Name: RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ リポソームキャリアを用いたRNA干渉法によるドイツゴキブリの中腸遺伝子発現抑制技術。経口投与による害虫防除戦略の新たな可能性を探索し、標的遺伝子の機能解析と持続的な害虫管理手法の開発に貢献します。

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本研究は台湾 (省の科学と技術、最も 100-2923-B-002-002-MY3、H.J.L.、106-2313-B-002-011-MY3) からの助成金によって支えられたチェコ共和国 (南ボヘミア州庁大学 GAJU 付与 065/2017/P Y.H.L) 付与、およびスペイン (スペイン経済省と競争力、CGL2012 36251 と CGL2015 64727 P コドーピング、およびカタロニアの政府への許可を付与 2014 SGR 619 コドーピングに);それはまた経済と地域開発 (コドーピング フェダーイン ・資金) の欧州基金から助成を受けた。

1 合成と dsRNA の準備
<ol><li>標的遺伝子の 3' 非翻訳領域の dsRNA のターゲット サイトを識別します。Α-チューブリン (浴槽) 遺伝子をターゲットに、dsTub を使用 (GenBank 受入番号: KX228233) と dsEGFP のシーケンスから否定的な dsRNA のコントロールは、強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP;GenBank の受入番号: LC311024)。</li>
	<li>T7 プロモーター配列を含む遺伝子特定のプライマーで dsRNA テンプレートを合成する標準 PCR 増幅を実行 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')。PCR 増幅条件と使用されるプライマー情報は、林らによってそれらで報告されました。(2017)12 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>T7 転写を用いた dsRNA 準備を進めるキット (材料の表を参照してください)、製造元の指示に従います。 注:高数量 dsRNA、(合計 40 μ L) の 1 つの管の 2 つの反応をミックスし、37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>DNase の 2 μ L を追加 (材料の表を参照してください) に dsRNA サンプル ダイジェスト DNA テンプレートを 37 ° C で 15 分間。</li>
	<li>200 μ L の抽出試薬を追加 (材料表参照) 40 μ L のクロロホルムし渦。</li>
	<li>4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心し、新しい微量遠心チューブに上清 (150 μ L) を収集します。</li>
	<li>150 μ L のイソプロパノールを追加し、氷で 15 分間インキュベート dsRNA を沈殿させます。</li>
	<li>4 ° C で 13,000 × g で 15 分間遠心し、上清を除去します。</li>
	<li>DsRNA ペレットを洗浄する 70% エタノール 200 μ L を追加します。4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心</li>
	<li>エタノールを削除し、エタノールの洗浄ステップを繰り返します。</li>
	<li>エタノールと、3 分間遠心濃縮、乾燥 dsRNA ペレットを削除し、RNase フリー水で dsRNA を再懸濁します。</li>
	<li>マイクロ ボリュームが紫外可視分光光度計を使用して精製された dsRNA の数量を決定 (材料表参照) 製造元の指示に従って、必要な濃度 (例えばの準備のための 0.25 μ g/μ L に調整dsRNA リポプレックス)。</li>
	<li>3 ヵ月の-20 ° C で dsRNA のサンプルを格納します。</li>
</ol>2. dsRNA リポプレックスの準備
<ol><li>トランスフェクション試薬の 4 μ L を希釈 (材料表参照) 5% ブドウ糖溶液の 4 μ L を追加することによって。5% ブドウ糖液の 4 μ L を追加することで (1 μ g) dsRNA の 4 μ L を希釈します。</li>
	<li>希釈したリポソーム試薬溶液すぐに希釈された dsRNA のソリューションにすべて一度に追加します。簡単に、それらをミックスし、25 ° C で 15 分間インキュベートする渦 注:逆の順序でソリューションを混在させないでください。</li>
	<li>DsRNA リポプレックス使用の準備ができています。準備の 1 時間内で使用し、1 時間後に破棄します。 注:製造元の指示に従って、リポプレックスをできるだけ早く使用必要があります。</li>
</ol>3. 体液や腸ジュースから菌体外酵素のコレクション
<ol><li>
昆虫生理食塩水バッファー (10 x の在庫)
	<ol>
<li>109.3 g 塩化ナトリウム、15.7 g KCl、6.3 g CaCl2、および 8.3 g MgCl2·6H2O. 二重蒸留水 900 mL をミックスします。</li>
		<li>6.8、pH 調整、1,000 mL までを記入してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
体液コレクション
	<ol>
<li>3 分の移動しないまで氷にゴキブリを麻酔します。</li>
		<li>2 本の指 (親指と人差し指) でゴキブリを押しながらゴキブリの腹側を上げます。</li>
		<li>解剖はさみを使用して、後ろ足の coxa の先端をカットします。 注:Coxa と転子間の接続交差点をカットします。Coxa の他の部分の切除は体液を収集するために効率が低下します。</li>
		<li>中指で軽く腹部を圧迫し、10 μ L マイクロ ピペットを使用して切開から出血体液を収集します。</li>
		<li>微量遠心チューブにいくつかゴキブリ (5 人) から体液をプールします。 注:マイクロ遠心チューブ用メラニン化を防ぐために氷の上を保ちます。男性のゴキブリから得られた体液量の平均は 2-3 μ L です。</li>
		<li>10、ベンチトップ遠心分離と簡単に体液をスピン s。</li>
		<li>(すなわち、10 μ L)、体液の適切なボリュームを転送し、1 x 昆虫生理食塩水バッファーの 50 μ L でそれをミックスします。</li>
		<li>血球スピンダウンに 4 ° C で 1,000 x g で 10 分間遠心します。きれいな遠心チューブに上清を転送します。</li>
		<li>A28015を測定することにより微量紫外可視分光光度計を使用して総蛋白質濃度を定量化します。</li>
		<li>同じタンパク質濃度 (6 mg/μ L の総蛋白) を持っている各サンプルを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
腸ジュース コレクション
	<ol>
<li>氷の上のゴキブリを麻酔します。ゴキブリ腹側解剖皿の上で固定冷たい 1 x 昆虫生理食塩水バッファー昆虫ピンを使用します。</li>
		<li>高級ピンセットで腹部を解剖します。昆虫生理食塩水バッファー × 1 新鮮な料理に全体腸 (フロント、中間、および後肢腸を含む) を削除します。</li>
		<li>前部および後ろ足の腸を削除し、100 μ L 昆虫生理食塩水バッファーを含む微量遠心チューブに腸をすばやく転送します。</li>
		<li>同じ管で 10 の渦 6 ゴキブリから蚊をプール s。</li>
		<li>スピン ・ ダウン血液細胞と腸の組織に 4 ° C で 1,000 x g で 10 分間遠心します。きれいな遠心チューブに上清を転送します。</li>
		<li>A28015を測定することにより微量紫外可視分光光度計を使用して総蛋白質濃度を定量化します。</li>
		<li>同じタンパク質濃度 (6 mg/μ L の総蛋白) を持っている各サンプルを調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA 劣化分析
<ol><li>新鮮な裸の dsRNA の dsRNA リポプレックス (1 μ g) 4 μ L を準備します。</li>
	<li>体液、または腸から dsRNA 抽出ソリューション昆虫生理食塩水バッファー (コントロール) の 10 μ L の酵素ジュースをミックスします。</li>
	<li>2 μ L の酵素活性を阻害するコントロールとして試料を分離するグリコールエーテルジアミン四酢酸 (20 mM) または RNase フリー水のいずれかを追加します。</li>
	<li>1 時間 (6、12、または 24 時間以上) 25 ° C でインキュベートします。</li>
	<li>200 μ L の抽出試薬と 40 μ L のクロロホルム、渦、追加します。</li>
	<li>4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心し、新しい微量遠心チューブに上清 (150 μ L) を収集します。</li>
	<li>150 μ L のイソプロパノールを追加し、氷で 15 分間インキュベート dsRNA を沈殿させます。</li>
	<li>4 ° C で 13,000 × g で 15 分間遠心し、上清を除去します。</li>
	<li>DsRNA ペレットを洗浄する 70% エタノール 200 μ L を追加します。4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心</li>
	<li>エタノールを削除し、エタノールの洗浄ステップを繰り返します。</li>
	<li>エタノール、10 μ L の RNase フリーの水で 3 分再懸濁します dsRNA の遠心濃縮、乾燥 dsRNA ペレットを削除します。</li>
	<li>1.5% の agarose のゲルの電気泳動によって扱われた dsRNA の整合性をチェックします。</li>
</ol>5. dsRNA の内服
<ol><li>ドライフード (犬の食事) の自由食事にゴキブリを維持します。DsRNA 摂取実験の前日、ゴキブリから水の供給を奪います。</li>
	<li>フレキシブル鉗子 (図 1、ステップ 5) でその翼を掴んでゴキブリを保持します。 注:ゴキブリの体の部分をつかむか。</li>
	<li>セクション 2 の説明に従って、フィード dsRNA リポプレックスとして裸の dsRNA を準備します。 注:前に餌、dsRNA リポプレックスをたて準備されるべき。</li>
	<li>フィードの dsRNA リポプレックスまたは裸の dsRNA の 4 μ L (250 ng) マイクロ ピペットで。</li>
	<li>ゆっくりピペット dsRNA ソリューションの液滴、ゴキブリの口器に近いし、ゴキブリは完全に液滴を摂取します。</li>
	<li>8 日か 16 日間連続 (1 h 点灯後、消灯前に 1 h) は 1 日 2 回の摂取実験を実行します。 注:ゴキブリは水だけ摂取実験中に dsRNA のソリューションまたはコントロール試薬 (例えば、ヌクレアーゼ フリー水、ブドウ糖溶液、リポソーム試薬) とマニュアル給餌を取得しました。</li>
	<li>ゴキブリに dsRNA 実験の摂取の 16 日後の水のボトルを提供します。</li>
</ol>6. ノックダウンを評価します。
<ol><li>選択した時にポイント (dsRNA 摂取試験後 2、9、17 日) は dsEGFP と dsTub 扱われる昆虫を収集そして選ばれた組織 (例えば腸) を解剖します。</li>
	<li>量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) を実行します。QRT PCR 増幅条件およびプライマー情報林らによって報告されました。(2017)12。</li>
	<li>コントロールと死亡を確認し、移動は、もはやゴキブリを削除は毎日昆虫 dsRNA 治療を評価します。</li>
</ol>

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</ol>

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このプロトコルは、ドイツのゴキブリの中腸ジュースのリボヌクレアーゼ消化に対する保護を含む dsRNA リポプレックスの口頭配達を通じて効果的な RNAi のメソッドを示します。様々 な昆虫の種の他の研究のように、dsRNA8,9,10の劣化による dsRNA の口頭配達を通じて貧しい RNAi 効果がほとんどを占めています。このプロトコルには、腸内で分解に対して dsRNA の経口デリバリーにおける保護車としてリポソームが生成されます。さらに、dsRNA リポプレックスの準備は、簡単な口腔 RNAi として容易に適用できる特に腸内で強いリボヌクレアーゼ活性を持つ昆虫。
このプロトコルは異なる昆虫10,18,19で...

RNAi は、多くの真核生物1の dsRNA の分子によってトリガーされる転写後サイレンシング経路の機構を通じてノックダウン遺伝子発現する効果的な方法として実証されています。過去の研究では、RNAi オゾン注入を介して特定の遺伝子発現および/または昆虫2,3のさまざまな分類群の dsRNA の供給によって動作する開発から遺伝子の機能を研究するための有用なツールとなっています。特異性と破壊効果の頑健性のため、RNAi のアプリケーションは現在害虫制御管理4、5のための潜在的な戦略として検討されています。ただし、RNAi の効率は昆虫種間対象別の遺伝子と配信方法によって異なります。証拠の成長するボディは、リボヌクレアーゼによる劣化は、dsRNA の不安定性 RNAi5,6の限られた有効性の重要な要因であることを示唆しています。例えば、 Manduca sextaの RNAi の感度が低いは、体液混合 dsRNA が 1 時間7内ですぐに劣化したという事実によって説明されています。同様に、効率的に摂取された dsRNA が低下する、中腸でアルカリ性の核酸分解酵素の存在の異なる昆虫8,9,10で RNAi 効率が低い相関が強い。
DsRNA の口頭配達は害虫制御戦略の RNAi のアプリケーションの特に興味深いですが中腸における核酸による dsRNA の劣化を遅らせる方法はまだ開発されていない、有効なことを確認する可能性のあるだろうRNAi を介して供給します。ただし、dsRNA、カイコ、例えば50 μ g の大量の餌やイナゴ種で 8 日間 (合計 8 dsRNA μ g)、継続的に供給で dsRNA の口頭配達する RNAi の応答が報告されています。チャバネゴキブリ germinicaチャバネゴキブリが dsRNA11,12,13,14、注入による RNAi に敏感を介して供給 dsRNA に敏感ではないです。最近では、林ら(2017) は dsRNA カプセルこと成功した rnai ノックダウンするリポソーム キャリア結果とα-チューブリン遺伝子発現15チャバネゴキブリの中腸とトリガー有意な死亡率を示しています。中腸における dsRNA の劣化は、口腔の RNAi のための制限要因は、リポソーム キャリア劣化は、腸内で強いヌクレアーゼ活動とその他の昆虫に適用が容易ですから dsRNA を保護する手段として役割を果たします。注特定のトランスフェクション試薬を選ぶ理由の現在のプロトコルのリポソーム キャリアはそれは毒性が少なく、昆虫の細胞ラインの transfection のためテストされていますを使いました (材料の表を参照) によると、節してください。Gharaviらの異なるリポソーム トランスフェクション システムとの比較によって(2013)16、株小さい干渉の RNA (siRNA) の効率はおよそこれと他の昆虫の17,18 dsRNA 配信システムに使用されている他の市販システム間で同じ.さらに、私たちの供給法は各ゴキブリで dsRNA の適切な量を摂取し、結果が得られる堅牢で確認をように十分注意してください。要約すると、議定書と結果を示す、dsRNA リポプレックスを使用して dsRNA の安定性を向上させる将来的に害虫駆除のための有望なアプローチである、RNAi の戦略の口頭配達のデザインへの扉を開きます。

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro トランスフェクション試薬</td><td>シグナジェン</td><td>リポプレックス製剤用</td><td>SL100499</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>PCR</td>Fast SYBR Green Master Mix ABI の <td>BTQ-201</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>4385612</td><td>for qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>for 3' UTR identification&nbsp;</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 転写キット</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>AMB13345 dsRNA合成用</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>dsRNAからDNAテンプレートを削除</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>15596018 dsRNAまたはトータルRNA抽出用</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>トータルRNAからDNAテンプレートを削除&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>dsRNAまたは全RNA抽出用</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>dsRNAまたは全RNA抽出用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>dsRNAまたは全RNA抽出用</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート、DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>RNaseフリー水調製</td></tr><tr><td>グルコース溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>リ</td><td>ポプレックス製剤用</td>G3285</tr><tr><td>塩化ナトリウム、NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>昆虫生理食塩水処方</td></tr><tr><td>塩化カリウム、KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>昆虫生理食塩水処方</td></tr><tr><td>塩化カルシウム、CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>昆虫生理食塩水処方</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物、MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>昆虫生理食塩水処方</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>酵素阻害剤&nbsp;</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>ゴキブリ解剖</td></tr><tr><td>ファインピンセット</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>ゴキブリ解剖</td></tr><tr><td>フレキシブルピンセット</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>ゴキブリの抱え方&nbsp;</td></tr><tr><td>ピペットマン</td><td>レイニン</td><td>P10</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>用微量遠心チューブ</td><td>Axygen MCT175C</td><td>, PCR02C</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>用ピペットチップ&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>Minispin 遠心分離機</td><td>Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>液体スピンダウン用&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>pH メーター&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>pH調整</td></tr><tr><td>マイクロボリューム分光光度計</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>核酸定量</td></tr><tr><td>PCRサーマルサイク</td><td>ラーABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>テンプレートPCR用、または&nbsp; dsRNA合成インキュベーション&nbsp;</td></tr><tr><td>定量的リアルタイムPCR</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne plus</td><td>遺伝子発現量</td></tr> 遠心<tr><td>真空濃縮器</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>dsRNA または total RNA extraction</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>によるリアルタイムPCRサンプルローディング&nbsp;</td></tr><tr><td>アガロース I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>核酸電気泳動</td></tr><tr><td>用 tub 遺伝子 specfifc フォワード プライマー</td><td>tri-I バイオテクノロジー</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>タブ遺伝子 specfifc リバース プライマー</td><td>トライ I バイオテック</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub テンプレート フォワード プライマー</td><td>トライ I バイオテクノロジー</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTubテンプレートリバースプライマー</td><td>トライIバイオテクノロジーTAA</td><td></td><td>、TAC、GAC、TCA、CTA、タグ、GGTT、GCT、GCT、GTC、TCG、CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFPテンプレート フォワードプライマー</td><td>トライアイ</td><td></td>バイオテクノロジー <td>TAA TAC GAC TCA CTA タグ ggt atg gtg agc aag ggc gag</td></tr><tr><td>gag dsEGFPテンプレート リバースプライマー</td><td>トライアイバイオテクノロジー</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA タグ ggt ggc gga tca tga アグト TCA CC</td></tr><tr><td>タブ qPCRフォワードプライマー</td><td>トライアイバイオテクノロジー</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>タブ qPCRリバースプライマー</td><td>トライ</td><td></td>アイ バイオテクノロジー <td></td></tr><tr><td>ef1 qPCR フォワードプライマー</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

rna 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 rna の経口デリバリー

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA 干渉 (RNAi) 多数の遺伝子の生物学的機能を暴くため広く用いられてきた、重要な遺伝子発現の中断動作害虫コントロール ツールとして想定されました。二本鎖 RNA (dsRNA) を正常に配信のインジェクション、給餌と、浸漬など、さまざまな方法が報告されている dsRNA の経口デリバリーによる RNAi の効率は非常に異なる昆虫グループ間で可変。チャバネゴキブリチャバネゴキブリは、以前発表された多くの研究で示されている dsRNA の注入に非常に敏感。本研究では、リポソーム キャリアとカプセル化された dsRNA が腸ジュースで dsRNA の劣化を遅らせるに十分であることを示す方法について説明します。とりわけ、大幅リポソームによってカプセル化された dsRNA の連続的供給、中腸におけるチューブリンの発現を減少させる、ゴキブリの死をもたらした。結論としては、定式化と核酸に対して dsRNA を保護する dsRNA リポプレックスの利用かもしれない害虫制御のための RNAi の実用的な使用、将来的に。

DsRNA の経口配信用プロトコルの簡易方式はで示した図 1、dsRNA リポプレックスの準備のため、主要な手順が表示されます。
チャバネゴキブリ、dsTub リポプレックス腸ジュースで培養を行った前のヴィヴォアッセイおよび dsRNA の整合性の中腸ジュースの dsRNA の劣化にリポソーム キャリアによって与えられる保護を調査するためにその後、1.5% の agarose のゲルに行った。図 2に示すリポソーム キャリア前のヴィヴォで 1 時間、少なくとも劣化に対して dsRNA を保護することができたに対し、強力な RNA のヌクレアーゼ活性チャバネゴキブリ(図 2A) の腸...

この原稿は、リポソームにカプセル化された二本鎖 RNA の経口摂取によってドイツのゴキブリの中腸における遺伝子発現の減少を示しています。

RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

このプロトコルの全体的な目標は、リポソームキャリアにカプセル化された二本鎖RNAの経口摂取によるRNA干渉を使用して、ゴキブリの腸内での遺伝子発現を枯渇させることです。この方法は、オープンフィールドで必須遺伝子をノックダウンして害虫を殺すことができるかなど、新しい害虫駆除方法の開発における重要な質問に答えるのに役立ちますか?この技術の主な利点は、リポソームが遺伝子特異的な二本鎖RNAを保護し、標的細胞への送達を確実に行うことです。この手順を実演するのは、ポスドクのJia-Hsin Huangと私の研究室の技術者であるYun Liuです。まず、ゴキブリが3分間動かなくなるまで氷の上で麻酔をかけます。次に、親指と人差し指を使って昆虫を拾い上げ、腹側にアクセスします。次に、解剖ハサミを使用して、後肢のコクサの先端をコクサと転子の間で切り取ります。股関節の他の場所で切断すると、血リンパ収集の効率が低くなります。次に、10マイクロリットルのマイクロピペットを切開部に配置し、出血している血リンパを引き出しながら腹部を優しく圧迫します。5匹のゴキブリからの血リンパが1本の微量遠心チューブに集められるまで、このプロセスを繰り返します。次に、プールされた血リンパを10秒間簡単に回転させます。次に、10マイクロリットルの血リンパ液と50マイクロリットルの1x昆虫生理食塩水バッファーを組み合わせます。次に、希釈した血リンパ液を10分間遠心分離して、血球を溶液から引き出します。次に、上清を新しいチューブに移します。最後に、微量UV-Vis分光光度計を使用して総タンパク質濃度を定量化し、各サンプルの濃度をマイクロリットルあたり6ミリグラムのタンパク質に調整します。中腸液を集めるには、まず、氷の上でゴキブリに麻酔をかけます。次に、1つを冷たい1x昆虫生理食塩水バッファーを充填した解剖プレートに移し、昆虫ピンを使用して腹側を上にして固定します。次に、細いピンセットを使用して腹部を解剖します。次に、腸全体を取り出し、1x昆虫生理食塩水バッファーを入れた新鮮な皿に移します。次に、作物とマルピーギ尿細管の間の領域である中腸を分離します。これを行うには、動物の前部を取り外し、後腸を取り外してください。次に、中腸を100マイクロリットルの昆虫生理食塩水バッファーを備えたマイクロ遠心チューブにすばやく移します。6匹のゴキブリから中腸を同じチューブに集めます。次に、チューブを10秒間ボルテックスします。次に、混合物を10分間遠心分離して、血球と腸組織を分離します。次に、上清を清潔な微量遠心チューブに移し、濃度をマイクロリットルあたり6ミリグラムのタンパク質に調整します。二本鎖RNAリポプレックスは、調製後1時間以内に使用する必要があります。その調製時には、希釈した試薬と希釈した二本鎖RNAを同時に組み合わせてください。次に、混合物をすばやくボルテックスしてインキュベートします。準備ができたら、4マイクロリットルの二本鎖RNA溶液をコントロールとして10マイクロリットルの昆虫生理食塩水バッファーと混合するか、血リンパ液または中腸液から採取した10マイクロリットルの抽出酵素と混合します。次に、2マイクロリットルのEGTAを添加して酵素阻害コントロールを行います。それ以外の場合は、2マイクロリットルのRNaseフリー水を追加します。その後、サンプルを摂氏25度で1時間以上インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの抽出試薬と40マイクロリットルのクロロホルムを加え、次にボルテックスを加えます。次に、サンプルを10分間遠心分離します。次に、各上清150マイクロリットルを新しいチューブに移し、150マイクロリットルのイソプロパノールを添加し、サンプルを氷上で15分間インキュベートすることにより、各サンプルから二本鎖RNAを沈殿させます。インキュベーション後、サンプルを再度遠心分離し、上清を捨てます。次に、各ペレットに200マイクロリットルの70%エタノールを加え、チューブを遠心分離することにより、RNAペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、遠心真空濃縮器を使用して二本鎖RNAペレットを3分間乾燥させます。次に、ペレットを10マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。最後に、1.5%アガロースゲルを使用して、処理した二本鎖RNAの完全性を確認します。ゴキブリに1日2回、照明をつけてから1時間後と照明が消える1時間前に餌をやります。これを8日間または16日間休憩なしで行います。この間、ゴキブリはそうでなければ水が不足するはずです。給餌には、新たに調製した二本鎖RNAリポプレックスと裸の二本鎖RNAを用意してください。ボーラスには、4マイクロリットルの二本鎖RNAリポプレックスまたは250ナノグラムの裸の二本鎖RNAと一緒に使用します。.ゴキブリに餌をやるには、まず、柔軟な鉗子を使用して翼でゴキブリをつかみます。ゴキブリの体の部分をつかまないでください。次に、溶液の液滴を口器の近くでゆっくりとピペットで動かし、ゴキブリが液滴を摂取するのを観察します。最後の給餌後、ゴキブリに水筒を用意します。給餌期間中は、昆虫を毎日評価して死亡率を確認し、実験から動かなくなったゴキブリを取り除きます。二本鎖浴槽リポプレックスの継続的な経口投与により、中腸でのチューブリン発現を9日目の40%から17日目の60%に減少させることができました。.それに比べて、裸の二本鎖RNAは効果がありませんでした。これは、裸の二本鎖RNAを中腸液に曝露すると1時間以内に分解されるのに対し、リポソーム結合二本鎖RNAは安定していることがわかったためである可能性が高いです。RNAレベルが低下しただけでなく、チューブリン二本鎖RNAリポプレックスの継続的な供給も重大な致死率をもたらしました。これはベクターによるものではなく、二本鎖RNAをEGFPに運ぶリポプレックスは致死性をもたらさなかった。このRNA干渉の経口送達システムを試みる際には、二本鎖RNAを数日間連続して供給することが重要です。一度習得すると、給餌ステップは適切に実行されれば、昆虫ごとに2分で行うことができます。必要に応じて、リポソームナノ粒子の異なる製剤を適用して、供給手順とRNAi効率を改善することができます。最終的に、この技術により、害虫管理の分野の研究者は、RNAiを使用して新しい防除戦略を探求することが可能になりました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

RNA干渉は、遺伝子の機能を解析することは非常に効果的であることが証明されています...

dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

ここでは、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の使用を通じて疾病媒介蚊で遺伝子機能を阻害するための手順を記述している。...

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ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。...

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA)...

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

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Chitosan/dsRNAナノ粒子送達によるカイコ Bombyx mori の幼虫RNA干渉

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HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

学ぶ リポソームキャリアを用いたRNA干渉法によるドイツゴキブリの中腸遺伝子発現抑制技術。経口投与による害虫防除戦略の新たな可能性を探索し、標的遺伝子の機能解析と持続的な害虫管理手法の開発に貢献します。

RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソームキャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

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RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

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