クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

このビデオでは、トキシカント損傷の角膜上皮細胞モデルにおけるハイスループットsiRNAスクリーニングの方法を紹介しています。ハイスループットsiRNAスクリーニングは、毒物に対する細胞応答の経路と調節因子を解明するための費用対効果と時間効率の高い方法であるため、この研究は重要です。この研究は、角膜が毒物の傷害にどのように反応するかについての理解を深めるのに役立つ可能性があります。

使い捨て培地ボトルに1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのヒドロコルチゾンを含む予熱培地に角膜上皮細胞の懸濁液を調製します。ボトルを渦巻かせて細胞を均一に懸濁させ、自動リキッドハンドラーのオービタルシェーカーネスト上のリザーバーに注ぎます。セルプレーティングプロセス中は、セル懸濁液を37度の加温プレートに保持します。

自動リキッドハンドラーを使用して、96ウェルプレート上のウェルあたり70マイクロリットルの培地で、ウェルあたり1,000個の細胞の密度でプレートに細胞を添加します。研究するすべてのsiRNAライブラリープレートについて、最低14枚の96ウェルプレートに細胞をシードします。播種プロセス中は、オービタルシェーカーを毎分100サイクルで常に運転し、すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用します。

最初のプレートを播種する前に、自動リキッドハンドラーを使用して細胞懸濁液を混合します。140マイクロリットルの細胞懸濁液を吸引し、70マイクロリットルを2つの細胞培養プレートの各ウェルに分注します。すべてのプレートに細胞が播種されるまで、混合と分注を繰り返します。

必要に応じて細胞懸濁液リザーバーを補充します。プレートを播種した後、リキッドハンドラーからプレートを取り出し、室温で30分間インキュベートします。その後、細胞培養インキュベーターに移します。

翌朝、細胞培養インキュベーターに収容された自動イメージングシステムを使用して、すべてのプレートの細胞密度を評価します。内部ウェルが15%から22%のコンフルエントでないプレートを研究から除外します。播種後24時間後に、siRNAのウェルあたり4ピコモル、トランスフェクション試薬のウェルあたり0.3マイクロリットルで、次のように細胞をトランスフェクションします。

ベンダーからsiRNAライブラリープレートを入手し、1列目と12列目が空のままで、プレートあたり80のsiRNAターゲットを含むように構成されています。siRNAライブラリープレートをsiRNAバッファーでメーカーの指示に従って再構成し、siRNAの各ウェルについて1マイクロリットルあたり2ピコモルの最終濃度にします。すべてのステップで、自動リキッドハンドラーと毎秒25マイクロリットルのピペッティング速度を使用して、すべてのトランスフェクションを実行します。

事前に設定されたチップボックスを使用して、トランスフェクションするウェルのみに対応します。ライブラリプレートの上半分を使用して、トッププレートセットと呼ばれる6つのレプリケートプレートのセットをトランスフェクションします」ライブラリプレートの下半分を使用して、ボトムプレートセットと呼ばれる6つのレプリカプレートの異なるセットをトランスフェクションします。一緒に、12枚のプレートはフルプレートセットを構成し、 また、各セルプレートには同じコントロールセットが含まれています。すべてのトッププレートとボトムプレートセットにライブラリーsiRNAをトランスフェクションした後、ネガティブプールsiRNAを持つすべてのプレートのウェルB2からB6にトランスフェクションします。

また、ネガティブプールsiRNAを持つライブラリーsiRNAを受け取らない別の2つのプレートのウェルB2からB6にトランスフェクションします。これらは、公開されていないコントロールとして機能します。トランスフェクションミックスを添加した後、すべての細胞プレートを細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートし、1時間ごとに穏やかに軽くたたいて混合します。

自動リキッドハンドラーを使用して、事前に温めた培地でプレートを2回洗浄し、PBSで1〜5回希釈し、十分に温めた培地ごとに100マイクロリットルを再供給します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。ウェルC2からC6を非トランスフェクションコントロールとして使用します。

ウェル B7 から B11 および C7 から C11 はトランスフェクションせず、毒物曝露の薬物およびビヒクル制御として使用してください。トランスフェクションの 24 時間後、自動リキッドハンドラーを使用してプレートを再供給します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。

各井戸から100マイクロリットルを吸引し、それを廃棄物貯留層に捨てます。各ウェルに100マイクロリットルをウェルごとに再供給し、予め温めたH-Cort.medium。必要に応じて、廃棄物リザーバーを空にします。

必要に応じて、リザーバーに培地を補充します。トランスフェクションの2日後、曝露の2時間前に、H-Cortでポジティブコントロールカルダモニンの62.5マイクロモル溶液を調製します。培地、8列希釈リザーバーの列Bに加えます。

H-Cort.meduimにDMSOの06.25%溶液を調製し、同じリザーバーのC列に加えます。車両制御にはDMSOが使用されています。

自動リキッドハンドラーを使用して、各セルプレートのウェルB7からB11およびC7からC11から10マイクロリットルの培地を取り出し、リザーバーの列GとHに廃棄します。ポジティブコントロールとビヒクルコントロールを受けるウェルのみに対応するように、あらかじめ設定されたチップボックスを使用し、すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。10マイクロリットルのポジティブコントロールとビヒクルコントロールをそれらのウェルに移し、3回混合します。

これらの細胞プレートをインキュベーターに戻します。すべての追加の細胞プレートについて、これらの手順を繰り返します。すべての化学物質曝露操作は、二重ニトリル手袋、実験室用コート、使い捨てポリエチレンスリーブプロテクター、および安全メガネを着用し、化学物質ヒュームフードで行ってください。

フッ化水素酸と接触したピペットチップとリザーバー、および液体フッ化水素酸を2.5%グルコン酸カルシウムで除染してから、有害廃棄物の流れに廃棄してください。調査中の各ライブラリープレートについて、予熱したH-Cortの80ミリリットルに288マイクロリットルの1%フッ化水素酸を加えて、0.0036%のフッ化水素酸培地溶液を調製します。150ミリリットルのボトルに入ったミディアム。

ボトルを渦巻かせ、希フッ化水素酸を化学フュームフード内の37度のインキュベーターで10分間インキュベートします。フッ化水素酸培地溶液をプレートウォーマー上の試薬リザーバーに加えます。2人の技術者が協力して露光を行います。

右側の技術者に、12チャンネルピペッターを使用して細胞プレートから細胞培養培地を取り出してもらい、プレートを左側の技術者に渡します。左の技術者に、フッ化水素酸培地溶液のウェルあたり100マイクロリットルを追加してもらいます。毒物にさらされるすべての細胞プレートについて、このプロセスを繰り返します。

また、非露光コントロールプレートについても、フッ化水素酸溶液の代わりに新鮮な培地を使用してこのプロセスを繰り返します。プレートをケミカルヒュームフードインキュベーターに20分間置いた後、細胞培養インキュベーターに戻します。前に示すように、すべてのプレートを露光して細胞培養インキュベーターに戻した後、ポジティブコントロールの添加ステップを繰り返します。

細胞培養上清を採取し、曝露後24時間でMTTアッセイを用いて細胞生存率を評価します。10グラム/リットルのグルコースを含むPBSに0.5ミリグラム/ミリグラムのMTT基質の溶液を調製し、37度に温めます。MTT基質溶液を自動リキッドハンドラーのリザーバーに加えます。

すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。チップボックスは、アッセイするウェルのみに対応するように事前設定してください。自動リキッドハンドラーを使用して、セルプレートの内側の60ウェルから95マイクロリットルの培地を吸引し、2つの384ウェル貯蔵プレートのそれぞれに42.5マイクロリットルを沈着させます。

直ちにMTT基質溶液のウェルあたり100マイクロリットルを細胞プレートに加え、細胞培養インキュベーターで37度で1時間インキュベートします。384ウェル保存プレートを密封し、その後の分析のためにマイナス80度で保管します。すべての上部プレートと下部プレートのセット、および関連する未公開のコントロールに対して、このプロセスを繰り返します。

必要に応じて、MTT基板リザーバーを補充します。必要に応じて、繰り返し間でチップを再利用しますが、MTT基質溶液を追加するときやプレートセットを切り替えるときは、チップを洗浄してください。1時間のインキュベーション後、自動リキッドハンドラーを使用して、各細胞培養プレートの内側60ウェルからMTT基質溶液を取り出し、DMSOのウェルあたり100マイクロリットルと交換します。

すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用し、分析するウェルのみに対応するようにチップボックスを事前設定してください。廃棄物リザーバーを空にし、必要に応じてDMSOリザーバーを補充します。プレートシェーカーでプレートを3分間振ってください。

プレート分光光度計を使用して、570ナノメートルと690ナノメートルで吸光度を測定します。570ナノメートルの吸光度から690ナノメートルのバックグラウンド吸光度を差し引き、未露光プレート上の各対照群の値を平均化します。各ターゲットの吸光度値を、非露光コントロールの平均吸光度値で割ることにより、生存率を計算します。

平均非曝露ネガティブプールを使用して、すべてのターゲットの細胞生存率を計算します。細胞培養上清中のIL-8の濃度を、メーカーの指示に従って、洗浄不要のビーズベースのアッセイで測定します。サンプルと標準に対応するアッセイプレートレイアウトを作成します。

マイナス80度の冷凍庫から384ウェル保存プレートを取り出し、室温で解凍します。プレートを短時間遠心分離して、ウェルの底にサンプルを回収します。抗IL-8アクセプタービーズとビオチン化抗体を黒色の384ウェル保存プレートに加えます。

ビーズ抗体混合物を、アッセイプレートのレイアウトに従って、サンプルおよび標準曲線用に指定されたウェルに加えます。354 マイクロモルの塩化ナトリウムを含む培地で標準を再構成します。標準曲線の2倍の連続希釈を行い、別の黒色の384ウェル保存プレートに3倍加えます。

自動リキッドハンドラーを使用してアッセイを実施します。事前に設定されたチップボックスを使用して、アッセイプレートのレイアウトに従ってウェルをアドレス指定します。すべてのステップで毎秒50マイクロリットルのピペッティング速度を使用してください。

アクセプタービーズ-抗体混合物の8マイクロリットルを白色の384ウェル浅井戸アッセイプレートに移します。ビーズ-抗体混合物を、アッセイプレートのレイアウトに従って、サンプルおよび標準曲線用に指定されたウェルに加えます。次に、標準曲線を浅いウェルアッセイプレート上の適切なウェルに移します。

次に、浅い貯留層に3.54モルの塩化ナトリウム溶液を準備します。4.5マイクロリットルの塩化ナトリウム溶液を黒色の384ウェル保存プレート内のサンプルに移すことにより、サンプルの塩濃度を標準曲線の塩濃度と一致するように調整します。30マイクロリットルの混合容量を使用してサンプルを3回混合し、次にアッセイプレートのレイアウトに従って、サンプルの2マイクロリットルを白い浅いウェルアッセイプレートに移します。

室温で暗所で1時間インキュベートします。黒色の384ウェル保存プレートにセカンダリービーズを添加します。サンプル用に指定されたウェルにビーズを添加し、アッセイプレートのレイアウトに従って標準曲線を採取します。

10マイクロリットルの二次ビーズを、アッセイプレートのレイアウトに従って標準曲線またはサンプルを受け取る白い384ウェル浅井戸アッセイプレートのウェルに移します。各プレートの間の先端を洗います。室温で暗闇の中でさらに1時間インキュベートします。

アッセイプレートを透明なプレートシールで密封し、ビーズベースのアッセイと互換性のあるプレートリーダーを使用してスキャンします。プレートと検出器の間の距離は0.2ミリメートル、スキャンには180ミリ秒の励起時間、測定時間は550ミリ秒を使用します。IL-8 アッセイの生データをスプレッドシートにインポートします。

IL-8アッセイの標準曲線に自動カーブフィッティングを使用し、生データを各サンプルのミリリットルあたりのピコグラムに変換します。各ターゲットの 6 回の反復の平均を計算します。次に、SSMD 値を計算し、露出したネガティブ コントロールに対して変化を折り重ねます。

データをデュアル懐中電灯プロットで表示し、各ターゲットの x 軸に沿った折り畳み変化と y 軸に沿った SSMD の変化を示します。結論として、毒物による眼の損傷のハイスループットスクリーニング研究に適した方法と培養条件を開発しました。私たちは、フッ化水素酸損傷のモデルでsiRNAライブラリーの一次スクリーニングを完了することにより、これらの方法の有用性を証明しました。

ハイスループットのゲノムデータセットは、特定の遺伝子が損傷や疾患に果たす役割の理解に大きく貢献し、in vitroまたはin vivoでの追加研究に効率的に焦点を合わせるのに役立ちます。