Name: クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 学ぶ高スループットSiRNAスクリーニングを用いた角膜上皮細胞の毒性物質傷害モデル。フッ化水素とクロルピクリンによる傷害メカニズムを解明し、眼の化学物質応答理解と治療戦略開発に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究によって、国家機関の健康対抗プログラム省庁間契約 # AOD13015-001 に対応しました。我々 は彼らの努力と映像制作に関する専門知識のステファニー Froberg とピーター ・ ハーストを感謝したいです。

<ol><li>Randleman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRandleman%2C+B+%22Drugs%2C+Diseases+and+Procedures%22">Drugs, Diseases and Procedures</a>. Hampton, R. , Medscape. (2011).</li>
<li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries%2C+including+amniotic+membrane+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li>
<li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+toxicology%3A+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).</li>
<li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100848/">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li>
<li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li>
<li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li>
<li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+JA+%22Chemical+Terrorism+Risk+Assessment%3B+CSAC+12-006%22">Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006</a>. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267200748_Cell-Based_Assays_in_High-Throughput_Screening_for_Drug_Discovery">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li>
<li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li>
<li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death%3A+investigating+the+potential+roles+of+the+p38%2C+p53%2C+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li>
<li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxnet%22">Toxnet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+WD+%22The+Medical+Department+of+the+United+States+Army+in+the+World+War%22">The Medical Department of the United States Army in the World War</a>. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chloropicrin+Risk+Characterization+Document%22">Chloropicrin Risk Characterization Document</a>. , California Environmental Protection Agency. (2012).</li>
<li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a11_307">Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH. (2000).</li>
<li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/corneajrnl/Abstract/2000/11003/Second_Injury_in_the_Cornea__The_Role_of.4.aspx">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+and+Recommendations+for+Dharmacon+siRNA+Libraries%22">Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf">http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+RNAiMAX+Reagent%22">Lipofectamine RNAiMAX Reagent</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
</a> (2017).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IL-8+%28human%29+AlphaLISA+Detection+Kit%2C+5%2C000+Assay+Points%22">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3">http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3</a> (2016).</li>
<li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneTitan+MC+Instrument+North+America%2FJapan+%28110V%29%22">GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V)</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372</a> (2018).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li>
<li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li>
<li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li>
<li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SN+%22Fumigants%3A+Environmental+Fate%2C+Exposure%2C+and+Analysis%22">Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis</a>. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).</li>
<li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+Academiae+Medicae+Stetinensis%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li>
<li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology%3A+Clinical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin%3A+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li>
<li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1421657/">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li>
<li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li>
<li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li>
<li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li>
<li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ATCC+Animal+Cell+Culture+Guide%22">ATCC Animal Cell Culture Guide</a>. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。
免責事項: この記事の見解は、著者の軍隊の部門、国防省、または米国政府の公式な方針を反映していません。この研究は NIH/NIAID と USAMRICD、間の省庁間の契約によってサポートされ、一部オークによって管理される大学院の研究参加プログラムで米国陸軍医療研究所の化学防衛する予定でリッジ米国エネルギー省と USAMRMC 間の省庁間協定により教育研究所。

ここ HF および CP の傷害の研究のためのモデルをスクリーニングする高スループット角膜上皮細胞の開発に、私たちの方法と結果を述べる。HF 傷害の主な siRNA 画面から結果を提案する.TIC の傷害の研究のための高温超伝導モデルの開発に多くの課題があった。我々 は細胞培養モデルの HF、HFA または CP の研究に関連する文献で見つけることができる方法は、少しの助けのだった。フッ化物イオンのほとんどの in vitro研究口腔細胞と (例についてを参照してください28,29) HF や HFA ではなく、フッ化ナトリウムを利用します。Pesonenらによる気道上皮細胞の体外露出 CP へのいくつかの方法論を公開されています。30します。 最終的には、我々 の特定のメソッドに見つかりません HF、HFA または CP の高温超伝導研究と課題と必要な高温超伝導体開発でこれらの有効成分の研究に関連した変数の大半に関連文...

化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。残念ながら、毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持のみです。現在の治療戦略は非特定、潤滑剤、抗生物質などの局所治療が主に含まれています、cycloplegics 続いて抗炎症薬 (例えばステロイド) 一度角膜1 を epithelialized、再 ,2。最高現在治療オプションは、にもかかわらず長期予後不良進歩的な角膜混濁と血管新生の2,の3のためであります。
動物モデルは、化学的毒性を調査し、傷害のメカニズムを理解する伝統的に使用されています。ただし、動物実験は時間がかかり、高価です。動物テストを削減する取り組みもあります。たとえば、欧州連合 REACH 規制 (EC 1907/2006 年) 動物実験を減らすため規定しています。規定には、動物テストおよび動物に提案するテストを実行する前に欧州化学物質庁から承認を得ることを避けるために、企業がデータを共有する要件が含まれます。リーチの規定の下で動物実験は最後の手段にする必要があります。また、動物で化粧品のテスト廃止欧州の化粧品規制 (EC 1223/2009) があります。3 r の原則に導かれるとき、動物実験が行われる (絞り込み、削減、および交換)、非動物の代わりを使用して、慈悲深い動物の研究を行って、使用する動物の数を減らすためのフレームワークを提供します。可能な限り。これらの理由から、毒物学の分野は、毒性の分子メカニズムに洞察力を提供することができますしより高いスループット4で行うことができますの in vitroアッセイを採用を求めています。これは機能的な毒物学アプローチの化学だけではなく機能別に毒性が定義されています。さらに、機能的な一歩を踏み出したトキシコゲノミクスを求める特定の遺伝子毒性5の効果を果たす役割を理解します。SiRNA 技術の応用、毒性物質を分子・細胞応答の遺伝子の機能を調べる画面を高スループットで行うことができます。siRNA は、長いポスト転写遺伝子サイレンシング経路すべて哺乳類セル6に存在する活用 19-25 のヌクレオチドは、二本鎖 RNA の分子です。これらは総合的作られて、特定の遺伝子をターゲットに設計されています。SiRNA は処理セルに導入されたとき、ガイド鎖一本鎖 RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) が読み込まれます。SiRNA は、mRNA 分子の相補的な領域に RISC を指示し、RISC の mRNA の低下します。これは特定の遺伝子の発現の減少の結果します。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。このようなアプローチは、リシン感受性のメカニズムと CYP1A17,8の AHR 依存型誘導をさらに理解するために使用されています。
化学テロのリスク評価 (CTRA) リストおよび有毒工業化学物質 (TIC) のリストは、その毒性やテロ、戦争、または産業事故イベント9にリリースされる可能性に基づいて選択化学物質を明細が。SiRNA のハイスループットス クリーニング (HTS) トキシコゲノミクスでハイリスクのテロ事件で使用する識別されている CTRA リスト毒性の研究アプローチを適用しています。伝統的な毒性化学物質が生物に悪影響を理解しようとしています。しかし、我々 は通知におそらく、治療薬や治療法の開発を目的として傷害のメカニズムを理解しさらに願望を持っている分子治療の開発の対象にすることができますを発見します。いくつかの方法でこの努力は、siRNA スクリーニングおよび薬剤の発見プロセス10に基づくセルの試金の使用に類似した考慮されるかもしれない。主な違いは、我々 のアプローチでそれはやや毒性物質曝露の治療のため治療価値の高い特異なターゲットがあるだろうと考えにくいに対し、その創は通常治療探索対象が単数形を求めているでしょう。我々 は、毒性物質の露出のための効果的な治療法のパラダイムが高い治療価値を達成するために多面的なアプローチを必要とし、トキシコゲノミクス解析を用いたデータは極めて効果的な治療パラダイムを通知ことがあることを予測します。
ベンチトップ オートメーションは、医薬品やバイオ テクノロジー産業の外の所に高スループット方法論をもたらします。当研究所での in vitroの研究は歴史的に低スループット11,12,13である伝統的なアッセイをされています。過去数年間で私たちの研究室は、siRNA スクリーニングを実行する卓上型ロボットの使用に移行しています。ここで、眼細胞モデルの精緻化と体外の開発露出の手法を提示水素フッ化物 (HF) とクロルピクリン (CP) siRNA スクリーニングに適した。私たちの目標は、これらの毒性に対して細胞傷害を調節する分子を識別することです。我々 が選択した siRNA ライブラリのターゲットには、G タンパク質共役型受容体、蛋白質キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、イオン チャネル、および他の潜在的 druggable ターゲットが含まれます。HF および CP は蒸気暴露9,14を介して眼傷害の最大のリスクを提示する研究の産業事故の ToxNet レポート CTRA リスト エージェントを相互参照によって選ばれました。CP (化学式 Cl3CNO2、CAS 番号 76-06-2) もともと、第一次世界大戦15で催涙ガスとして使用されました。それは現在として殺虫剤、殺菌剤、殺16農業燻蒸と関数として使用されます。フッ化水素 (HF) は、石油精製所、17有機化合物の電気化学的フッ素化アルキル化を含むプロセスで使用されます。HF (化学式 HF、CAS 番号 62778-11-4) ガスであるが、形式で水溶液はフッ化水素酸 (HFA、CAS 番号 7664-39-3)。したがって、我々 は我々 の細胞で HFA を使用する選出露出モデル。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞死および炎症性応答の細胞傷害に関与している目標を反映する必要がありますので、細胞生存率及び炎症性マーカー IL 8 はエンドポイントとして選択されました。具体的には、ターゲットは、毒性物質の露出の保護の役割を果たすことが、細胞死および炎症性サイトカイン産生増やす必要があります対象式は、siRNA によって阻害されるとき。否定的な役割を果たす目標の真反対のでしょう。また、露出、および細胞死経路への介入が向上臨床2,18後角膜病理学の役割を果たすに慢性的な炎症が表示されます。

<table><tbody><tr><td>Bravo リキッドハンドリングプラットフォーム</td><td>Agilentまたは同等の</td><td>G5409A</td><td></td></tr><tr><td>Bravo プレートシェイカー</td><td>Agilentまたは同等の</td><td>オプション 159</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 96LT 使い捨てチップヘッド</td><td>Agilentまたは同等の</td><td>もの オプション 178</td><td>96チャンネル大型チップピペッティングヘッドユニット</td></tr><tr><td>Bravo 96ST 使い捨てチップヘッド</td><td>Agilentまたは同等の</td><td>オプション 177</td><td>96チャンネル小型チップピペッティングヘッドユニット</td></tr><tr><td>Bravo 384ST ディスポーザブルチップヘッド</td><td>Agilentまたは同等品</td><td>オプション 179</td><td>384チャンネル スモールチップピペッティングヘッドユニット</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &mu;L 滅菌バリアチップ</td><td>Agilent または同等品</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &mu;L 滅菌バリアチップ</td><td>Agilentまたは同等品</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &mu;L 滅菌バリアチップ</td><td>Agilentまたは同等の</td><td>もの 19133-212</td><td></td></tr><tr><td>EnSpire マルチモードプレートリーダー</td><td>Perkin Elmer または同等の</td><td>もの 2300-0000</td><td>AlphaLISA アッセイ検出器 高出力レーザー励起</td></tr><tr><td>IL-8 (ヒト) AlphaLISA 検出キット&nbsp;</td><td>Perkin Elmer または同等の</td><td>AL224F</td><td>ノーウォッシュビーズベースのアッセイ</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates</td><td>Perkin Elmer または同等の</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen または同等の</td><td>13778500</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen または同等の</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco または同等の</td><td>12605010</td><td>細胞剥離ソリューション</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments または同等の</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>インキュベーター付き自動顕微鏡</td></tr><tr><td>クロロピクリン</td><td>トリニティ 製造または同等の</td><td>N/A</td><td>急性毒性および刺激性</td></tr><tr><td>DMEM-F12 細胞培養培地</td><td>Invitrogen または同等の</td><td>11330-057</td><td>HEPES を含む</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen または同等</td><td>品 1891471</td><td></td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子 (細胞培養グレード)</td><td>Invitrogen または同等品</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトインスリン (細胞培養グレード)</td><td>Invitrogen または同等</td><td>品 12585-014</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (細胞培養グレード)</td><td>Invitrogen または同等品</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン(細胞培養グレード)</td><td>シグマまたは同等の</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;(細胞培養グレード)</td><td>シグマまたは同等の</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;(細胞培養グレード)</td><td>Sigmaまたは同等の</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmaconまたは同等の</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド</td><td>Sigmaまたは同等の</td><td>M5655</td><td>MTTアッセイ基質</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>バッファーThermoまたは同等の</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>コーニングまたは同等の</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>T150細胞培養フラスコ</td><td>コーニングまたは同等の</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2細胞培養フード</td><td>Nuaireまたは同等の</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL ロボットリザーバー</td><td>サーモまたは同等の</td><td>12-565-572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96個のバッフル付き自動化リザーバー</td><td>サーモまたは同等の</td><td>もの 1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 滅菌使い捨て保存ボトル</td><td>コーニングまたは同等の</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートヒートシーラー</td><td>サーモまたは同等の</td><td>AB-1443A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートヒートシールホイル</td><td>サーモまたは同等の</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>カルダモニン</td><td>トクリスまたは同等の</td><td>2509</td><td>抗炎症剤、ポジティブコントロールSKF</td></tr><tr><td>86002&nbspとして使用。</td><td>Tocris または同等の</td><td>2008</td><td>抗炎症剤、ポジティブコントロールとして使用</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma または同等の</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48% フッ化水素酸</td><td>Sigma または同等の</td><td></td><td>339261 腐食性および急性毒性</td></tr><tr><td>1000 &mu;L シングルチャンネルピペッター</td><td>レイニンまたは同等</td>品 <td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L シングルチャンネルピペッター</td><td>レイニンまたは同等</td>品 <td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L シングルチャンネルピペッター</td><td>レイニンまたは同等</td>品 <td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu;L 12チャンネルピペッター</td><td>レイニンまたは同等</td><td>品 17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L 12チャンネルピペッター</td><td>レイニンまたは同等品</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L 12チャンネルピペッター</td><td>レイニンまたは同等品</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>ピペッターチップ 1000 &mu;L</td><td>レイニンまたは同等</td><td>品 17002920</td><td></td></tr><tr><td>ピペッターチップ 200 &mu;L</td><td>レイニンまたは同等の</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>ピペッターチップ20 &mu;L</td><td>レイニンまたは同等</td><td>品</td> 化学ドラフト 17002928 <td></td></tr><tr><td></td><td>ジェームズタウン メタルプロダクツ</td><td></td> MHCO_229 <td></td></tr><tr><td>384ウェルサンプル保存プレート</td><td>サーモまたは同等の</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマまたは同等の</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>サーモまたは同等品</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 50mL</td><td>コーニングまたは同等品</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 25 mL</td><td>コーニングまたは同等品</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 10 mL</td><td>コーニングまたは同等品</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 5 mL</td><td>コーニングまたは同等品</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC 不死化ヒト角膜上皮細胞</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>これらの細胞は市販されていませんが、記事「</td></tr><tr><td>Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore」または同等の</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td><td>Affymetrix または同等の</td><td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24- and 96-array plates</td><td>Affymetrix または同等の Affymetrix または同等の Afymetrix 901257</td><td>; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger の記事で引用されている研究者から入手できます。チューブ HF</td><td>Draegerまたは同等の</td><td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>Draegger チューブ CP</td><td>Draeger または同等の</td><td>8103421</td><td></td></tr><tr><td>Draegger ポンプ</td><td>Draeger または同等の</td><td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>クリア プレート シール</td><td>Resesarch Products International または同等の</td><td>202502</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>VistaLab Technologies または同等の</td><td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBSまたは同等の</td><td>N/A</td><td>Excelアドインを自動カーブフィットに使用</td></tr></tbody></table>

クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット sirna スクリーニング

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持。トリートメントや露出の世話をする治療薬を開発する努力をこれらの傷害の分子・細胞メカニズムを理解する重要なことです。提案する高スループット小さな抑制 RNA (siRNA) スクリーニングの利用がより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を明らかにすることができる重要なツールをすることができます。siRNA は、二本鎖 RNA 分子長 19-25 のヌクレオチドと転写後サイレンシング mRNA を低下させる経路を利用、siRNA に相同性があります。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。開発と検証暴露モデルの in vitroのハイスループットス クリーニング (HTS) フッ化水素 (HF) とクロルピクリン (CP) による眼損傷のための方法は、この記事で掲載されています。我々 はこれらの 2 つの有効成分を選択、私たちの方法は、毒性物質の曝露プロトコルに変更を加える他の有効成分の研究に適用されます。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞生存率及び il-8 産生は、スクリーニングのプロトコルのエンドポイントとして選択されました。毒性物質の暴露の開発に関連付けられているいくつかの課題、高温超伝導の研究に適した培養技術が表示されます。これらの毒性の高温超伝導モデルの確立化学眼傷害のための潜在的な治療のメカニズムやけがの画面を理解するそれ以上の調査が可能です。

露光法の開発
私たちは洗練され、ひと角膜上皮細胞線 SV40 HCEC 高温超伝導の研究で使用するための適合性を評価します。SV40 HCEC SV 40 大 T 抗原を用いた不死化された層から発掘 Pal23からの贈り物だった.簡潔にここに提示する露出方法論開発の検討も多くの変数があった、だから、信じて我々 の調査結果のいくつかのサンプルはより広範に適用される可能性がありますだけに複数の有害物質が表示されます。
スパイクまたは媒体の交換によって毒性物質の暴露
我々 は当初媒体最終曝露濃度を達成するために 96 ウ...

高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット スクリーニング法の妥当性を提案します。

クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

このビデオでは、トキシカント損傷の角膜上皮細胞モデルにおけるハイスループットsiRNAスクリーニングの方法を紹介しています。ハイスループットsiRNAスクリーニングは、毒物に対する細胞応答の経路と調節因子を解明するための費用対効果と時間効率の高い方法であるため、この研究は重要です。この研究は、角膜が毒物の傷害にどのように反応するかについての理解を深めるのに役立つ可能性があります。使い捨て培地ボトルに1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのヒドロコルチゾンを含む予熱培地に角膜上皮細胞の懸濁液を調製します。ボトルを渦巻かせて細胞を均一に懸濁させ、自動リキッドハンドラーのオービタルシェーカーネスト上のリザーバーに注ぎます。セルプレーティングプロセス中は、セル懸濁液を37度の加温プレートに保持します。自動リキッドハンドラーを使用して、96ウェルプレート上のウェルあたり70マイクロリットルの培地で、ウェルあたり1,000個の細胞の密度でプレートに細胞を添加します。研究するすべてのsiRNAライブラリープレートについて、最低14枚の96ウェルプレートに細胞をシードします。播種プロセス中は、オービタルシェーカーを毎分100サイクルで常に運転し、すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用します。最初のプレートを播種する前に、自動リキッドハンドラーを使用して細胞懸濁液を混合します。140マイクロリットルの細胞懸濁液を吸引し、70マイクロリットルを2つの細胞培養プレートの各ウェルに分注します。すべてのプレートに細胞が播種されるまで、混合と分注を繰り返します。必要に応じて細胞懸濁液リザーバーを補充します。プレートを播種した後、リキッドハンドラーからプレートを取り出し、室温で30分間インキュベートします。その後、細胞培養インキュベーターに移します。翌朝、細胞培養インキュベーターに収容された自動イメージングシステムを使用して、すべてのプレートの細胞密度を評価します。内部ウェルが15%から22%のコンフルエントでないプレートを研究から除外します。播種後24時間後に、siRNAのウェルあたり4ピコモル、トランスフェクション試薬のウェルあたり0.3マイクロリットルで、次のように細胞をトランスフェクションします。ベンダーからsiRNAライブラリープレートを入手し、1列目と12列目が空のままで、プレートあたり80のsiRNAターゲットを含むように構成されています。siRNAライブラリープレートをsiRNAバッファーでメーカーの指示に従って再構成し、siRNAの各ウェルについて1マイクロリットルあたり2ピコモルの最終濃度にします。すべてのステップで、自動リキッドハンドラーと毎秒25マイクロリットルのピペッティング速度を使用して、すべてのトランスフェクションを実行します。事前に設定されたチップボックスを使用して、トランスフェクションするウェルのみに対応します。ライブラリプレートの上半分を使用して、トッププレートセットと呼ばれる6つのレプリケートプレートのセットをトランスフェクションします」ライブラリプレートの下半分を使用して、ボトムプレートセットと呼ばれる6つのレプリカプレートの異なるセットをトランスフェクションします。一緒に、12枚のプレートはフルプレートセットを構成し、 また、各セルプレートには同じコントロールセットが含まれています。すべてのトッププレートとボトムプレートセットにライブラリーsiRNAをトランスフェクションした後、ネガティブプールsiRNAを持つすべてのプレートのウェルB2からB6にトランスフェクションします。また、ネガティブプールsiRNAを持つライブラリーsiRNAを受け取らない別の2つのプレートのウェルB2からB6にトランスフェクションします。これらは、公開されていないコントロールとして機能します。トランスフェクションミックスを添加した後、すべての細胞プレートを細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートし、1時間ごとに穏やかに軽くたたいて混合します。自動リキッドハンドラーを使用して、事前に温めた培地でプレートを2回洗浄し、PBSで1〜5回希釈し、十分に温めた培地ごとに100マイクロリットルを再供給します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。ウェルC2からC6を非トランスフェクションコントロールとして使用します。ウェル B7 から B11 および C7 から C11 はトランスフェクションせず、毒物曝露の薬物およびビヒクル制御として使用してください。トランスフェクションの 24 時間後、自動リキッドハンドラーを使用してプレートを再供給します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。各井戸から100マイクロリットルを吸引し、それを廃棄物貯留層に捨てます。各ウェルに100マイクロリットルをウェルごとに再供給し、予め温めたH-Cort.medium。必要に応じて、廃棄物リザーバーを空にします。必要に応じて、リザーバーに培地を補充します。トランスフェクションの2日後、曝露の2時間前に、H-Cortでポジティブコントロールカルダモニンの62.5マイクロモル溶液を調製します。培地、8列希釈リザーバーの列Bに加えます。H-Cort.meduimにDMSOの06.25%溶液を調製し、同じリザーバーのC列に加えます。車両制御にはDMSOが使用されています。自動リキッドハンドラーを使用して、各セルプレートのウェルB7からB11およびC7からC11から10マイクロリットルの培地を取り出し、リザーバーの列GとHに廃棄します。ポジティブコントロールとビヒクルコントロールを受けるウェルのみに対応するように、あらかじめ設定されたチップボックスを使用し、すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。10マイクロリットルのポジティブコントロールとビヒクルコントロールをそれらのウェルに移し、3回混合します。これらの細胞プレートをインキュベーターに戻します。すべての追加の細胞プレートについて、これらの手順を繰り返します。すべての化学物質曝露操作は、二重ニトリル手袋、実験室用コート、使い捨てポリエチレンスリーブプロテクター、および安全メガネを着用し、化学物質ヒュームフードで行ってください。フッ化水素酸と接触したピペットチップとリザーバー、および液体フッ化水素酸を2.5%グルコン酸カルシウムで除染してから、有害廃棄物の流れに廃棄してください。調査中の各ライブラリープレートについて、予熱したH-Cortの80ミリリットルに288マイクロリットルの1%フッ化水素酸を加えて、0.0036%のフッ化水素酸培地溶液を調製します。150ミリリットルのボトルに入ったミディアム。ボトルを渦巻かせ、希フッ化水素酸を化学フュームフード内の37度のインキュベーターで10分間インキュベートします。フッ化水素酸培地溶液をプレートウォーマー上の試薬リザーバーに加えます。2人の技術者が協力して露光を行います。右側の技術者に、12チャンネルピペッターを使用して細胞プレートから細胞培養培地を取り出してもらい、プレートを左側の技術者に渡します。左の技術者に、フッ化水素酸培地溶液のウェルあたり100マイクロリットルを追加してもらいます。毒物にさらされるすべての細胞プレートについて、このプロセスを繰り返します。また、非露光コントロールプレートについても、フッ化水素酸溶液の代わりに新鮮な培地を使用してこのプロセスを繰り返します。プレートをケミカルヒュームフードインキュベーターに20分間置いた後、細胞培養インキュベーターに戻します。前に示すように、すべてのプレートを露光して細胞培養インキュベーターに戻した後、ポジティブコントロールの添加ステップを繰り返します。細胞培養上清を採取し、曝露後24時間でMTTアッセイを用いて細胞生存率を評価します。10グラム/リットルのグルコースを含むPBSに0.5ミリグラム/ミリグラムのMTT基質の溶液を調製し、37度に温めます。MTT基質溶液を自動リキッドハンドラーのリザーバーに加えます。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。チップボックスは、アッセイするウェルのみに対応するように事前設定してください。自動リキッドハンドラーを使用して、セルプレートの内側の60ウェルから95マイクロリットルの培地を吸引し、2つの384ウェル貯蔵プレートのそれぞれに42.5マイクロリットルを沈着させます。直ちにMTT基質溶液のウェルあたり100マイクロリットルを細胞プレートに加え、細胞培養インキュベーターで37度で1時間インキュベートします。384ウェル保存プレートを密封し、その後の分析のためにマイナス80度で保管します。すべての上部プレートと下部プレートのセット、および関連する未公開のコントロールに対して、このプロセスを繰り返します。必要に応じて、MTT基板リザーバーを補充します。必要に応じて、繰り返し間でチップを再利用しますが、MTT基質溶液を追加するときやプレートセットを切り替えるときは、チップを洗浄してください。1時間のインキュベーション後、自動リキッドハンドラーを使用して、各細胞培養プレートの内側60ウェルからMTT基質溶液を取り出し、DMSOのウェルあたり100マイクロリットルと交換します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用し、分析するウェルのみに対応するようにチップボックスを事前設定してください。廃棄物リザーバーを空にし、必要に応じてDMSOリザーバーを補充します。プレートシェーカーでプレートを3分間振ってください。プレート分光光度計を使用して、570ナノメートルと690ナノメートルで吸光度を測定します。570ナノメートルの吸光度から690ナノメートルのバックグラウンド吸光度を差し引き、未露光プレート上の各対照群の値を平均化します。各ターゲットの吸光度値を、非露光コントロールの平均吸光度値で割ることにより、生存率を計算します。平均非曝露ネガティブプールを使用して、すべてのターゲットの細胞生存率を計算します。細胞培養上清中のIL-8の濃度を、メーカーの指示に従って、洗浄不要のビーズベースのアッセイで測定します。サンプルと標準に対応するアッセイプレートレイアウトを作成します。マイナス80度の冷凍庫から384ウェル保存プレートを取り出し、室温で解凍します。プレートを短時間遠心分離して、ウェルの底にサンプルを回収します。抗IL-8アクセプタービーズとビオチン化抗体を黒色の384ウェル保存プレートに加えます。ビーズ抗体混合物を、アッセイプレートのレイアウトに従って、サンプルおよび標準曲線用に指定されたウェルに加えます。354 マイクロモルの塩化ナトリウムを含む培地で標準を再構成します。標準曲線の2倍の連続希釈を行い、別の黒色の384ウェル保存プレートに3倍加えます。自動リキッドハンドラーを使用してアッセイを実施します。事前に設定されたチップボックスを使用して、アッセイプレートのレイアウトに従ってウェルをアドレス指定します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。アクセプタービーズ-抗体混合物の8マイクロリットルを白色の384ウェル浅井戸アッセイプレートに移します。ビーズ-抗体混合物を、アッセイプレートのレイアウトに従って、サンプルおよび標準曲線用に指定されたウェルに加えます。次に、標準曲線を浅いウェルアッセイプレート上の適切なウェルに移します。次に、浅い貯留層に3.54モルの塩化ナトリウム溶液を準備します。4.5マイクロリットルの塩化ナトリウム溶液を黒色の384ウェル保存プレート内のサンプルに移すことにより、サンプルの塩濃度を標準曲線の塩濃度と一致するように調整します。30マイクロリットルの混合容量を使用してサンプルを3回混合し、次にアッセイプレートのレイアウトに従って、サンプルの2マイクロリットルを白い浅いウェルアッセイプレートに移します。室温で暗所で1時間インキュベートします。黒色の384ウェル保存プレートにセカンダリービーズを添加します。サンプル用に指定されたウェルにビーズを添加し、アッセイプレートのレイアウトに従って標準曲線を採取します。10マイクロリットルの二次ビーズを、アッセイプレートのレイアウトに従って標準曲線またはサンプルを受け取る白い384ウェル浅井戸アッセイプレートのウェルに移します。各プレートの間の先端を洗います。室温で暗闇の中でさらに1時間インキュベートします。アッセイプレートを透明なプレートシールで密封し、ビーズベースのアッセイと互換性のあるプレートリーダーを使用してスキャンします。プレートと検出器の間の距離は0.2ミリメートル、スキャンには180ミリ秒の励起時間、測定時間は550ミリ秒を使用します。IL-8 アッセイの生データをスプレッドシートにインポートします。IL-8アッセイの標準曲線に自動カーブフィッティングを使用し、生データを各サンプルのミリリットルあたりのピコグラムに変換します。各ターゲットの 6 回の反復の平均を計算します。次に、SSMD 値を計算し、露出したネガティブ コントロールに対して変化を折り重ねます。データをデュアル懐中電灯プロットで表示し、各ターゲットの x 軸に沿った折り畳み変化と y 軸に沿った SSMD の変化を示します。結論として、毒物による眼の損傷のハイスループットスクリーニング研究に適した方法と培養条件を開発しました。私たちは、フッ化水素酸損傷のモデルでsiRNAライブラリーの一次スクリーニングを完了することにより、これらの方法の有用性を証明しました。ハイスループットのゲノムデータセットは、特定の遺伝子が損傷や疾患に果たす役割の理解に大きく貢献し、in vitroまたはin vivoでの追加研究に効率的に焦点を合わせるのに役立ちます。

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、レサズリンベースのアラマーブルー溶液を使用して、角膜上皮細胞の細胞代謝活性に対する人工涙液製剤の影響を評価するためのin...

alamarBlue Assay:人工涙液製剤がヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす細胞毒性効果をスクリーニングするための高感度蛍光測定法

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

我々は、3次元再構成人間の角膜のような上皮（RHCE）組織モデルを利用した眼刺激性試験を開発しました。テストは、眼刺激性及び腐食性物質（GHSカテゴリー1と組み合わせた2）とラベル（GHSなしカテゴリ）を必要としないものとを区別することができます。...

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

この研究の目的は、インピーダンスベースのリアルタイム細胞分析装置とin...

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

ここでは、角膜上皮創傷治癒中のHSP27の機能を評価するために、熱ショックタンパク質27(HSP27)特異的な低分子干渉RNAを使用するプロトコルを提示します。RNA干渉は、さまざまな細胞タイプのタンパク質機能を調べるために、遺伝子発現を効果的にノックダウンするための最良の方法です。...

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。...

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

このプロトコルは、マウスの眼表面細胞からの活性一次培養における活性酸素種(ROS)、生細胞、および死細胞の同時検出を実証する。2',7'-ジクロロフルオレセインセテート、ヨウ化プロピジウム、ヘーチスト染色を用いてROS、死細胞、生細胞をそれぞれ評価し、続いてイメージングと分析を行います。...

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

この記事では、初代および不死化細胞株でのUV放射および化学毒素の毒性を評価するために使用される手順について説明します。...

初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

このプロトコルはハイスループットのスクリーニングのアプローチを使用して蛍光性の染料の調査としてdihydroethidium...

ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

学ぶ高スループットSiRNAスクリーニングを用いた角膜上皮細胞の毒性物質傷害モデル。フッ化水素とクロルピクリンによる傷害メカニズムを解明し、眼の化学物質応答理解と治療戦略開発に貢献します。

クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

さらに動画を探す