Name: アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ脊髄内rAAV注入法により、マウスの腰髄背角ニューロンを遺伝的に標的化し、痛みの神経回路を機能的に解析する手法です。組織損傷を最小限に抑えつつ正確な遺伝子導入が可能です。

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<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
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<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

通気の脊柱の注入は、高時間・空間のソリューションと脊髄細胞の解析を有効にする研究所の強力な技法になるかもしれません。このプロトコルにより、後肢、末梢神経を拡張するニューロンによって支配されている 3 つの主要な脊髄セグメントの伝達です。3 つのセグメントを伝達堅牢かつ再現可能な行動データを生成します。また単一脊髄内投与後可能なより大きい感覚領域のテストができます。同じインジェクション政権により足をテストするため、たとえば、(von Frey、ハーグリーブス、等) と太もも (皮内注射、メカノ受容体の刺激)、従って拡大に対処できる感覚。
重要なステップ:
堅牢な形態および行動データを取得するため、人工物を避けるために重要ないくつかの手順があります。ウイルスのベクトルのデザインとプロモーターと血清型の選択は、伝達効率と導入された領域の範囲に強力な影響を持つことができます、したがって行動の結果に (ウイルスの拡散と伝達効率の詳細についてを参照してください<sup class="xr...

背側脊髄は体の周囲と脳との間の情報交換は欠かせません。暑さ、寒さなど感覚的な刺激に触れる、または侵害刺激は、脊髄後角のニューロンにこの情報を伝える専門の末梢神経によって検出されます。ここでは、抑制性および興奮性の介在神経の複雑なネットワークを調節して、最終的に脊髄を脊髄投射ニューロンを介してリレー感覚情報サイト1,2。脊髄によって実施計算間- および投射ニューロン ゲート感覚については、こうして情報が抑制またはどの強度で中継を決定します。過敏やアロディニア (通常非痛み刺激によた後痛みの感覚) など感覚機能障害抑制と励起、バランスの変化など、感覚的な刺激の統合の変更可能性があります。これらの変更は、様々 な慢性的な痛みの根本的な原因を示す3,4をすると考えられています。したがって、脊髄回路は、感覚の処理で重要度の高い、したがって生物の環境と自己の認識の。最近登場して分子、遺伝子の組み合わせと遺伝的に識別された脊髄ニューロン集団の正確な操作を許可する手技、科学者は、基になる脊髄回路を理解し始めている今異なる感覚の処理を担当します。
野生型やトランスジェニック マウスに下さい rAAV の脊柱の注入が大きく貢献して、操作、分析、および脊髄ニューロン5,6,7,の特定のサブセットの機能を理解する8,9,10,11この手法により、マーカー蛋白質の配信 (GFP など/GFP の融合蛋白質)、(GCaMP) などのレポーター蛋白質またはエフェクター蛋白質 (細菌毒素、チャネルロドプシン、薬理遺伝学的受容体など)、空間的。脊髄の神経細胞に制限的な方法。脊髄の神経細胞の特定のサブセットに Cre リコンビナーゼを発現するトランスジェニック マウスに Cre 依存性 rAAVs の局所注射では、それぞれのニューロン集団の特定の分析をことができます。我々 は、ラベル、アブレーション、抑制または脊髄ニューロンの示す痛みを制御する脊髄のゲートの不可欠な一部であり、トランス ミッション7をかゆみグリシン作動性神経をアクティブにするためにこの手法を採用しています。これらの実験では、GlyT2::Cre マウスに Cre 依存下さい rAAV の脊柱の注入には腰椎の脊髄におけるグリシン作動性神経ニューロンの選択的操作が有効になります。これにより、グリシン作動性神経ニューロンの動物の生存のために重要なを含む中枢回路の同時操作を避けることができます。
RAAVs の脊柱の注入は、注入のサイトに感染を制限、局所介在ニューロンのみならず、神経細胞の軸索投射を介して注入のサイトに接続するウイルスの伝達が発生します。後者はよく脳の特定の核への神経入力を提供するトレース中枢神経系領域に使用されます。軸索投射の感染、ただし、また、交絡因子ニューロンの定義された人口は特定のサイトで勉強しなければならないとき。これらの問題に対処するため最近 AAV 血清型と血清型といずれかを最小化または逆行性伝達を最大化するためのプロモーターを識別する式カセットの包括的な分析を実施しています。逆行性後根神経節 (DRG)、吻側の腹内側核延髄 (RVM) と体性感覚皮質のニューロンをヘッジホッグ異なる血清型およびプロモーターの機能を行った脊髄回路でこの特定の研究の中で、12. 注射部位の脊髄を分析する脊髄の注入されたサイトへの入力を提供する投射ニューロンを分析したり、このプロトコルで説明されているテクニックを使用したがってことができます。ここで説明したプロトコルでは、腰椎の脊髄の左側に下さい rAAV の 3 注射は 3 腰椎セグメント (L3 ・ L5) における神経細胞の伝達を有効にするのに実行されます。L3 ・ L5 セグメントは、同側の後肢から注射部位に感覚入力の大半を受け取る。従ってそのような遺伝的標識神経細胞サブタイプの回路関数の機能の証拠を提供する L3 ・ L5 の遺伝的標識細胞の機能操作堅牢な行動の変化を呼び起こすに十分であることを紹介します。

<table><tbody><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラーDMZ-Universal-Electrode-Puller</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>麻酔ユニット:Oxymat3酸素濃縮器</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>麻酔ユニット:VIP 3000獣医用気化器</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ヒートマット:Mio Star Thermocare 100</td><td>Migros</td><td></td><td></td>717614700000</tr><tr><td>電気シェーバー</td>フィ<td>リップス</td><td>BT9290</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡(OPMIピコ)</td><td>ツァイス</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>小動物定位固定装置</td><td>KopfNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニューロスターステレオドライブ(オプション)</td><td>ニューロ</td><td>スターNA</td><td></td></tr><tr><td>モデル51690カニンガムマウス脊椎アダプター</td><td>ハーバード装置</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr>ナノマイトハーバー<td>ド装置</td><td>70-3601</td><td></td>ハミルトン701 RN 10 &muと<td>PHDウルトラシリンジポンプ</td></tr><tr><td>l ガラス マイクロリットル シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン 取り外し可能な針 (RN) 圧縮フィッティング 1 mm</td><td>ハミルトン</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>細かい歯科用穴あけ装置: 長田成功 40</td><td>長田</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>球面カッター、0.5mm</td><td>ブッシュ</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>電子フォン フレイ麻酔計</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr><tr><td>flexible von Frey hairs</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Pascal 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA &times; 20 Plan-apochromat 対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1.3 NA &times; 40 EC Plan-Neofluar 油浸対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4, 13cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs、湾曲、0.7 mmカップ</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 椎弓切除鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar ニードルホルダー、鋸歯状、クランプ長 8.5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>消耗品および化学薬品</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄肉ガラスキャピラリー、外径1mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジ(1、5、20 ml)</td><td>B.ブラウン</td><td>(9166917V、4606051V、4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>26G 斜めの針</td><td>B. ブラウン</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>滅菌メスの刃</td><td>B. ブラウン</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合糸 Safil Quick+ 4/0, 吸収性</td><td>B. ブラウン</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合糸 Premilene 5/0, 非吸収性</td><td>B. ブラウン</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 PBS または生理食塩水 (0.9%)</td><td></td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、70%(消毒剤)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素溶液(例:Braunol)</td><td>B.ブラウン</td><td>18380</td><td></td></tr>麻酔<tr><td>薬(例:アタンイソフルラン)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>Provet</td><td>333526</td><td></td></tr><tr><td>鎮痛薬(例:ブプレノルフィン:テムゲシック)</td><td>個別</td><td>GTIN:7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏(例:vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN:4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>綿棒(例:体</td><td>外受精Hartmann</td><td>1628100</td><td></td>から)</tr><tr><td>顔面ティッシュ(例:から)</td><td>Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slides</td><td>ThermoScientific</td><td></td> J1800AMNZ<td></td></tr><tr><td>Name</strong<></td><td>strong>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>マウス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6Jマウス(野生型)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Rorbtm1.1(cre)Hze/Jマウス(ROR&beta;Cre)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウス (R26Tom)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>RRID:IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Viral vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1です。CB7です。CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)</td><td>ペンベクトルコア</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1。CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)</td><td>ペンベクトルコア</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1。CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)</td><td>ペンベクターコア</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1。EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)</td><td>Penn Vector Core</td><td>カスタム生産</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>Penn Vector Core</td><td>Custom production</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.EF1&alpha;.flex.hChR2(H134R)-eYFP</td><td>Addgene</td><td>20298</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDS42</td><td>ScarabGenomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3</td><td>ThermoScientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree プラスミド マキシ キット</td><td>Quiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC 500</td><td>Machery &ナーゲル</td><td>740574</td><td></td></tr><tr><td>クロザピン-N-オキシド(CNO)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BBL-NS105-0025</td><td></td></tr><tr><td>クロロキン二リン酸塩</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>ヒスタミン</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>抗体(希釈)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗GFP (1:1000)</td><td>分子プローブ</td><td>RRID:AB_221570</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-NeuN (1:3000)</td><td>アブカム</td><td>RRID:AB_10711153</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗Pax2 (1:200)</td><td>R &D Systems</td><td>RRID:AB_10889828</td><td></td></tr><tr><td>モルモット抗Lmx1b (1 : 10 000)</td><td>Dr Carmen Birchmeier</td><td>Muller et al. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)</td><td>DakoCytomation</td><td>RRID:AB_10013382</td><td></td></tr><tr><td>ロバで産生された二次抗体 (1:800)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

脊髄神経細胞集団の選択的操作は主に 2 つの方法で達成されている: 1) 交差形遺伝学、記者やエフェクターの選択的表現を達成するためにダブル、トリプルのトランスジェニック マウスを生成するという目的の脊髄の人口の遺伝子 (例えばRosa26 の軌跡から)。Cre 依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV); 2) 脊柱の注入ここで好みの記者やエフェクターの遺伝子のコーディングの Cre 依存 AAV のベクトルは、目的の神経細胞集団に Cre リコンビナーゼを発現するマウスの脊髄に挿入されます。このプロトコルは、Cre 依存下さい rAAV ベクトルを生成する方法を説明し、腰椎の脊髄後角のニューロンを変換する方法は、rAAVs と L3 ・ L5 をセグメントします。L3 ・ L5、後肢からの感覚情報を送信それらの末梢感覚神経によって支配されています腰椎脊髄のセグメントとして自発的な行動と感覚のテスト注入側と同側の後肢に適用する応答することができます。感覚処理の操作のニューロンの機能を調べるために分析しました。この手法を使用して、遺伝子を分析する方法の例は、脊髄ニューロンのサブセットを定義を提供します。古典的なレポーター マウスの誘導発現に比べて Cre トランスジェニック マウスにおけるウイルスを介する遺伝子発現の主な利点は、次: 1) 異なる Cre 依存 rAAVs 様々 な記者やエフェクター蛋白質をコードすることができますこうして行いくつか複数のトランスジェニック マウスを作成する必要性を克服する単一の Cre トランスジェニック行に注入します。2) 脊柱の注入は、Cre 発現細胞注射部位と注射後時間の操作を制限します。主要な不利な点: 1) rAAVs からレポーター遺伝子発現は多くの変数。2) 手術へと興味の脊髄の神経細胞を変換する必要があります。2 つの方法であるより適切な対処するニューロンの人口と研究の質問に依存します。

下さい rAAV マーカー蛋白質の脊柱の注入によって得ることができる表現のレベルを説明するために最初に AAV1 を注入しました。野生型マウスの腰椎の脊髄に CAG.eGFP。3 注射間隔を約 1 mm 離れて生産 L5 腰椎脊髄セグメント L3 のほぼ連続的な感染症 (図 1A-C)。脊髄の表面から 300 μ m の深さでウイルス注入は、脊髄後角細胞の支配的な感染に します。ただし、感染した細胞も見つかりませんでした腹側角 (図 1)。次に、目標は、Cre トランスジェニック マウスに注入すると Cre 依存下さい rAAV 下さい rAAV による発現の違いを説明するためにだった。したがって、Cre 依存 AAV1 を注入しました。GlyT2::Cre トランスジェニック マウスの脊髄に CAG.flex.eGFP ベクトル。として前に、eGFP 発現が背側と腹側のホーンにみられました。しかし、予想通り、eGFP ...

シュプリンガー依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) の脊柱の注入は、脊髄内の任意の遺伝子組み換えラベル セル型を操作する使用できます。ここで我々 は腰椎の脊髄後角のニューロンを変換する方法をについて説明します。このテクニックは、操作神経細胞サブタイプの機能の尋問を使用できます。

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

組換えアデノ随伴ウイルスの脊髄内送達の全体的な目標は、背側脊髄の遺伝的に定義されたニューロンの組織学的標識と機能操作を可能にすることです。この方法は、さまざまな痛みのモダリティを知覚するためにどのニューロン回路が必要かなど、痛みの領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝的に標識されたニューロンを特別に制限され、時間的に制御された方法で操作できることです。麻酔をかけたマウスの脊柱に沿って触診することにより、最も尾側の肋骨のペアを見つけます。次に、吻側から最も尾側の肋骨のペアまで、皮膚に縦1.5〜2.5センチの切り込みを入れます。鉗子で皮膚を持ち上げ、ハサミで下にある筋肉から皮膚を離します。手術中は、露出した組織を滅菌済みの0.9%塩化ナトリウムで湿らせてください。.細い鉗子と小さなハサミを使用して、正中線のすぐ隣にある薄い膜層の隣に切開を行い、棘突起から切り取ります。いくつかの解剖学的ランドマークは、ターゲットとする正しい椎骨を特定するのに役立ちます。ここでは、3つの選択肢について説明します。脊柱に沿って触診します。最も尾側の肋骨のペアはT13椎骨のすぐ吻側にあり、股関節レベルの骨盤骨はL6椎骨のレベルにあります。または、皮膚を尾に向かって引き戻して、腸骨稜を露出させます。同じレベルで、目に見えるインタートランスバース靭帯の最も尾側のペアがL6脊椎突起に加わります。尾側から吻側への方向を逆方向に数えて、目的の椎骨を特定します。それ以外の場合は、脊柱の側面に沿った腱が最も白く、最も内側にある場所を特定します。T13椎骨はちょうど吻側にあります。腰椎脊髄セグメントL4は、この椎骨内にあります。次に、動物を丸めた組織のクッションの上に置き、定位固定フレームの脊椎クランプに持ち上げます。クランプをターゲットの椎骨に隣接して位置合わせします。1つのクランプを所定の位置に固定し、次に2番目のクランプを固定しながら、Adson鉗子で脊柱を保持します。対象の椎骨を慎重に押して、適切なクランプを確認します。次に、目的の椎骨の上にある傍棘筋を切除します。まず、脊柱に平行な腱のすぐ内側を切開します。次に、目的の椎骨に対して吻側と尾側に垂直に切開します。次に、ロンゲールを使用して、目的の椎骨の上にある傍棘筋を引き裂くか切り取ります。必要に応じて鉗子を使用して、椎骨または硬膜の上の椎間腔に残っている組織を取り除きます。背側の血管が見え、脊髄の正中線がマークされます。片側注射の場合は、0.5ミリメートルの球形カッターを備えた細かい歯科医用ドリルを使用して椎弓切除術を行い、椎骨の標的側の中央に非常に慎重に穴を開けます。26ゲージの斜めの針で残っている骨片を取り除き、脊髄を露出させます。針を使用して、背側血管の外側約300ミクロンの吻側と尾側の椎骨内腔に硬膜を穿孔します。次に、ドリルで開けた穴の下に硬膜を穿孔します。この時点で、脳脊髄液が穴から逃げ、脊髄がわずかに膨らんでいるはずです。最初にガラスキャピラリーをマイクロリットルシリンジに取り付けて、注射シリンジを準備します。ナットをしっかりと固定して、しっかりとしっかりとフィットするようにします。マイクロリットルのシリンジに滅菌蒸留水を入れ、プランジャーを押し下げます。水がチップから簡単に排出されない場合は、マイクロピペットが詰まっている可能性が高いため、交換する必要があります。シリンジを電子制御マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、マイクロインジェクターを使用して約1マイクロリットルの空気を吸い上げ、水とウイルスを分離します。次に、2.5マイクロリットルの希釈したウイルス溶液の液滴をパラフィンフィルムにピペットで移します。マイクロピペットの先端をステロタキシックフレームを使用して慎重に液滴に移動し、マイクロピペットに引き上げます。次に、先端にウイルス溶液が一滴現れるまでディスペンスを押します。シリンジを引っ込め、ペンを使用してマイクロピペットに目盛りで印を付け、分注量を監視します。定位固定アームを使用して、マイクロピペットの先端を硬膜の穴の1つに動かし、露出した脊髄の表面にわずかなくぼみが現れるまで下に動かします。脊髄背角に注入を狙うには、先端を100ミクロン刻みで500ミクロンの深さまで下げ、次に200ミクロンまで動かして組織の機械的安定化を可能にします。先端の最終的な深さは300ミクロンです。毎分50ナノリットルの注入速度で300ナノリットルを注入するようにポンプをプログラミングした後、開始ボタンを押して注入を開始します。注射が完了したら、マイクロピペットのスケールでウイルスレベルが下がったかどうかを確認します。マイクロピペットをさらに3分間そのままにして、圧力を平衡化させます。3分後、マイクロピペットをゆっくりと引っ込め、他の2つの注射部位に対して手順を繰り返します。最終的な注入後、脊椎クランプとマウスの下のクッションを取り外します。切開層を断続縫合で閉じ、表在組織層を吸収性縫合糸で縫合し、皮膚を非吸収性縫合糸で縫合します。縫合した傷口にヨウ素消毒剤を塗布します。麻酔を終了し、動物を回復するまでヒートマットの上に置いてから、自宅のケージに戻します。注射部位の脊髄組織は、実験の最後に検査されます。これは、注射と形質導入が成功したことを確認し、手術の結果としての過剰な組織損傷を排除するために必要です。組換えAAVの脊髄内注射によって得られる発現レベルを説明するために、eGFP蛍光タンパク質をコードするウイルスを野生型マウスの腰椎に注入した。約1ミリメートル間隔で3回の注射を行ったところ、L3からL5までの腰椎セグメントにほぼ連続的に感染が生じました。脊髄表面から300ミクロンの深さでのウイルス注入は、脊髄背角の細胞の優勢な感染につながります。しかし、感染した細胞は腹角にも見つかることができました。eGFPを発現するcre依存性flexベクターをGlyT2:Creトランスジェニックマウスの脊髄に注入しました。その結果、GLYT2陽性ニューロンの分布を反映して、eGFPの発現がより制限されました。このプロトコルに従うと、3つの連続した脊椎セグメントのターゲティングが可能になります。これは、堅牢な行動結果を得るのに十分であることがわかりました。この技術により、特定のニューロンや細胞集団、感覚経路の機能を研究することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Smit, RD, et al.脳と脊椎の併用手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生ラットの皮質脊髄路の標的化J. Vis.

脊髄損傷を研究するための新生児ラットの皮質脊髄ニューロンへの標的ウイルス送達

出典: Tadokoro, T., et al.成体マウスにおける軟膜下アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達J. Vis. 経験。(2017年)このビデオは、マウスの脊髄への遺伝子送達のための軟膜下注射技術を示しています。この手順には、硬膜を露出させ、軟膜に穿刺し、蛍光タンパク質発現遺伝子を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV)...

遺伝子発現を評価するためのマウス脊髄における軟膜下遺伝子送達

出典:Pourshafie, N., et al.げっ歯類の神経筋疾患を治療するための組換えアデノ随伴ウイルス血清型9を用いたマイクロRNAの全身送達J. Vis. Exp.

脊髄および眼球筋萎縮症マウスモデルにおける組換えアデノ随伴ベクターの注入

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。...

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

このプロトコルは、感覚軸索再生を研究するためのモデルとして、ウイルスベクターによる後根神経節(DRG)注射の使用と成体ラットの同時後根挫傷を示しています。このモデルは、感覚軸索再生を促進するための遺伝子治療の使用を調査するのに適しています。...

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

本研究の目的は、成体マウスにおける新規な遺伝子サブ送達技術を用いて、脊髄アデノ随伴ウイルス9（AAV9）媒介遺伝子送達の効力および安全性を開発および検証することであった。...

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。...

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1%...

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

このプロトコルは、ラット脊髄組織への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの注入を示します。ベクトルはシナプスでとらし、ターゲット...

レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

このプロトコルは、順行性化学遺伝修飾剤を体性運動皮質に注入し、逆行性に輸送可能なCreリコンビナーゼを頸髄に注射することにより、生後5〜10日の新生児ラットの細胞の亜集団に遺伝子治療を適用するための新しい方法を示しています。...

脳と脊椎を組み合わせた手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生児ラットの皮質脊髄路の標的化

くも膜下ウイルスの注入を使用するアデノ随伴ウイルスの広範な送達のための新しい技術が記載されています。この方法は、マウス新皮質ニューロンの表層への広範な形質導入を保証するだけでなく、非選択的プロモーターを使用した場合でも、第5層錐体ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現をもたらします。...

AAV2のくも膜下注射によるマウス新皮質ニューロンの広範な形質導入

学ぶ脊髄内rAAV注入法により、マウスの腰髄背角ニューロンを遺伝的に標的化し、痛みの神経回路を機能的に解析する手法です。組織損傷を最小限に抑えつつ正確な遺伝子導入が可能です。

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

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