虹彩ルベオーシスのマウス モデルとして虹彩新生血管を穿刺誘発
2018年3月8日
虹彩新生血管、網膜虚血性疾患の一般的な合併症は、血管新生緑内障の視力を脅かす可能性があります。ここでは、血管新生調節物質の非侵襲的評価に使用するかもしれない実験虹彩血管新生を誘導するためのマウス プロトコルについて述べる。
この手順の全体的な目標は、虹彩血管系を誘導することであり、これにより血管新生プロセスの生体内直接可視化が可能になります。この方法は、眼科分野、特に血管新生疾患における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、アルビノマウスを利用して血管の生体内可視化を指示できることです。
この方法により、眼の新生血管疾患についての洞察を得ることができます。また、新しい血管新生療法の試験など、血管新生の一般的なモデルとしても適用できます。マウスの目のサイズが小さいため、虹彩の解剖は困難であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。
しかし、練習すればマスターすることができます。P12.5マウスに麻酔をかけ、処置の準備をした後、ステレオスコープの下で横臥位に置き、マスクが適切に配置されていることを確認します。目は視野を埋める必要があります。
目の焦点をはっきりさせることが不可欠です。次に、利き手ではない手で小さな結束鉗子を使用して、まぶた、背側と腹側に下向きの圧力を加えて、慎重に目を突き出します。まぶたをしっかりと握り続けると効果的です。
先に進む前に、血管系を40倍で写真に記録します。次に、ステレオスコープを使用して角膜辺縁部を見つけます。アルビノBALB/cマウスの輪部は、角膜の後方にある円形血管神経叢として容易に識別できます。
次に、利き手で30ゲージの斜めの針を持ち、それを使用して、毛様体とオラセラタの間のブドウ膜の後縁限界近くで小さなブドウ膜穿刺を行います。針の先端のみを使用し、斜角の半分以下を使用して穿刺を行います。レンズの破裂を避けてください。
穿刺はセルフシールする必要がありますが、それでも創傷を通して研究物質の眼内注射を可能にします。次に、目の反対側の部位で2回目のブドウ膜穿刺を行います。穿刺を最適化して、最も背側と最も腹側の位置になるようにします。
P24.5まで4日ごとに同じ2つの位置でブドウ膜穿刺を繰り返します。また、穿刺を繰り返す前に、必ず外傷性白内障がないか確認してください。眼球を摘出し、テキストプロトコルに記載されているように固定した後、固定液を取り出し、新鮮なPBSで眼を3回すすいでください。
次に、前房を上にして、滑らかで乾燥した表面に目を置きます。次に、斜めの30ゲージの針をリンバスの後方に挿入して、エントリーポイントを作ります。次に、小さな結束鉗子で前部を固定し、Clayman-Vannasのまっすぐなハサミを使用して、目を回転させながら輪部の周りを切り取ります。
パーシャルカットを使用すると、プロセスが容易になります。完了すると、目の後部が解放されます。次に、前眼部を下にしてレンズを露出させます。
レンズを小さな鉗子でつかんで上に引っ張って、レンズを慎重に取り外します。次に、角膜を下に向けて、カットを視野に対して垂直になるように、前眼部を配置します。次に、利き手ではない手で小さな結束鉗子を使用して、毛様体の後方にある組織をそっとつかみます。
Clayman-Vannasは、小柱網を取り除き、虹彩を分離することを目的として、毛様体のすぐ前方をトリミングするストレートハサミです。その後、虹彩は角膜内を移動するはずです。次に、小さな結束鉗子を使用して角膜をつかみ、前眼カップを200マイクロリットルのPBSを含む96ウェルプレートに慎重に移します。
角膜を握ったまま、PBSで組織を洗い流すことにより、虹彩の解剖を続けます。必要に応じて、30ゲージの針を使用して虹彩を変位させることができます。次に、小さな結束鉗子を使用して角膜を取り除きます。
分離された虹彩は、実験が行われるまで一時的に摂氏4度のPBSに保存できます。P12.5のAlbino BALB/cマウスは、記載されているように、P24.5まで4日ごとに繰り返されるブドウ膜穿刺を受けました。角膜の透明性とBALB/cマウスのメラニン欠乏症により、虹彩血管系はP16.5の子犬で容易に見え、プロトコルの期間中、硬化します。
P27.5で、マウスを安楽死させ、その虹彩を注意深く解剖しました。穿刺は、創傷治癒系をトリガーすることにより、虹彩からの血管反応を誘発しました。免疫組織化学をPECAM1に対して行った。
結果として生じる染色は、対照と比較して、穿刺された眼の虹彩の全体的な血管系の増加を示しました。このビデオを見た後、虹彩血管新生を誘導し、マウスの虹彩をうまく分離する方法をよく理解しているはずです。この手順に続いて、血管新生促進性物質または抗血管新生物質の有効性をテストするなど、追加の分子的および細胞上の質問に答えるために、QBCRのような他の方法を実行できます。
その開発後、この技術は、研究者が小さなげっ歯類をモデルとして、生体内の非侵襲的な方法で血管新生疾患を探求する道を開きました。
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概要
本記事では、虚血性網膜疾患や新生血管緑内障に関連する病態である虹彩新生血管を誘導するためのマウスプロトコルを紹介します。この手法により、虹彩血管系をin-vivoで直接可視化し、血管新生調節物質の非侵襲的な評価が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 眼科学
- 血管新生
- 新生血管疾患
背景
- 虹彩の新生血管は視力を脅かす可能性があります。
- 血管新生を理解することは、治療法を開発する上で極めて重要です。
- アルビノマウスの使用により、血管の可視化が容易になります。
- マウスの眼球はサイズが小さいため、虹彩の解剖には困難が伴います。
研究の目的
- in-vivo研究のために虹彩血管を誘導すること。
- 眼の新生血管疾患に関する知見を提供すること。
- 新しい血管新生治療法を検証すること。
使用方法
- アルビノマウスにおける虹彩新生血管の誘導。
- in-vivo可視化技術。
- 血管新生調節物質の実験的評価。
- 虹彩解剖技術の実演。
主な結果
- 虹彩新生血管の誘導に成功したこと。
- 血管新生プロセスの効果的な可視化。
- 新生血管疾患のメカニズムに関する知見の獲得。
- 新規治療法の試験への潜在的な応用。
結論
- この手法は、虹彩新生血管の研究における有用なツールとなります。
- これにより、眼の新生的血管疾患への理解が深まります。
- 今後の研究において、本モデルを治療法の試験に活用することが可能です。
よくある質問
産業界への有用性
このモデルにより、虹彩における血管新生プロセスの非侵襲的かつ縦断的な評価が可能となり、新生血管治療に向けた初期段階のターゲットバリデーションを支援します。アルビノマウスの目の透明性を活用することで、疾患に関連した眼科的コンテキストにおいて血管新生調節剤を評価するためのスケーラブルなプラットフォームを提供します。このアプローチは、エンドポイントにおける組織学的解析への依存を減らし、前臨床段階の血管新生スクリーニングにおける予測信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：炎症およびプラスミノゲン活性化システムによって誘発される虹彩新生血管形成を通じて、血管新生経路の解析を可能にする。
- 運用的価値：測定可能な血管反応を引き起こす、再現性と自己封止性を備えたぶどう膜穿刺により、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 予測的価値：血管新生の変調をin-vivoで直接的に経時的に可視化することで、メカニズム的なリスク低減を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： PECAM1免疫組織化学染色による定量的な血管新生の読み取り、および透明な角膜を介した非侵襲的な生体内イメージングを可能にする。
- 運用上の価値： P12.5からP24.5まで4日ごとに標準化され再現可能な血管誘導を実現し、アッセイの再現性をサポートする。
- 拡張性の価値： 半透明のBALB/cマウス虹彩のフラットマウント調製に適合し、背景ノイズの少ない高解像度の免疫組織化学的解析を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的価値：糖尿病網膜症の視力喪失を伴う合併症である新生血管緑内障の病態をモデル化し、疾患への関連性を高めます。
- 前臨床における連続性：血管新生促進または抑制物質のin vivoでの試験を可能にし、発見から治療評価への橋渡しをします。
- リスク調整後の進展：血管反応の長期的なモニタリングを可能にし、血管新生の有効性に基づいた進展可否（go/no-go）の決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの仮説検証からモジュレーターの有効性の前臨床検証に至るまで、特に眼科的な新生血管疾患プログラムにおける血管新生の探索プロセスの枠組みに適合します。
- 探索生物学： 虹彩における創傷治癒および炎症トリガーを介して血管新生を誘導し、経路の解明をサポートします。
- スクリーニング： 生体組織の文脈で血管新生物質をスクリーニングするのに適した、再現性のある定量的な血管出力を提供します。
- 分析： PECAM1染色およびin-vivoイメージングによる血管密度と形態の分析を可能にし、条件間の比較評価を促進します。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒトの新生血管緑内障のメカニズムをモデル化し、バイオマーカーに基づいた前臨床検証をサポートします。
- エンタープライズ再利用： 複数の血管新生関連プロジェクトに適用可能な、再利用可能な血管誘導プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 保存された血管新生経路によって駆動される、ヒトのような虹彩新生血管をモデル化することで、ターゲットへの確信度を高めます。
- 運用的価値： 外傷性白内障に対する穿刺タイミング、部位選択、および術後モニタリングを標準化することで、再現性を向上させます。
- 戦略的価値： 早期に非侵襲的な有効性判定を可能にすることで、後期の失敗リスクを低減し、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 生体内での虹彩血管反応に基づき、血管新生候補物質のリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- 立体視下での葡萄膜穿刺および虹彩単離を含む、微小外科手技の専門知識が必要である。
- 精密な組織操作のため、30ゲージの面取り針、結紮用鑷子、Clayman-Vannas剪刀などの器具に依存する。
- モデルの整合性を確保するため、穿刺のタイミング（P12.5からP24.5まで4日ごと）および術後モニタリングの標準化されたプロトコルが必要である。
- 適応上の検討事項として、マウス系統の色素沈着や角膜の透明度の違いが、血管の可視化品質に影響を与える。
- 実用上の制限として、眼球が小さいため虹彩の剥離が技術的に困難であり、確実な組織単離にはトレーニングが必要である。
