RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

このプロトコルの全体的な目標は、リポソームキャリアにカプセル化された二本鎖RNAの経口摂取によるRNA干渉を使用して、ゴキブリの腸内での遺伝子発現を枯渇させることです。この方法は、オープンフィールドで必須遺伝子をノックダウンして害虫を殺すことができるかなど、新しい害虫駆除方法の開発における重要な質問に答えるのに役立ちますか?この技術の主な利点は、リポソームが遺伝子特異的な二本鎖RNAを保護し、標的細胞への送達を確実に行うことです。

この手順を実演するのは、ポスドクのJia-Hsin Huangと私の研究室の技術者であるYun Liuです。まず、ゴキブリが3分間動かなくなるまで氷の上で麻酔をかけます。次に、親指と人差し指を使って昆虫を拾い上げ、腹側にアクセスします。

次に、解剖ハサミを使用して、後肢のコクサの先端をコクサと転子の間で切り取ります。股関節の他の場所で切断すると、血リンパ収集の効率が低くなります。次に、10マイクロリットルのマイクロピペットを切開部に配置し、出血している血リンパを引き出しながら腹部を優しく圧迫します。

5匹のゴキブリからの血リンパが1本の微量遠心チューブに集められるまで、このプロセスを繰り返します。次に、プールされた血リンパを10秒間簡単に回転させます。次に、10マイクロリットルの血リンパ液と50マイクロリットルの1x昆虫生理食塩水バッファーを組み合わせます。

次に、希釈した血リンパ液を10分間遠心分離して、血球を溶液から引き出します。次に、上清を新しいチューブに移します。最後に、微量UV-Vis分光光度計を使用して総タンパク質濃度を定量化し、各サンプルの濃度をマイクロリットルあたり6ミリグラムのタンパク質に調整します。

中腸液を集めるには、まず、氷の上でゴキブリに麻酔をかけます。次に、1つを冷たい1x昆虫生理食塩水バッファーを充填した解剖プレートに移し、昆虫ピンを使用して腹側を上にして固定します。次に、細いピンセットを使用して腹部を解剖します。

次に、腸全体を取り出し、1x昆虫生理食塩水バッファーを入れた新鮮な皿に移します。次に、作物とマルピーギ尿細管の間の領域である中腸を分離します。これを行うには、動物の前部を取り外し、後腸を取り外してください。

次に、中腸を100マイクロリットルの昆虫生理食塩水バッファーを備えたマイクロ遠心チューブにすばやく移します。6匹のゴキブリから中腸を同じチューブに集めます。次に、チューブを10秒間ボルテックスします。

次に、混合物を10分間遠心分離して、血球と腸組織を分離します。次に、上清を清潔な微量遠心チューブに移し、濃度をマイクロリットルあたり6ミリグラムのタンパク質に調整します。二本鎖RNAリポプレックスは、調製後1時間以内に使用する必要があります。

その調製時には、希釈した試薬と希釈した二本鎖RNAを同時に組み合わせてください。次に、混合物をすばやくボルテックスしてインキュベートします。準備ができたら、4マイクロリットルの二本鎖RNA溶液をコントロールとして10マイクロリットルの昆虫生理食塩水バッファーと混合するか、血リンパ液または中腸液から採取した10マイクロリットルの抽出酵素と混合します。

次に、2マイクロリットルのEGTAを添加して酵素阻害コントロールを行います。それ以外の場合は、2マイクロリットルのRNaseフリー水を追加します。その後、サンプルを摂氏25度で1時間以上インキュベートします。

インキュベーション後、200マイクロリットルの抽出試薬と40マイクロリットルのクロロホルムを加え、次にボルテックスを加えます。次に、サンプルを10分間遠心分離します。次に、各上清150マイクロリットルを新しいチューブに移し、150マイクロリットルのイソプロパノールを添加し、サンプルを氷上で15分間インキュベートすることにより、各サンプルから二本鎖RNAを沈

インキュベーション後、サンプルを再度遠心分離し、上清を捨てます。次に、各ペレットに200マイクロリットルの70%エタノールを加え、チューブを遠心分離することにより、RNAペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、遠心真空濃縮器を使用して二本鎖RNAペレットを3分間乾燥させます。

次に、ペレットを10マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。最後に、1.5%アガロースゲルを使用して、処理した二本鎖RNAの完全性を確認します。ゴキブリに1日2回、照明をつけてから1時間後と照明が消える1時間前に餌をやります。

これを8日間または16日間休憩なしで行います。この間、ゴキブリはそうでなければ水が不足するはずです。給餌には、新たに調製した二本鎖RNAリポプレックスと裸の二本鎖RNAを用意してください。

ボーラスには、4マイクロリットルの二本鎖RNAリポプレックスまたは250ナノグラムの裸の二本鎖RNAと一緒に使用します。.ゴキブリに餌をやるには、まず、柔軟な鉗子を使用して翼でゴキブリをつかみます。ゴキブリの体の部分をつかまないでください。

次に、溶液の液滴を口器の近くでゆっくりとピペットで動かし、ゴキブリが液滴を摂取するのを観察します。最後の給餌後、ゴキブリに水筒を用意します。給餌期間中は、昆虫を毎日評価して死亡率を確認し、実験から動かなくなったゴキブリを取り除きます。

二本鎖浴槽リポプレックスの継続的な経口投与により、中腸でのチューブリン発現を9日目の40%から17日目の60%に減少させることができました。.それに比べて、裸の二本鎖RNAは効果がありませんでした。これは、裸の二本鎖RNAを中腸液に曝露すると1時間以内に分解されるのに対し、リポソーム結合二本鎖RNAは安定していることがわかったためである可能性が高いです。

RNAレベルが低下しただけでなく、チューブリン二本鎖RNAリポプレックスの継続的な供給も重大な致死率をもたらしました。これはベクターによるものではなく、二本鎖RNAをEGFPに運ぶリポプレックスは致死性をもたらさなかった。このRNA干渉の経口送達システムを試みる際には、二本鎖RNAを数日間連続して供給することが重要です。

一度習得すると、給餌ステップは適切に実行されれば、昆虫ごとに2分で行うことができます。必要に応じて、リポソームナノ粒子の異なる製剤を適用して、供給手順とRNAi効率を改善することができます。最終的に、この技術により、害虫管理の分野の研究者は、RNAiを使用して新しい防除戦略を探求することが可能になりました。