アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

組換えアデノ随伴ウイルスの脊髄内送達の全体的な目標は、背側脊髄の遺伝的に定義されたニューロンの組織学的標識と機能操作を可能にすることです。この方法は、さまざまな痛みのモダリティを知覚するためにどのニューロン回路が必要かなど、痛みの領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝的に標識されたニューロンを特別に制限され、時間的に制御された方法で操作できることです。

麻酔をかけたマウスの脊柱に沿って触診することにより、最も尾側の肋骨のペアを見つけます。次に、吻側から最も尾側の肋骨のペアまで、皮膚に縦1.5〜2.5センチの切り込みを入れます。鉗子で皮膚を持ち上げ、ハサミで下にある筋肉から皮膚を離します。

手術中は、露出した組織を滅菌済みの0.9%塩化ナトリウムで湿らせてください。.細い鉗子と小さなハサミを使用して、正中線のすぐ隣にある薄い膜層の隣に切開を行い、棘突起から切り取ります。いくつかの解剖学的ランドマークは、ターゲットとする正しい椎骨を特定するのに役立ちます。

ここでは、3つの選択肢について説明します。脊柱に沿って触診します。最も尾側の肋骨のペアはT13椎骨のすぐ吻側にあり、股関節レベルの骨盤骨はL6椎骨のレベルにあります。

または、皮膚を尾に向かって引き戻して、腸骨稜を露出させます。同じレベルで、目に見えるインタートランスバース靭帯の最も尾側のペアがL6脊椎突起に加わります。尾側から吻側への方向を逆方向に数えて、目的の椎骨を特定します。

それ以外の場合は、脊柱の側面に沿った腱が最も白く、最も内側にある場所を特定します。T13椎骨はちょうど吻側にあります。腰椎脊髄セグメントL4は、この椎骨内にあります。

次に、動物を丸めた組織のクッションの上に置き、定位固定フレームの脊椎クランプに持ち上げます。クランプをターゲットの椎骨に隣接して位置合わせします。1つのクランプを所定の位置に固定し、次に2番目のクランプを固定しながら、Adson鉗子で脊柱を保持します。

対象の椎骨を慎重に押して、適切なクランプを確認します。次に、目的の椎骨の上にある傍棘筋を切除します。まず、脊柱に平行な腱のすぐ内側を切開します。

次に、目的の椎骨に対して吻側と尾側に垂直に切開します。次に、ロンゲールを使用して、目的の椎骨の上にある傍棘筋を引き裂くか切り取ります。必要に応じて鉗子を使用して、椎骨または硬膜の上の椎間腔に残っている組織を取り除きます。

背側の血管が見え、脊髄の正中線がマークされます。片側注射の場合は、0.5ミリメートルの球形カッターを備えた細かい歯科医用ドリルを使用して椎弓切除術を行い、椎骨の標的側の中央に非常に慎重に穴を開けます。26ゲージの斜めの針で残っている骨片を取り除き、脊髄を露出させます。

針を使用して、背側血管の外側約300ミクロンの吻側と尾側の椎骨内腔に硬膜を穿孔します。次に、ドリルで開けた穴の下に硬膜を穿孔します。この時点で、脳脊髄液が穴から逃げ、脊髄がわずかに膨らんでいるはずです。

最初にガラスキャピラリーをマイクロリットルシリンジに取り付けて、注射シリンジを準備します。ナットをしっかりと固定して、しっかりとしっかりとフィットするようにします。マイクロリットルのシリンジに滅菌蒸留水を入れ、プランジャーを押し下げます。

水がチップから簡単に排出されない場合は、マイクロピペットが詰まっている可能性が高いため、交換する必要があります。シリンジを電子制御マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、マイクロインジェクターを使用して約1マイクロリットルの空気を吸い上げ、水とウイルスを分離します。

次に、2.5マイクロリットルの希釈したウイルス溶液の液滴をパラフィンフィルムにピペットで移します。マイクロピペットの先端をステロタキシックフレームを使用して慎重に液滴に移動し、マイクロピペットに引き上げます。次に、先端にウイルス溶液が一滴現れるまでディスペンスを押します。

シリンジを引っ込め、ペンを使用してマイクロピペットに目盛りで印を付け、分注量を監視します。定位固定アームを使用して、マイクロピペットの先端を硬膜の穴の1つに動かし、露出した脊髄の表面にわずかなくぼみが現れるまで下に動かします。脊髄背角に注入を狙うには、先端を100ミクロン刻みで500ミクロンの深さまで下げ、次に200ミクロンまで動かして組織の機械的安定化を可能にします。

先端の最終的な深さは300ミクロンです。毎分50ナノリットルの注入速度で300ナノリットルを注入するようにポンプをプログラミングした後、開始ボタンを押して注入を開始します。注射が完了したら、マイクロピペットのスケールでウイルスレベルが下がったかどうかを確認します。

マイクロピペットをさらに3分間そのままにして、圧力を平衡化させます。3分後、マイクロピペットをゆっくりと引っ込め、他の2つの注射部位に対して手順を繰り返します。最終的な注入後、脊椎クランプとマウスの下のクッションを取り外します。

切開層を断続縫合で閉じ、表在組織層を吸収性縫合糸で縫合し、皮膚を非吸収性縫合糸で縫合します。縫合した傷口にヨウ素消毒剤を塗布します。麻酔を終了し、動物を回復するまでヒートマットの上に置いてから、自宅のケージに戻します。

注射部位の脊髄組織は、実験の最後に検査されます。これは、注射と形質導入が成功したことを確認し、手術の結果としての過剰な組織損傷を排除するために必要です。組換えAAVの脊髄内注射によって得られる発現レベルを説明するために、eGFP蛍光タンパク質をコードするウイルスを野生型マウスの腰椎に注入した。

約1ミリメートル間隔で3回の注射を行ったところ、L3からL5までの腰椎セグメントにほぼ連続的に感染が生じました。脊髄表面から300ミクロンの深さでのウイルス注入は、脊髄背角の細胞の優勢な感染につながります。しかし、感染した細胞は腹角にも見つかることができました。eGFPを発現するcre依存性flexベクターをGlyT2:Creトランスジェニックマウスの脊髄に注入しました。

その結果、GLYT2陽性ニューロンの分布を反映して、eGFPの発現がより制限されました。このプロトコルに従うと、3つの連続した脊椎セグメントのターゲティングが可能になります。これは、堅牢な行動結果を得るのに十分であることがわかりました。

この技術により、特定のニューロンや細胞集団、感覚経路の機能を研究することができます。