通常のコロンと大腸癌 - 改良されたプロトコルから人間の血管内皮細胞の分離

この細胞単離プロトコルの全体的な目標は、腫瘍と対応する正常な結腸の両方から、結腸直腸癌に罹患している患者から純粋で生存可能な内皮細胞を得ることです。この方法は、結腸直腸腫瘍形成に対する血管系の影響を推定および分析するなど、腫瘍生物学および血管新生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、結腸直腸癌患者から純粋で生存可能なヒト内皮細胞を得るのに比較的高い成功率を持てることです。

結腸直腸癌患者から組織標本を採取するには、新鮮なメスを使用して、約1グラムの重さの組織片を入手します。次に、滅菌鉗子を使用して、新鮮な組織片を40ミリリットルの氷冷HBSS緩衝液と抗生物質を含む50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、別々の滅菌鉗子を使用して、癌腫と正常組織を一方の遠心分離管から別の遠心分離管に順次移し、40ミリリットルの氷冷HBSS緩衝液を抗生物質で4回洗浄します。

脂肪、非腫瘍性組織、または壊死の可能性のある組織部分をすべて除去するには、滅菌鉗子を使用し、組織片を滅菌細胞培養ペトリ皿に移します。次に、抗生物質を添加したHBSSバッファーを3〜5ミリリットル加えて、組織片を湿らせておきます。次に、新しいメスを使用してティッシュピースを切り取ります。

次に、湾曲した刃のメスを使用して、残りの組織を細かく刻みます。細かく刻んだ組織片を、予め加温した細胞培養培地で満たされた組織解離チューブに移します。メーカーの指示に従って、組織解離器とヒト組織用の腫瘍解離キットを使用して、細かく刻んだ組織片を解離します。

最初の重要なステップは、正しいサイズと組織タイプの組織片を得るために、手術標本を正しく処理し、顕微鏡で解剖することです。組織片を解離した後、室温で重力300倍で1分間遠心分離します。次に、血清ピペットを使用して、あらかじめ温めた 10 ミリリットルの DMEM Low medium を MACS チューブに加えます。

次に、チューブから細胞懸濁液を、50ミリリットルの遠心分離チューブの上に100マイクロメートルの細孔サイズを設定した細胞ストレーナーに注ぎます。MACSチューブにさらに10ミリリットルのDMEM Low培地をピペットで入れ、遠心分離チューブのストレーナーを介してチューブから追加の細胞を洗い流します。細胞懸濁液全体をろ過したら、さらに10ミリリットルのDMEM Low培地でセルストレーナーを洗浄します。

細胞懸濁液を室温、重力300倍で7分間遠心分離します。その後、遠心分離が終わったら上清を捨てます。次に、細胞ペレットを、同じ50ミリリットルの遠心分離チューブ内で、事前に加温したEBM-2-MV培地を補充した5ミリリットルの抗生物質に溶解します。

培養フラスコからコーティング溶液を取り出し、細胞懸濁液を摂氏37度、二酸化炭素5%に維持されたT-25培養フラスコに直接移します。コンフルエント度が約80〜90%に達したら、フラスコ内の細胞を切り離すために1ミリリットルのAccutaseを追加します。その後、細胞をアキュターゼで10分間放置します。

次に、37°Cに維持したEBM-2-MV培地を4ミリリットル細胞に加えます。次に、10〜25マイクロメートルの範囲の自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントします。2 番目に重要なステップは、セルを分割する必要があるすべてのステップです。

正しい時点を見積もるには経験が必要です。分裂が早すぎると、細胞は死滅します。分裂が遅すぎると、内皮細胞が老化したり、線維芽細胞の異常増殖が問題になります。

次に、室温で重力250倍で細胞を4分間遠心分離し、実行の最後に上清を排出します。次に、細胞ペレットを予め加温したFACS緩衝液に溶解します。次に、FACS染色抗体を細胞に添加します。

混合し、続いて室温で合計15分間インキュベートします。このインキュベーション期間の半分が終わったら、チューブを一度フリックします。血清学的ピペットを使用して、標識した細胞懸濁液に2ミリリットルのFACSバッファーを加えます。

次に、細胞懸濁液を室温、重力250倍で4分間遠心分離し、遠心分離終了後に上清をデカントします。次に、2ミリリットルのFACSバッファーを加えて細胞ペレットを溶解し、細胞懸濁液を室温で4分間、重力の250倍で遠心分離します。次に、ペレットを500マイクロリットルの抗生物質添加EBM-2-MV培地に再懸濁します。

次に、細胞をFACSソーティング装置に移します。トリプルポジティブ細胞を同定し、新鮮な温めたEBM-2-MV培地を充填した24ウェル培養皿に播種します。細胞を次の48時間培養し、その後、培地を更新します。

5〜10日でコンフルエント度が90〜100%に達するまで、2日ごとに培地を交換し続けます。次に、目的の培養皿に従って細胞集団を拡大します。次に、合流点に達したら収穫し、特性評価に進みます。

まず、得られた腫瘍標本を解離し、細胞培養皿に播種します。非接着性細胞を洗い流し、接着性細胞をFACSソーティングの前に80〜90%のコンフルエント度まで培養します。次に、FACS解析を行い、免疫標識された生存腫瘍と正常な内皮細胞の集団を同定します。

これを行うために、正常細胞と腫瘍内皮細胞の蛍光色素共役抗体特異的トリプルラベリングが行われ、FACSを介して選別されます。ソーティングされた全細胞集団の平均3.6%と5.6%が腫瘍細胞と正常内皮細胞です。次に、内皮細胞マーカーの発現を同定するために、得られた正常内皮細胞および腫瘍内皮細胞を免疫細胞化学に供する。

この画像は、CD31陽性の正常細胞と腫瘍内皮細胞を示しています。次に、内皮細胞のCD31陽性集団からRNAを単離し、RT-qPCRにかけて他の内皮細胞特異的マーカーを同定します。グラフからは、CD105、VE-カドヘリン、フォン・ヴィレブランド因子などの内皮細胞マーカーの発現も検出されますが、汚染の可能性のある細胞集団からのマーカーの発現は不足しており、単離された内皮細胞培養の純度を示しています。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば約3週間で習得できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、細胞をいつ、どの比率で分割するか、またはFACSソーティング分析のためにさらに処理できるかを推定するために、初代内皮細胞培養の経験を必要とするため、苦労するでしょう。この技術の意味は、細胞培養を使用して結腸直腸癌の腫瘍形成治療応答または耐性のメカニズムを特定できるため、結腸直腸癌の治療にまで及びます。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ヒトの固形腫瘍から真に純粋で生存可能な内皮細胞を確立することの問題点を指摘する複数の文献を読んだときでした。FACSソーティング分析のための組織マイクロダイセクションまたはプロセッシングのステップ、または内皮細胞のさらなる分裂のステップは、正しい時点を推定するために経験を必要とするため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を試みる際には、まず、外科、病理、および腫瘍登録との機能的な協力ネットワークを確立することが重要です。

さらに、初代内皮細胞培養物は壊れやすいため、運動の訓練を受ける必要があります。このビデオを見た後、ヒト結腸直腸癌および対応する正常な結腸から内皮細胞を分離する方法を十分に理解しているはずです。