単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

この手順の全体的な目標は、ジカウイルスに感染したアカゲザルから採取した血清がin vitroでデングウイルス感染の抗体依存性増強を媒介する能力を決定することです。この方法は、ジカウイルス誘発性交差反応性抗体によって引き起こされるデング熱感染の抗体依存性増強に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、トローパーが高く、シンプルで、実行が簡単なことです。

この手順を実証するのは、私の研究室の新興感染症大学院生であるWilliam Valiantです。まず、血清サンプルを室温で解凍します。解凍後、各血清サンプル100マイクロリットルを滅菌チューブに移し、56°Cで30分間加熱して活性化します。

次に、冷たくしたRPMI 10で、血清サンプルを1対1から1000まで10倍に段階希釈します。次に、希釈した各血清サンプルの10マイクロリットルを滅菌済みの96ウェルVボトムプレートのウェルに移します。次に、デング熱1、2、3、および4つのプロポーターウイルス粒子を摂氏37度の水浴中で解凍し、血清サンプルあたり各RVPの容量を約170マイクロリットルを確保します。

解凍したら、すぐにRVPのチューブを氷に移します。次に、10マイクロリットルのRVPを、血清サンプル希釈液を含むウェルにピペットで移し、無血清コントロールウェルに入れます。ピペッティングで5〜10回上下させて十分に混合します。

96ウェルのV底プレートをインキュベーターに移し、5%の二酸化炭素の存在下で摂氏37度で1時間インキュベートします。96ウェルのV底プレートがインキュベートしている間に、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールで洗浄し、UVライトを15分間実行します。次に、K562細胞の完全にコンフルエントなT-75フラスコをインキュベーターから取り出します。

滅菌済みの5mmピペットを使用して細胞をよく混合し、5ミリリットルを滅菌済みの15ミリリットルのコニカルチューブに移します。次に、チューブから10マイクロリットルの細胞を取り出し、10マイクロリットルのトリパンブルーと混合して血球計算盤にロードします。セルをカウントし、セルの総数を計算します。

細胞をGの1200倍で10分間遠心分離した後、上清をデカントし、培地30マイクロリットルあたり8万細胞の濃度で温かいRPMI 10に細胞を再懸濁します。インキュベーターから96ウェルV底プレートを取り出した後、30マイクロリットルのK562細胞を96ウェルV底プレートの各壁に移します。そして、ピペッティングで5〜10回上下させて十分に混合します。

その後、プレートをインキュベーターに1時間戻します。インキュベーション後、プレートをGの1200倍で5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを逆さまにして10%漂白剤を含む容器にウェルから培地をデカントします。

次に、各壁の細胞を125マイクロリットルの温かいRPMI 10に再懸濁し、前と同じように遠心分離して洗浄します。最後の洗浄をデカントした後、各ウェルに100マイクロリットルの温かいRPMI 10を追加します。ピペットで上下に混ぜ合わせ、5%の二酸化炭素の存在下でプレートを摂氏37度で48時間インキュベー

2日後、プレートをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネットに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの内容物を混合し、96ウェルのU底プレートに移します。96ウェルV底プレートの各ウェルを100マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドとPBSですすぎ、残りのセルとPBSを96ウェルU底プレートのそれぞれのウェルに移します。

マルチチャンネルピペットを使用して十分に混合します。プレートをアルミホイルで覆い、インキュベーターに30分間置いて細胞を固定します。未染色のK562細胞を泳動し、GFP蛍光用のエチル-oneチャネルを使用してサイドスキャッターとフォワードスキャッターの設定をキャリブレーションして、フローサイトメーターを調製します。

次に、各サンプルから3万から5万個の細胞を取得します。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して、前方散乱領域と前方散乱高さに基づいて最初のゲートを設定し、単一細胞を含め、自己蛍光デュブレットを解析から除外します。各病態のGFP陽性細胞の平均割合を計算し、次に各血清希釈液の感染倍率を計算します。

グラフの折り畳み強調と x 軸の希釈率を比較し、ANOVA を使用して統計分析を実行し、その後に多重比較のためのテューキーの事後検定を実行します。デング熱ウイルス1レポーターウイルス粒子を用いた代表動物のデータを示す。無血清対照サンプルのGFP陽性細胞の割合は0.253%、希釈されていない血清サンプルは2.58%GFP陽性でした。

GFP陽性細胞の割合は、1〜100回の希釈で0.735%、1〜1000回の希釈で0.022%に続いて、1〜10回の血清希釈で12.8%と高値に達しました。デング熱感染の抗体依存性増強について、4種類のデングウイルス血清について検討した。データは、感染後16週間で収集された血清が、1〜10の希釈ですべてのデングウイルス血清タイプによるK562細胞の感染を有意に増加させたことを示しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば48時間で完了します。この手順を試行する際は、30分の最終固定ステップが完了してから1〜2時間以内にデータを取得することを忘れないでください。感染した血清を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、PPEやBSL2レベルの実践を常に行う必要があることを忘れないでください。