GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

この方法は、結腸がん患者に見られる微小転移に関する腫瘍生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスのGFP標識患者由来結腸がんオルガノイドによって誘導された微小転移を高感度に検出できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、マウスの遠隔臓器で結腸腫瘍オルガノイド由来の微小転移を検出するのが難しいため、苦労するでしょう。

岡澤悠氏と一緒に手順を実演するのは、私のグループの博士課程の学生であり外科医である水越浩輔氏と小山悠氏です。ヒト大腸がん細胞オルガノイドを作製するには、まず、氷上の12ウェルプレートにウェルあたり150マイクロリットルの人工細胞外マトリックスを加えます。すべてのウェルをコーティングしたら、プレートを摂氏37度および5%CO2インキュベーターで30〜60分間インキュベートして、ゲルを固化します。

次に、患者由来の腫瘍異種移植細胞ペレットを、5%ウシ胎児血清(FCS)を添加した新鮮な結腸直腸癌オルガノイド培養培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜5個の細胞の濃度を達成し、各人工細胞外マトリックスに1ミリリットルの細胞を播種します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。翌朝、浮遊細胞を含む培養上清を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに慎重に移して遠心分離し、ペレットを70マイクロリットルの新鮮な人工細胞外マトリックスに氷上に再懸濁します。

結腸直腸癌細胞の生存率を高めるには、人工細胞外マトリックスを含む浮遊腫瘍細胞を人工細胞外マトリックスコーティングウェルに再度重ね合わせ、腫瘍細胞培養器で腫瘍細胞培養物を30分間インキュベートします。新しい細胞外マトリックスゲルが固まったら、1%FCSを添加した1ミリリットルの新鮮な結腸直腸癌オルガノイド細胞培養培地を培養物に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。7〜10日間の培養後、滅菌細胞スクレーパーでオルガノイドを機械的に取り外し、オルガノイドを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離します。

次に、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、軽くたたいて別の遠心分離を行います。結腸直腸癌オルガノイドを解離するには、500マイクロリットルのタンパク質分解酵素溶液とコラーゲン分解酵素溶液をチューブに加え、軽くたたいて混ぜます。室温で10分後、1%FBSを添加した500マイクロリットルの培地を細胞に加え、細胞懸濁液を数回非常に穏やかにピペットで動かしてオルガノイドを分解します。

プロセシング中のヒトCRCオルガノイドの穏やかなピペッティングは、培養中の無傷のスフェロイド形成を維持するために重要です。細胞を再度遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルの5X GFPレンチウイルスストックと400マイクロリットルの新鮮な結腸直腸癌オルガノイド培養培地に再懸濁します。ヒトCRCオルガノイドに高力価のGFPレンチウイルスを感染させることは、特にCRCのほぼ100%の感染を達成するために不可欠です。

中濃度の500マイクロリットルあたり5つの解離腫瘍細胞の5倍を達成するために各チューブ内の容量を調整し、実証されたように人工細胞外マトリックスコーティングされた12ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞をプレートします。細胞培養インキュベーターで18時間後、浮遊する細胞含有上清を個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離し、続いてペレットを氷上のチューブあたり70マイクロリットルの人工細胞外マトリックスに再懸濁します。結腸直腸癌細胞の生存率を高めるには、腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを12ウェルプレートの腫瘍オルガノイドに重ね合わせ、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間置きます。

人工細胞外マトリックスコーティングが固まったら、1%FCSを添加した1ミリリットルの新鮮なCRCオルガノイド培養培地を培養物に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに3日間戻します。次に、感染した細胞を蛍光顕微鏡で観察して、ほぼ100%GFP陽性を確認し、さらに4〜6日間細胞をインキュベーターに戻します。CRC患者由来腫瘍異種移植片の自然転移マウスモデルを確立するには、示されているようにGFP標識オルガノイドを解離し、50%の人工細胞外マトリックス濃度を添加したPBSの50マイクロリットルあたり5つの腫瘍細胞に対して、単一の腫瘍細胞懸濁液を10倍に希釈します。

マウス1匹あたり50マイクロリットルの細胞を22ゲージの針を備えた注射器にロードし、腫瘍細胞を氷上に置きます。次に、つま先のつま先つまみに対する反応の欠如を確認し、最初に麻酔をかけたNOGマウスを実験室のベンチの仰臥位に置きます。滅菌ピンセットを使用して、直腸粘膜を肛門からそっと引き出し、すぐに腫瘍細胞を直腸粘膜下組織に注入します。

CRC患者由来腫瘍異種移植片の実験的転移モデルを確立するには、単一腫瘍細胞懸濁液を50マイクロリットルの濃度あたり4倍の10で4細胞に希釈し、マウスあたり50マイクロリットルの細胞を22ゲージ針を備えた注射器にロードします。最初に麻酔をかけたNOGマウスをベンチの腹臥位に置き、左脇腹の下部に小さな切開を行います。滅菌ハサミとピンセットを使用して腹膜を慎重に切り取り、脾臓を露出させ、ピンセットを使用して脾臓に付着した脂肪をつかみます。

その後、50マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと脾臓に注入し、漏れが観察されないように注意します。すべてのマウスを注射し、必要に応じて縫合した後、動物を自宅のケージに戻し、腫瘍細胞送達の1日後に縫合糸の漏出と生存率を確認します。キャリパーを使用して腫瘍を毎週測定し、原発腫瘍と関連組織を適切な実験エンドポイントまで採取します。

解剖した腫瘍と臓器を氷上の10cmシャーレで5ミリリットルの氷冷PBSに移し、解剖した組織を実体蛍光顕微鏡で観察してGFP発現を評価します。GFPレンチウイルスによる大腸がんオルガノイド感染は、実証されているように、ほぼすべてのオルガノイドが非常に明るいGFPを発現する結果となります。GFP標識オルガノイドを二次レシピエントNOGマウスに同所性および脾腔内に注射すると、同所性部位および注射後2.5か月で検査した大多数のマウスの肺にGFP陽性の原発腫瘍が形成されていることが明らかになりました。

さらに、脾腔内注射の1か月後にレシピエントNOG動物に肝転移が観察されます。このビデオを見れば、GFP標識ヒト結腸直腸がん細胞オルガノイドをレシピエントマウスに導入した後、その微小転移を検出する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、マウスのヒト結腸がん細胞オルガノイドの腫瘍および転移ホーミング効率が、元の腫瘍細胞の患者間変動性に大きく依存することを覚えておくことが重要です。