞の培養ひと成人および胎児心外膜派生 (EPDCs) 上皮細胞の形態で、EMT を誘導する手法について述べる。このモデルでは、探索し、成人および胎児の心外膜細胞の挙動を比較を目指します。
このプロトコルの主な利点は、徹底的に検討されていない人間の心外膜材料の使用です。重要なは、説明の分離および細胞培養のプロトコルは、これらの 2 つのセルのソース間の直接比較を有効にする両方の胎児および大人の石畳 EPDCs を取得する単一の統一された方法を提供します。さらに、心外膜は分離の場所に基づいて、セルが実際に epicardially 派生17であることが保証されます。
人間の追求の分離メソッドが以前に確立されると、大抵伸長プロトコル細胞培養皿18,19に心臓や心外膜組織の部分をメッキパーツに依存してこれら。このアプローチは、部分的に彼らの上皮性の表現型を失うことが、移行するために、自発的な EMT を受けることになりやすい細胞用により選択します。現在のプロトコルの心外膜は最初の上皮の状態を維持するために分離の EPDCs を可能にする単一細胞液に処理されます。このメソッドは、したがって心外膜 EMT を勉強する固体の in vitroモデルを提供します。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン G ナトリウム塩</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸</td><td>塩</td><td>Roth HP66</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 1:250 牛膵臓由来</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン 豚皮由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>培養プレート 6 ウェル</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>培養プレート 12 ウェル</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>培養プレート 24 ウェル</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&マイクロ;L フィルター付きピペットチップ</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ピペット</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ピペット</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>または自家製で滅菌済みの</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>針 19 ゲージ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>針 21 ゲージ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainerセルシーブ、100 & マイクロ;m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;3&nbsp;</td><td>R&Dシステム</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗アクチン &α;-平滑筋</td><td>シグマ</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ピペット P1,000</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー</td><td>インテグラ</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>倒立光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

心外膜, 心筋を覆う上皮細胞層は、虚血性損傷後、心臓の開発中に、心の修復反応での重要な役割にいます。アクティブになったとき、心外膜細胞は再生心筋細胞を提供するでは上皮間葉転換 (EMT) 知られているプロセスを経る。さらに、必須のパラクライン因子の分泌を介して、心外膜が貢献しています。心外膜の再生の可能性を完全に鑑賞するには、ひと細胞モデルが必要です。ここでは、人間の成人および胎児の心臓組織から一次派生心外膜細胞 (EPDCs) を導出する新規細胞培養モデルを概説します。EPDCs を分離するには、心外膜が心臓標本の外から解剖、単一細胞懸濁液に処理します。次に、EPDCs はメッキ、ALK 5-キナーゼ阻害剤の上皮性の表現型を維持するために SB431542 を含む追求培地で培養しました。EMT は TGFβ 刺激によって誘導されます。このメソッドは、制御された設定で人間の心外膜 EMT の過程の研究を有効にした最初の時間のため、心臓再生を助けることができる EPDCs の secretome でより多くの洞察を得ることが容易になります。さらに、この統一的なアプローチは、人間の成人および胎児心外膜挙動の直接比較のためことができます。

ここでは、我々 は人間成人および胎児心臓組織 (図 1) から EPDCs を分離するための単純なプロトコルを概説します。(図 1 a) 心臓の外側の心外膜の容易にアクセス可能な場所のこのプロトコルを活用します。心耳垂染色後郭清基になる下の細胞外マトリックスと心筋組織のままそのまま (図 1 j) WT1 + 心外膜が削除されることを示します。EPDCs エクスプレス心外膜マーカーなど、その他中心部居住者セル型、例えばPECAM1、ISL1、CD34 の TNNT2 の ALDH1A2、TBX18、KRT8、KRT19 欠如表現ことを示す前に、広範な評価を行われています。17
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心外膜細胞と心筋壁に成長因子を提供することによって開発し、中心部の修復に重要な役割を果たしています。ここでは、研究と彼らの発達と大人の特性の比較を可能にする培養ひと心外膜細胞に手法について述べる。

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

この手順の全体的な目標は、心外膜細胞の挙動を研究するために、ヒト心外膜由来細胞を単離して培養することです。この方法は、心臓の発達や病気の際に心外膜がどのように活性化されるかなど、心臓研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒトの心臓組織サンプルに適用できることであり、その結果を臨床現場に応用するのに役立つ可能性があります。私たちのプロトコルは、心外細胞の上皮から間葉への移行の研究を説明しています。ただし、因子の増殖や分泌の研究にも使用できます。まず、100 mm の細胞培養皿に PBS を層流キャビネット内に充填します。約200マイクロリットルのPBSを蓋に入れ、5ミリリットルの予熱したEPDCメディウムを15ミリリットルのチューブに加えます。成人の心臓から分離された心臓組織を皿に入れます。実体顕微鏡下で、鉗子を使用して心外膜層を慎重に除去します。次に、心外膜組織の断片を蓋に集め、メスを使って0.5立方ミリメートルの小片に切ります。ティッシュピースに1ミリリットルのトリプシンを追加します。P1000ピペットチップを使用して、1.5ミリリットルの円錐形遠心チューブに移します。次に、チューブを摂氏37度で10分間インキュベートし、60RPMで絶えず振とうしながらウォーターバス内でインキュベートします。インキュベーション後、70%エタノールでチューブを洗浄し、組織が底に沈殿するのを待ちます。次に、心外膜細胞を含む上清を5ミリリットルのEPDC培地を含む15ミリリットルのチューブに慎重に移し、トリプシンを不活性化します。遠心分離チューブ内の残りの組織に1ミリリットルのトリプシンを加え、穏やかなピペッティングで混合します。次に、トリプシンインキュベーションステップをさらに2回繰り返します。最終収集後、残りの心外膜組織を細胞懸濁液を含むチューブに移します。穏やかなピペッティングで細胞懸濁液を完全に均質化し、19ゲージの針を備えた10ミリリットルのシリンジを使用して懸濁液中の細胞を機械的に解離し、懸濁液を新しい15ミリリットルのチューブに移します。細胞をさらに解離するには、細胞懸濁液を21ゲージの針が付いた10ミリリットルの注射器に通します。次に、10ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブの上にある100マイクロメートルのセルストレーナーに移します。サスペンションをストレーナに通して、残っているすべての塊を取り除きます。5ミリリットルのEPDC培地をストレーナに加え、残留細胞を収集します。短時間穏やかに混合した後、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、室温で200gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、細胞ペレットをEPDC培地に再懸濁します。ゼラチンコーティングされたプレートからコーティ

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このプロトコルでは、W eは心房性不整脈に貢献したマウスとヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規な集団を同定したマウスでトリガします。...

マウスの心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する

初代細胞培養物は、特に、特定の発達段階におけるトランスジェニックマウス胚からの細胞の特定の集団を分析するのに有用な技術である。ここでは、胚の心室を切開し、解離、および抗体結合ビーズを認識し、さらなる分析のために内皮細胞を分離しています。...

胚心室内皮細胞の単離

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。...

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

ここでは、マウス初代心外膜細胞をアウトグロース培養アッセイで単離する方法と、ex...

心外膜の伸長文化検定と<em&gt; ex vivoで</em&gt;心外膜由来の細胞移動の評価

&gt;jove_content&lt;心外膜は、心血管の発達と再生に必要な多能性心血管前駆細胞とパラクリン因子の不可欠な供給源です。ここでは、マウス胚性心外膜細胞を培養する方法について述べる。...

マウス胚心臓から心外膜細胞の体外培養で

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。...

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。...

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。...

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

ラット心臓から消化バッファーにおける連続組織消化、再発遠心サイクルからの細胞採取、抗ラットCD31マイクロビーズによる細胞浄化を通じて、内心細胞と冠状動脈内皮細胞を単離するためのプロトコルを提示する。...

ラット心臓の心室自由壁からの心内膜細胞と冠状動脈内皮細胞の分離

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(&lt;50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。...

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

学ぶ 心外膜由来細胞の分離と培養法。ヒト心臓組織を用いて上皮間葉転移や細胞増殖を研究し、心臓発生と疾患における心外膜の役割を解明する。この技術は臨床応用への翻訳にも貢献する。

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

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