Name: 単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶジカ回復期血清を用いたデングウイルス抗体依存強化測定法。フローサイトメトリーで血清の感染増強能を評価し、ワクチン開発や公衆衛生に重要なウイルス相互作用を解明する簡便なプロトコルです。

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記載されているプロジェクトは、JJM に健康科学の制服サービス大学からの資金によって支えられました。著者のプライベートなものは、意見またはアサーション記載する解釈として公式または反射防衛省、健康科学の制服サービス大学や米国の他の機関の見解ではないです。政府は。
WGV すべての実験を行いデータを分析JJM 設計し、試験を監督ニシコククジラ、JJM 紙を書いた。

ここで説明されたプロトコルを示すために使用する血清サンプルは評価・実験動物ケアの認定会で収容されたローカルの状態に従っての世話と連邦の方針であったアカゲザルから得られました。国際 (AAALAC)-施設を認定します。すべての動物実験したレビューし、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され共有プロトコル組織のサンプルが買収されました。
1 日 1
注: 次の BSL 2 実験室での培養に使用される滅菌流バイオのキャビネットで説明すべての手順に従います。
<ol><li>室温で血清サンプルを解凍し、各血清試料 100 μ L を生殖不能の管に転送します。水浴または温度調整可能な thermomixer で 56 ° C で 30 分間熱を不活性化します。冷たい RPMI 10 (10% 牛胎児血清を RPMI) を使用して縮尺を 1:1 に至る血清サンプルの 10 倍のシリアル希薄を作る。</li>
	<li>滅菌 96 ウェル V 底プレートの各ウェルに 10 μ L の血清を希釈したサンプルを転送します。だけと、血清サンプルと RPMI 10 のみ RVPs と血清サンプルなしなし制御井戸、RPMI-10 RVPs との 2 つのセットが含まれます。各血清サンプルとトリプリケートで RPMI 10 コントロールを設定します。</li>
	<li>-80 ° C の冷凍庫と雪解けからデング熱 1、2、3、4 の RVPs を削除するそれらを 37 ° C の水浴。すぐに氷の融解の RVPs に転送します。各血清サンプルの約 170 μ L RVPs を取得 (各血清希釈用 RVPs x 3 井戸の 10 μ L (1:1、1:10, 1: 100, 1:1, 000) ごとに RVP を RPMI 10 RVPs x 3 井戸の 10 μ L は井戸を制御するだけと)。</li>
	<li>各血清サンプルを含む 96 ウェル V 底板のもと RVPs (血清ない) コントロール井戸を RPMI 10 に RVPs の 10 μ L をピペットします。RVPs RPMI 10 だけに (ない血清サンプルとない RVP) 井戸を追加しないでください。上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。10 μ l 添加冷 (ない血清サンプルとない RVP) 制御井戸のみ各冷たい RPMI 10 に RVPs の代わりに RPMI 10。</li>
	<li>96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO2の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。96 ウェル V 底プレートを培養すると、一方バイオ セーフティの 70% のエタノールでキャビネットの表面をきれいにし、15 分間紫外線を実行します。</li>
	<li>インキュベーターから K562 細胞の完全に合流 T75 フラスコを削除、5 mL の滅菌ピペットを使用してセルをミックスし、セルの 5 mL を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。 注: K562 細胞を RPMI 10 で維持し、1 x 106/mL で継代します。</li>
	<li>滅菌 15 mL の円錐管から 10 μ L のセルを削除することによって細胞の数を数えるし、10 μ L tryphan ブルー ミックスします。15 mL コニカル チューブ内のセルの合計数を決定するための診断を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>10 分間 〜 1,200 x g で細胞と円錐形の 15 mL を遠心、上清をデカント、暖かい RPMI - 10 メディア (2.66 × 106セル/mL) の 80,000 のセル/30 μ L の濃度で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>インキュベーター (ステップ 1.6) から 96 ウェル V 底板を削除、96 ウェル V 底プレートの各ウェルに K562 細胞の 30 μ L を転送し、上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO2の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>1 時間インキュベート後 5 分のインキュベーターと 〜 1,200 × g で遠心分離から 96 ウェル V 底プレートを削除します。遠心分離の後に、10% の漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって井戸からメディアをデカントします。</li>
	<li>暖かい RPMI 10 125 μ L でそれらを再各ウェルの細胞を洗い、ピペット、徹底的に混ぜて、10% 漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって ~ 1,200 x g で 5 分間デカント メディアでプレートを遠心します。この洗浄ステップを 2 回繰り返します。</li>
	<li>洗浄後、それぞれに RPMI 10、上下をピペットで移しなさい、ミックス暖かいの 100 μ L を追加し、5% CO2の存在下で 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい。</li>
</ol>2 日目 3
<ol><li>細胞とメディア/ウェル インキュベーターから 100 μ L を含む 96 ウェル V 底板を削除し、バイオ セーフティ キャビネットに移動します。ミックス、マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれの内容もセルを転送し、96 ウェル U 底面にメディア プレート済みラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブ。</li>
	<li>1% の 100 μ L で 96 ウェル V 底プレートの各ウェルを洗浄パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) そして最終をもたらすステップ 2.1 から 96 ウェル U 底プレートまたはラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブにそれぞれの井戸に転送 × 1濃度 0.5 %pfa/ウェルまたは管。マルチ チャンネル ピペットを使用して徹底的にミックス、カバー プレート、アルミ箔を 30 分セルを修正するためのインキュベーター内に座らせてください。</li>
	<li>準備流れの cytometer (例えば材料のテーブルを見なさい) 無染色の K562 細胞側と前方散乱と蛍光設定のキャリブレーションを実行することによって。必要なだけ蛍光チャネルは、GFP は、細胞から放出される唯一の蛍光 FL1、です。取得 ~ 30, 000-50,000 各サンプルからの細胞します。 メモ: 単一蛍光を読み取ることができる任意の流れの cytometer は、RVPs 感染細胞が GFP の存在のために緑の蛍光を放出するのみ、他の蛍光チャネルを必要としない、データの集録に使用できます。</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>
流れフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で取得したデータを分析 (材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>セット最初のゲートは対 FSC H (前方散乱-高さ) を単一細胞分析12から自動蛍光ダブレットを含めたり除外する FSC A (前方散乱-エリア) に基づいています。その後、SSC A に基づいて一重項ゲート セルをゲート (側方散乱-エリア) vs される破片を除外する FSC の。</li>
		<li>SSC A 対 FSC A ゲート細胞を分析する SSC の対に基づく GFP の表現 GFP A.GFP 陽性細胞の周りにゲートを設定することによって各希釈血清とコントロール サンプルの GFP 陽性細胞の割合を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の合計を 3 で除して各血清サンプルの希釈やコントロール井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値を決定します。</li>
	<li>RVPs (血清サンプルはない) コントロール井戸を RPMI 10 の GFP 陽性細胞の割合の平均値で割った各希釈血清サンプルで GFP 陽性細胞の割合の平均値を割ることによって感染の倍充実を計算します。</li>
	<li>希釈 (x 軸)、対倍強化 (y 軸) をグラフし、多重比較のためのテューキー事後テスト続いて ANOVA を使用して統計分析を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

DENV や ZIKV などの発現は、両方の構造および非構造タンパク質13,14お互いと交差反応する抗体を生成する相同性の重要な証拠を共有します。これらの交差反応性抗体応答を高めるために示されている感染症の両方との in vitro異種血清または他関連発現1,2。クロスの感染を高める可能性のある病気を管理するため、ワクチンの開発に重大な意味があります。
基づく従来の培養の試金は血清の存在下で感染ライブ DENV と感染している非感受性細胞を使用します。感染症の強化は、標準的なプラクの試金11を使用して上清中のウイルスの量を定量化することで測定されます。この試金は 2 つのセルラインのウイルスの培養を必要とし、実行に大幅に長い期間が必要です。さらに、いないすべての DE...

感染症の抗体依存強化 (ADE) は、ウイルスの血清型による部分的に交差反応性抗体がウイルス、高められたウイルスの複製とウイルス血症につながる他の血清型の取り込みを強化するというプロセスです。ADE は、広く 4 つの主要な血清型が流行しているデング熱ウイルス (DENV) 感染症に記載されています。患者のサブセット、ADE はデング出血熱 (DHF) に関連付けられています。ジカ ウイルス (ZIKV) の感染誘導 DENV ADE体外を引き起こし、DENV生体内でウイルス血症1の強化に貢献した DENV 交差反応性抗体の有意に高い値であることが最近分かった,2抗体依存強化試金、関連ウイルスの二次感染を強化とフラビ ウイルス感染症の発症機序に貴重な洞察力を提供し、通知に対する抗体の能力を評価する貴重なツール、。ワクチンの開発。
説明アッセイは、ここが感染症に通常許容 K562 細胞と一緒に DENV RVPs を使用します。RVPs が構造的にそのまま複製無能 DENV ウイルス粒子レプリケーション3の単一のラウンドの後に表示されるサブ ゲノム緑色蛍光タンパク質 (GFP) レプリコンをエンコードします。など、RVPs に感染している細胞は緑色の蛍光を発する、フローサイトメトリーや顕微鏡を使用して容易に検出することができます。この試金で使用される RVPs は、商業ソースから得られました。あってもいい、しかし、他のウイルスに対して生成され、本稿に記載されている試金で使用されます。一方、K562 細胞、抗体の Fc 領域に結合し、サブ中和抗体4、5の濃度の存在下で感染 FcγIII 受容体発現の白血病細胞株であります。
ADE の試金は体外ADE のメカニズムを記述する重症のデング熱の危険因子を調査し、研究で広く使用されている6,7,8。ここで説明した ADE アッセイ迅速かつ簡単に使える RVPs を使用して生体外で感染を強化し、フローサイトメトリー、現在、使用していずれかを必要とする他の試金と比較してプラーク形成による血清の容量を決定するにはVero 細胞や抗体の汚損の単位 (pfu) 感染細胞6,7,8,9,10、11、どちらも時間がかかり、労働集中的です。

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>RPMI-10</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL、RPMI-10 HEPES 中の 100 ug Strep/mL</td></tr><tr><td></td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100回;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みV底プレート</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD ファルコン ポリプロピレン 5ml FACSチューブ</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌 U底プレート</td><td>ファルコン</td><td>Ref 353910</td><td>FACSチューブに代わるハイスループットの代替品</td></tr><tr><td>5mL、滅菌済み、血清学的ピペット</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL 滅菌済みピペットチップ</td><td>デンビル</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL 滅菌ピペットチップ</td><td>デンビル</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL マルチチャンネルピペット</td><td>デンビル</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL マルチチャンネルピペット</td><td>デンビル</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% フォルマデハイド</td><td>Tousimis</td> <td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231000387</td><td>熱不活化のためのウォーターバスの代替品</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>液体漂白剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II フローサイトメーター</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのin vitro抗体依存強化測定法

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

感染症の抗体依存強化は、デング熱ウイルスの病因の主要な役割を果たすことに示されています。許容されない細胞の感染を強化する抗体や血清の容量を測定する伝統的なアッセイは、感染を定量化するプラクの試金に続いてメディアにウイルスの出力を使用してに頼ってきました。最近では、これらの試金は細胞を蛍光標識抗体を用いたデング ウイルス (DENV) 感染症を検討しています。これらの両方のアプローチには、これらの技術の広範な使用を制限する制限があります。ここでは、粒子を用いたデング ウイルス記者ウイルス (RVPs) 緑色蛍光蛋白質及び DENV 感染アカゲザルから得られた血清を用いた抗体依存強化 (ADE) を調べる K562 細胞を表す単純の in vitroアッセイについて述べるニホンザル ジカ (ZIKV) 感染後 16 週間。この手法は信頼性が高く、セルの最小の操作が含まれます、ライブ レプリケーション有能なウイルスの使用を含まない、フローサイトメトリーを用いた定量的な読み出しを取得する高スループット形式で実行することができます。さらに、このアッセイは、黄熱病ウイルス (YFV) 日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) など RVPs の利用など他のフラビ ウイルス感染症の抗体依存強化 (ADE) を調べる簡単に適合できます。アッセイのセットアップのしやすさ、データを分析し、結果の解釈になりますほとんどの実験室の設定に

4 リーサス macaques、マカク属 ZIKV 感染後収集した 16 週間をされ、その潜在的な DENV 1 を強化するテストの血清、K562 細胞における感染の 2、3、4。動物では、感染後 7 日で検出限界以下であったレベルに低下した感染後 3 日目に 〜 105枚 ZIKV RNA/mL プラズマの x 1 のピーク血を持っていた。16 週間感染後の血漿中ウイルス血症が見つかりませんでした。RVP アッセイを行ったし、収集したデータを解析していた上記のプロトコルで説明するようします。
GFP 陽性細胞を識別するために使用されるゲートの戦略は、図 1のとおりです。初期のゲートが除外されるダブレットと FSC A 対 FSC H. に基づいて単一のセルのみを含めるに設定されました次のプロットは、単一セルの門からセルのみを示しています、ゲートがあった描画に基づいて S...

デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

この手順の全体的な目標は、ジカウイルスに感染したアカゲザルから採取した血清がin vitroでデングウイルス感染の抗体依存性増強を媒介する能力を決定することです。この方法は、ジカウイルス誘発性交差反応性抗体によって引き起こされるデング熱感染の抗体依存性増強に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、トローパーが高く、シンプルで、実行が簡単なことです。この手順を実証するのは、私の研究室の新興感染症大学院生であるWilliam Valiantです。まず、血清サンプルを室温で解凍します。解凍後、各血清サンプル100マイクロリットルを滅菌チューブに移し、56°Cで30分間加熱して活性化します。次に、冷たくしたRPMI 10で、血清サンプルを1対1から1000まで10倍に段階希釈します。次に、希釈した各血清サンプルの10マイクロリットルを滅菌済みの96ウェルVボトムプレートのウェルに移します。次に、デング熱1、2、3、および4つのプロポーターウイルス粒子を摂氏37度の水浴中で解凍し、血清サンプルあたり各RVPの容量を約170マイクロリットルを確保します。解凍したら、すぐにRVPのチューブを氷に移します。次に、10マイクロリットルのRVPを、血清サンプル希釈液を含むウェルにピペットで移し、無血清コントロールウェルに入れます。ピペッティングで5〜10回上下させて十分に混合します。96ウェルのV底プレートをインキュベーターに移し、5%の二酸化炭素の存在下で摂氏37度で1時間インキュベートします。96ウェルのV底プレートがインキュベートしている間に、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールで洗浄し、UVライトを15分間実行します。次に、K562細胞の完全にコンフルエントなT-75フラスコをインキュベーターから取り出します。滅菌済みの5mmピペットを使用して細胞をよく混合し、5ミリリットルを滅菌済みの15ミリリットルのコニカルチューブに移します。次に、チューブから10マイクロリットルの細胞を取り出し、10マイクロリットルのトリパンブルーと混合して血球計算盤にロードします。セルをカウントし、セルの総数を計算します。細胞をGの1200倍で10分間遠心分離した後、上清をデカントし、培地30マイクロリットルあたり8万細胞の濃度で温かいRPMI 10に細胞を再懸濁します。インキュベーターから96ウェルV底プレートを取り出した後、30マイクロリットルのK562細胞を96ウェルV底プレートの各壁に移します。そして、ピペッティングで5〜10回上下させて十分に混合します。その後、プレートをインキュベーターに1時間戻します。インキュベーション後、プレートをGの1200倍で5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを逆さまにして10%漂白剤を含む容器にウェルから培地をデカントします。次に、各壁の細胞を125マイクロリットルの温かいRPMI 10に再懸濁し、前と同じように遠心分離して洗浄します。最後の洗浄をデカントした後、各ウェルに100マイクロリットルの温かいRPMI 10を追加します。ピペットで上下に混ぜ合わせ、5%の二酸化炭素の存在下でプレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。2日後、プレートをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネットに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの内容物を混合し、96ウェルのU底プレートに移します。96ウェルV底プレートの各ウェルを100マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドとPBSですすぎ、残りのセルとPBSを96ウェルU底プレートのそれぞれのウェルに移します。マルチチャンネルピペットを使用して十分に混合します。プレートをアルミホイルで覆い、インキュベーターに30分間置いて細胞を固定します。未染色のK562細胞を泳動し、GFP蛍光用のエチル-oneチャネルを使用してサイドスキャッターとフォワードスキャッターの設定をキャリブレーションして、フローサイトメーターを調製します。次に、各サンプルから3万から5万個の細胞を取得します。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して、前方散乱領域と前方散乱高さに基づいて最初のゲートを設定し、単一細胞を含め、自己蛍光デュブレットを解析から除外します。各病態のGFP陽性細胞の平均割合を計算し、次に各血清希釈液の感染倍率を計算します。グラフの折り畳み強調と x 軸の希釈率を比較し、ANOVA を使用して統計分析を実行し、その後に多重比較のためのテューキーの事後検定を実行します。デング熱ウイルス1レポーターウイルス粒子を用いた代表動物のデータを示す。無血清対照サンプルのGFP陽性細胞の割合は0.253%、希釈されていない血清サンプルは2.58%GFP陽性でした。GFP陽性細胞の割合は、1〜100回の希釈で0.735%、1〜1000回の希釈で0.022%に続いて、1〜10回の血清希釈で12.8%と高値に達しました。デング熱感染の抗体依存性増強について、4種類のデングウイルス血清について検討した。データは、感染後16週間で収集された血清が、1〜10の希釈ですべてのデングウイルス血清タイプによるK562細胞の感染を有意に増加させたことを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば48時間で完了します。この手順を試行する際は、30分の最終固定ステップが完了してから1〜2時間以内にデータを取得することを忘れないでください。感染した血清を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、PPEやBSL2レベルの実践を常に行う必要があることを忘れないでください。

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

このビデオは、ジカウイルス回復期血清を使用してデング熱ウイルス感染の抗体依存性増強(ADE)を測定するアッセイを示しています。このアッセイでは、緑色蛍光タンパク質をコードするデング熱レポーターウイルス粒子(RVP)を使用します。ジカウイルスに対する血清抗体は、RVPと交差反応して複合体を形成します。結合した抗体は、Fc受容体を発現する細胞によるRVPの取り込みを増強し、これはフローサイトメトリーを用いて検出されます。...

ウイルス感染の抗体依存性増強を調べるためのin vitroアッセイ

このビデオは、ヒトの病原体であるジカウイルスに対する抗ウイルス活性を持つインターフェロンをスクリーニングするためのin...

ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。...

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

ウイルスまたは細胞外小胞は、表面抗原を認識する抗体に結合した15nmの磁性ナノ粒子で免疫捕捉されました。捕捉されたビリオンまたは小胞は、他の表面抗原に対する蛍光抗体で標識されました。得られた複合体を高磁場中で分離し、蛍光でトリガーされる従来のフローサイトメーターで分析しました。...

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ジカ ウイルス (ZIKV) のための Ifnar1-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官の抗原特異的 T 細胞応答を評価するためのプロトコルを説明します。このメソッドは、有効性評価の貴重なも ZIKV...

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染症の定量化、ひと初代細胞、ひと血清を用いたデング ウイルスに対する耐性が既存のジカ...

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

現在のプロトコルはVeroのアフリカの緑の猿の腎臓の細胞のジカウイルス(ZIKV)の伝播および24-wellおよび96-well(ハイスループット)フォーマットのセルベースの比色immunodetection方法を使用してZIKVの量化を記述する。...

ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

ここでは、ヒト細胞におけるジカウイルスの感染と複製をリアルタイムで研究するための非常に簡単で簡単な方法として、細胞ベースの電気インピーダンス(CEI)の使用を示します。さらに、CEIアッセイは抗ウイルス化合物の評価に有用である。...

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

学ぶジカ回復期血清を用いたデングウイルス抗体依存強化測定法。フローサイトメトリーで血清の感染増強能を評価し、ワクチン開発や公衆衛生に重要なウイルス相互作用を解明する簡便なプロトコルです。

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