Name: GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶGFPレンチウイルス導入法による患者由来大腸がんオルガノイドの作製と微小転移の高感度検出技術。この手法はin vivoでの腫瘍生物学研究に有用です。

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この作品、順天堂大学若手研究者賞 (2013、2014、2015) y. o.、K. M. に共同プロジェクト受賞 (2013、2014) によって支えられた、教育省、文化、スポーツ、科学研究のための援助を与えると技術、日本 (Y ・ K に 16 K 15625 と m. g. に 16 K 15598)。特に有益な議論と技術サポート Coloproctological 外科、分子病理のすべてのメンバーに感謝しています。我々 はまたマウスと Dr に同所性同種移植の手術の技術ガイダンスについて寛大な今野弘之博士 (浜松大学医学部) と博士秀樹北島 (国際医療大学・福祉) をありがとうございます。孝カバ (千葉県がんセンター)、腫瘍培養の実行に関する技術的なアドバイスをします。

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著者はある潜在的な利益相反を開示します。

原発腫瘍の成長を研究する CRC PDX モデルが広く採用されているがこのモデルがまた腫瘍の転移を調査対象かどうかはまだ解明されていない完全に。自発転移は肝臓や肺の様々 な報告された PDX コロン モデル4,10でかろうじて検出可能も。微小を高感度に検出、PDX 派生 CRC オルガノイドの同所性同種および受信者マウスに静脈注射する前に GFP レンチ ウイルス粒子を伝達するためのプロトコルを開発しました。注記のうち、ことができましたこのメソッドにより、CRC organoid 由来微小の高感度検出を遠く離れた臓器に自発的に実験的に、両方を加工します。
Passaging シリーズの間に CRC オルガノイドを軽くピペッティングしてアノイーキス人工細胞外マトリックスへの誘導することがなくそのままスフェロイドの形成を維持するプロトコルの中で重要なステップが含まれます。遠心によって濃縮高価レンチ ウイルス粒子の調製もほぼ 100 %gfp 陽性の CRC organo...

大腸がん (CRC) は、がん死亡世界中1の 2 番目の主要な原因です。進行期疾患患者の慣習的な療法への不十分な応答では、Crc を根本的に治すための試みの非効率を示します。効果的な治療法を開発し、様々 な臨床癌のマウスモデル Crc の特徴を模倣するが設けられています。各種 CRC 細胞株は、その利便性と操作の容易さのため腫瘍異種移植片を生成するため広く使用されています。癌細胞の長期培養ただし、多くの場合それによって信頼性の低い成果と臨床薬で重要な制限の結果が特定のカルチャ条件下ではかなり増殖、一意のセルの人口の選択は、します。開発。
生体外で培養されることがなく患者由来腫瘍異種移植片 (PDXs) は患者2,3,4から解剖学的生体 CRC の動物モデルへの注入によっても生成されています。PDXs は、主要な病理組織学的特徴を概説として広く認識されて、遺伝子変異はもともと由来されていた患者の腫瘍の存在します。また、患者由来の腫瘍オルガノイド クラスターは密接に元の腫瘍5,6の生物学的特性を模倣する 3 D の条件の下で文化によって確立された腫瘍細胞から成り立っています。これらの腫瘍 organoids も高スループットの薬剤のスクリーニング、により設計された5パーソナライズされた治療法適用。ただし、著しく異種 CRC 集団が腫瘍内に存在すると見なされます質量。特定 CRC 集団が選択的に増殖し、PDX と腫瘍オルガノイドの通路の生体内および生体外でのシリーズの間にそれぞれ展開します。これもできる全体的な遺伝子発現プロファイルと変更は、影響を受ける Crc のエピ/遺伝的状態により親の crc 値が最小の類似に 。
患者由来 CRC organoids と非癌性のひと大腸発癌性突然変異の組み合わせは、ひと腫瘍細胞の浸潤・転移の特徴を調査するため採用されている港に設計から抽出したもの6,7,8,9。ただし、自然転移を生じた患者由来の CRC の同所性同種移植免疫不全マウスの非常に低い発生率困難になっているを含む転移の翼列の多段階の過程を研究するローカル侵略、intravasation、血流、血管外漏出および遠隔臓器4,10の植民地化で輸送。微小転移として 2 mm の腫瘍細胞の沈着によって表される、CRC オルガノイドの患者由来によって形成される、セクション マウスの実験モデルで影響を受ける臓器からの病理組織学的解析でしばしば見過ごされています。自発的な微小の可視化もされている最小限生体内で効率的に受信者のマウスに注入する前に腫瘍における細胞に蛍光マーカーを導入の難しさのため。本研究で我々 プロトコルを開発した受信者マウスへの注入の前に 3 D 培養 PDX 派生 CRC 器官毛細細胞に GFP のレンチ ウイルスを効率的に変換し、高感度検出のステレオ蛍光顕微鏡を用いた、異なるフォームの微小器官の植民地化。

<table><tbody><tr><td>NOD/Shi-scid IL2R&gamma; null (NOG) mice</td><td>The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan</td><td></td><td>Breed 6-week-old 雄マウスを無菌および特定の病原体を含まない条件下で</td></tr>繁殖させる <tr><td>Wound Clips 2&times;10mm</td><td>夏目製作所、日本</td> <td>#C-21-S</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ 針サイズ:22ゲージ</td><td>東京科学、日本</td><td></td><td>70%アルコールと滅菌PBSで消毒します。</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>BMBio</td><td>#92006</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>BMBio</td><td>#92412</td><td></td></tr><tr><td>15mlコニカルチューブ</td><td>住友ベークライト</td><td>MS-57150</td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>住友ベークライト</td><td>MS-57500</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>#0030120086</td><td>使用前オートクレーブ</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Erma</td><td>#03-202-1</td><td></td></tr><tr><td>40μ;m細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>Corning</td><td>#354234</td><td>-20°C. でアリキュープトを保管する 使用するまで氷の上に置く</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ1型</td>シ<td>グ</td><td>マ #C1030</td><td>150mg/mlコラゲナーゼ1型を1回で使用まで。PBSの。-20°Cでアリコートを保管します。C 最長 1 年間の</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovate Cell Technologies</td> <td>#5V2623A</td><td>4°C で保存します。</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&trade;</td><td>Gibco</td><td>#10565018</td><td>4°Cで保管; 37°Cで暖かい;C 使用前の</td></tr><tr><td>C Cell banker 1plus</td><td>ZENOAQ</td><td>#628</td><td>4°Cで保存 1ヶ月以内に使用</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Gibco</td><td>#15140122</td><td>4°Cで保存 1ヶ月以内に使用</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>#15140122</td><td>4°Cで保存 1ヶ月以内に使用</td></tr><tr><td>hEGF</td><td>PEPROTECH</td> <td>#AF-100-15</td><td>-20°Cで保存 使用日</td></tr><tr><td>と同日に培地に加えるY27632、ROCK阻害剤</td><td>Wako</td><td>#253-00591</td><td>-20°Cで保管 使用と同じ日に><培地に追加</td></tr><tr><td>培養培地</td><td>Gibco</td><td></td><td>DMEM / F-12 with GlutaMAX&trade; 5% FBS、100 U / mlペニシリン、100 &microを補充したサプリメント;g/ml streptomycin. 4°Cで保存 1ヶ月以内にご使用ください。</td></tr><tr><td>CRCオルガノイド培養培地 、1%または5%FCS</td><td></td><td></td><td>DMEM/F-12、GlutaMAX&trade;サプリメント(Gibco #10565018)に1%または5%FCS、100 U/mlペニシリン、100 &microを添加。g / mlストレプトマイシン、2 ng / mlhEGFおよび10 &micro;M Y27632, a ROCK inhibitor. 4°Cで保存 1ヶ月以内に使用してください。</td></tr><tr><td>FuGENE 6トランスフェクションリージェント</td><td>Roche</td><td>11814 443001</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.45 &micro;m フィルター</td><td>ザルトリウス ステディム</td><td>17598-K</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ポリプロピレン遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>PRRL-GFP ベクター</td><td>ロバート・A・ワインバーグ</td><td></td><td></td>博士からの贈り物</tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>ロバート・A・ワインバーグ</td><td></td><td></td>博士からの贈り物</tr><tr><td>pCMV-dR8.2 dvpr</td><td>ロバート・A・ワインバーグ</td><td></td><td></td>博士からの贈り物</tr><tr><td>SW55Ti スイングバケットローター</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a Zeiss Axioplan 2 実体蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gfp レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

ひと大腸癌 (CRC) 治療の現在の進歩、にもかかわらずいくつかの根本的な治療法は、CRC の後期段階の効果的です。前臨床モデルとして老舗ひと癌細胞および腫瘍モデルが開発されている多くのトランスジェニック マウスを用いた腫瘍異種移植マウス モデルこの臨床の課題を克服。彼らは人間の癌の特徴を部分的に模倣が、ひと悪性腫瘍の浸潤・転移などの重要な側面を要約する失敗多くの場合。したがってより良い人間の crc の悪性進展を表す代替モデルが待望の。
本患者の解剖学的 CRC 小片の皮下注入による患者由来腫瘍異種移植片 (PDXs) の生成を紹介します。PDXs が開発し、病理組織学的患者に CRC のようなコロン。ただし、いくつかの自発的な微小は PDX モデルで影響を受ける臓器の断面を従来の検出です。遠隔臓器に転移普及の検出を容易にする文化でコロン PDXs から腫瘍における細胞を抽出し、高度免疫不全の合図/市-scid IL2Rγ への注入前に GFP レンチを使って感染null(NOG) マウス。注入がん PDX 派生 CRC 器官毛細細胞一貫してフォーム原発腫瘍陽性 GFP の受信者マウスで。また、gfp の植民地、特に蛍光顕微鏡による検出これらのマウスの肺に微小転移を自発的に開発。また、CRC オルガノイドの脾内注入はよく肝植民地化を生成します。一緒に取られて、これらの調査結果は、マルチ ステップ プロセス中に視覚的に検出する CRC の PDX の派生器官毛細細胞を GFP 標識呼ぶ転移カスケードを示します。記述されていたプロトコルには、人間の CRC の PDXs と GFP レンチ ウイルス粒子によって導入対応する CRC 器官毛細細胞の三次元培養の確立が含まれます。

中分化と診断された大腸癌は、TNM 分類、ステージ IIIa、術後化学療法で 76 歳女性から外科切除されていた。プライマリ CRC 細胞免疫組織化学的染色陽性癌胎児性抗原、Ki 67、汎サイトケラチン、E-カドヘリン。腫瘍の部分はまた皮下コロン PDX モデルを生成する NOG マウスに移植されました。CRC 器官毛細細胞はこれらのマウスの皮下に成長したコロン PDX から培養し抽出されました。CRC organoids 一貫して人工細胞外マトリックスへの通路のシリーズの間に多細胞のクラスターの形成が可能であった。感度が高い CRC 器官毛細細胞の生体内で検出できるマウス モデルの開発を試みた腫瘍 organoids 組織学的および遺伝的患者5,6から原発腫瘍の性質を反映して、中に転移の普及。この目標を達成するために CRC organoids は GFP レンチ ウイルス、それによって非常に明るい GFP (<strong class...

CRC の PDX 由来器官毛細細胞に緑色蛍光タンパク質 (GFP) レンチ ウイルス粒子の効率的な伝達のためのプロトコルを示す本普及のひと大腸癌の高感度検出 (CRC) 細胞組織を植民地化をできるように、ステレオ蛍光顕微鏡による観察で、受信者のマウスに注入する前に。

GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

この方法は、結腸がん患者に見られる微小転移に関する腫瘍生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスのGFP標識患者由来結腸がんオルガノイドによって誘導された微小転移を高感度に検出できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、マウスの遠隔臓器で結腸腫瘍オルガノイド由来の微小転移を検出するのが難しいため、苦労するでしょう。岡澤悠氏と一緒に手順を実演するのは、私のグループの博士課程の学生であり外科医である水越浩輔氏と小山悠氏です。ヒト大腸がん細胞オルガノイドを作製するには、まず、氷上の12ウェルプレートにウェルあたり150マイクロリットルの人工細胞外マトリックスを加えます。すべてのウェルをコーティングしたら、プレートを摂氏37度および5%CO2インキュベーターで30〜60分間インキュベートして、ゲルを固化します。次に、患者由来の腫瘍異種移植細胞ペレットを、5%ウシ胎児血清(FCS)を添加した新鮮な結腸直腸癌オルガノイド培養培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜5個の細胞の濃度を達成し、各人工細胞外マトリックスに1ミリリットルの細胞を播種します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。翌朝、浮遊細胞を含む培養上清を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに慎重に移して遠心分離し、ペレットを70マイクロリットルの新鮮な人工細胞外マトリックスに氷上に再懸濁します。結腸直腸癌細胞の生存率を高めるには、人工細胞外マトリックスを含む浮遊腫瘍細胞を人工細胞外マトリックスコーティングウェルに再度重ね合わせ、腫瘍細胞培養器で腫瘍細胞培養物を30分間インキュベートします。新しい細胞外マトリックスゲルが固まったら、1%FCSを添加した1ミリリットルの新鮮な結腸直腸癌オルガノイド細胞培養培地を培養物に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。7〜10日間の培養後、滅菌細胞スクレーパーでオルガノイドを機械的に取り外し、オルガノイドを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離します。次に、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、軽くたたいて別の遠心分離を行います。結腸直腸癌オルガノイドを解離するには、500マイクロリットルのタンパク質分解酵素溶液とコラーゲン分解酵素溶液をチューブに加え、軽くたたいて混ぜます。室温で10分後、1%FBSを添加した500マイクロリットルの培地を細胞に加え、細胞懸濁液を数回非常に穏やかにピペットで動かしてオルガノイドを分解します。プロセシング中のヒトCRCオルガノイドの穏やかなピペッティングは、培養中の無傷のスフェロイド形成を維持するために重要です。細胞を再度遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルの5X GFPレンチウイルスストックと400マイクロリットルの新鮮な結腸直腸癌オルガノイド培養培地に再懸濁します。ヒトCRCオルガノイドに高力価のGFPレンチウイルスを感染させることは、特にCRCのほぼ100%の感染を達成するために不可欠です。中濃度の500マイクロリットルあたり5つの解離腫瘍細胞の5倍を達成するために各チューブ内の容量を調整し、実証されたように人工細胞外マトリックスコーティングされた12ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞をプレートします。細胞培養インキュベーターで18時間後、浮遊する細胞含有上清を個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離し、続いてペレットを氷上のチューブあたり70マイクロリットルの人工細胞外マトリックスに再懸濁します。結腸直腸癌細胞の生存率を高めるには、腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを12ウェルプレートの腫瘍オルガノイドに重ね合わせ、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間置きます。人工細胞外マトリックスコーティングが固まったら、1%FCSを添加した1ミリリットルの新鮮なCRCオルガノイド培養培地を培養物に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに3日間戻します。次に、感染した細胞を蛍光顕微鏡で観察して、ほぼ100%GFP陽性を確認し、さらに4〜6日間細胞をインキュベーターに戻します。CRC患者由来腫瘍異種移植片の自然転移マウスモデルを確立するには、示されているようにGFP標識オルガノイドを解離し、50%の人工細胞外マトリックス濃度を添加したPBSの50マイクロリットルあたり5つの腫瘍細胞に対して、単一の腫瘍細胞懸濁液を10倍に希釈します。マウス1匹あたり50マイクロリットルの細胞を22ゲージの針を備えた注射器にロードし、腫瘍細胞を氷上に置きます。次に、つま先のつま先つまみに対する反応の欠如を確認し、最初に麻酔をかけたNOGマウスを実験室のベンチの仰臥位に置きます。滅菌ピンセットを使用して、直腸粘膜を肛門からそっと引き出し、すぐに腫瘍細胞を直腸粘膜下組織に注入します。CRC患者由来腫瘍異種移植片の実験的転移モデルを確立するには、単一腫瘍細胞懸濁液を50マイクロリットルの濃度あたり4倍の10で4細胞に希釈し、マウスあたり50マイクロリットルの細胞を22ゲージ針を備えた注射器にロードします。最初に麻酔をかけたNOGマウスをベンチの腹臥位に置き、左脇腹の下部に小さな切開を行います。滅菌ハサミとピンセットを使用して腹膜を慎重に切り取り、脾臓を露出させ、ピンセットを使用して脾臓に付着した脂肪をつかみます。その後、50マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと脾臓に注入し、漏れが観察されないように注意します。すべてのマウスを注射し、必要に応じて縫合した後、動物を自宅のケージに戻し、腫瘍細胞送達の1日後に縫合糸の漏出と生存率を確認します。キャリパーを使用して腫瘍を毎週測定し、原発腫瘍と関連組織を適切な実験エンドポイントまで採取します。解剖した腫瘍と臓器を氷上の10cmシャーレで5ミリリットルの氷冷PBSに移し、解剖した組織を実体蛍光顕微鏡で観察してGFP発現を評価します。GFPレンチウイルスによる大腸がんオルガノイド感染は、実証されているように、ほぼすべてのオルガノイドが非常に明るいGFPを発現する結果となります。GFP標識オルガノイドを二次レシピエントNOGマウスに同所性および脾腔内に注射すると、同所性部位および注射後2.5か月で検査した大多数のマウスの肺にGFP陽性の原発腫瘍が形成されていることが明らかになりました。さらに、脾腔内注射の1か月後にレシピエントNOG動物に肝転移が観察されます。このビデオを見れば、GFP標識ヒト結腸直腸がん細胞オルガノイドをレシピエントマウスに導入した後、その微小転移を検出する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、マウスのヒト結腸がん細胞オルガノイドの腫瘍および転移ホーミング効率が、元の腫瘍細胞の患者間変動性に大きく依存することを覚えておくことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能に...

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

このビデオでは、マウスモデル由来の結腸直腸癌細胞を人工細胞外マトリックスコーティングプレート上で増殖させることにより、3Dオルガノイドを生成するための詳細なプロトコルについて説明しています。これらのCRCオルガノイドは、ヒト腫瘍細胞の一次増殖および転移を研究するためのモデルとして使用できます。...

CRCオルガノイド培養:結腸直腸癌細胞から3Dオルガノイドを取得する方法

このビデオでは、蛍光イメージングを可能にするために、GFPレンチウイルス粒子によって形質導入されたCRCオルガノイドを生成する技術について説明しています。これらのGFP標識オルガノイドを動物モデルに添加すると、腫瘍の浸潤と転移の研究に役立ちます。...

CRCオルガノイド細胞の標識:GFPレンチウイルス形質導入結腸直腸癌オルガノイド細胞を生成する方法

このビデオでは、大腸がん患者由来異種移植片またはPDXの自然転移マウスモデルを確立するためのプロトコルについて説明しています。これらの異種移植モデルは、ヒトのがんの特徴を部分的に模倣し、浸潤や転移など、ヒトの悪性腫瘍の重要な側面を理解しています。...

自然転移マウスモデル:同所注射された結腸直腸癌細胞の転移能を研究するためのプラットフォーム

このビデオでは、GFPレンチウイルスで標識されたPDX由来のCRCオルガノイドが免疫不全マウスの脾臓に転移を生成するためのプロトコルについて説明しています。他の臓器にコロニーを形成するがんの微小転移は、蛍光顕微鏡を使用して検出し、GFP発現を評価できます。...

実験的転移マウスモデルの確立:GFP発現CRCオルガノイド細胞をPDXモデルに移植して微小転移を検出する

このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。...

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス粒子とルシフェラーゼレポーターによる患者由来異種移植片(PDX)の安定な標識方法について説明します。この方法により、一次部位でのPDXの増殖を追跡し、in...

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。...

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

本研究は、緑色蛍光タンパク質および生物発光シグナルの検出と定量的分子検出技術の統合によって腫瘍負荷を正確に評価するための高度なプロトコルをプリセットする。...

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。...

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。...

がんの患者由来オルガノイドモデルにおける薬物反応のための多重化生細胞イメージング(英語)

学ぶGFPレンチウイルス導入法による患者由来大腸がんオルガノイドの作製と微小転移の高感度検出技術。この手法はin vivoでの腫瘍生物学研究に有用です。

GFP レンチウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

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