レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャ レーザーマイクロダイ セクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)

この分析手法の全体的な目標は、結核肺病変組織コンパートメント内の抗結核薬エタンブトールを定量化して、殺菌薬の濃度に達しているかどうかを判断することです。この方法は、投与された薬剤がすべての肉芽腫組織コンパートメント内の滅菌濃度で細菌集団に到達しているかどうかを判断することにより、結核薬の発見および開発分野の質問に答えることができます。この手法の主な利点は、特定の組織構造および細胞集団内の高空間詳細で薬物濃度を完全に定量化できることです。

組織の切片化と取り付けの手順は、組織汚染の可能性があり、メンブレンスライドの壊れやすい性質のために習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順は、テキストプロトコルで説明されているように、組織採取から開始します。組織切片化を行うには、まずクライオスタットを希望の切断温度に設定します。

ガンマ線照射肺生検をマイナス80°Cの貯蔵庫からクライオスタットに移し、30分間放置して組織温度を平衡化します。ピンセットを使用して、最適な切断温度の接着剤を少量使用して生検をクライオスタットチャックに固定し、組織の基部をチャックに接着します。平らな面が切断のための露出面になるようにティッシュを向けます。

OCTが組織表面を汚染しないことを確認してください。これは、その後の質量分析に支障をきたす可能性があるためです。25ミクロンの厚さで3つの組織切片を切断し、PETメンブレンスライドにマウントします。メンブレンを組織切片にそっと触れ、切片を取り除きます。

圧力をかけすぎると、薄い膜が破れることがあります。PETメンブレンを帯電させず、組織切片の接着を減少させないように、取り付け前にスライドを過度に取り扱わないでください。メンブレンスライドを室温に保つことで、解凍して組織をメンブレンに密着させることができます。

スライドをクライオスタットから取り外し、スライドを3分間風乾させます。LCM-LC-MS/MSをすぐに行わない場合は、スライドを小さな密閉可能な袋に密封し、解剖が必要になるまでマイナス80°Cの保管場所に移します。隣接する切片を10〜12ミクロンで切断し、ヘマトキシリンとエオシンを染色するために標準的なスライドガラスに解凍します。

この時点で、他の望ましい組織化学染色のために追加の切片を切断することができます。スライドの入った密封袋をマイナス80°Cの保管庫から取り出し、室温で5分間待ちます。コールドスライドがすぐに実験室の雰囲気にさらされると、組織が結露で覆われ、薬物の空間的完全性が損なわれる可能性があります。

顕微鏡とレーザーの電源を入れます。レーザーは、切断を開始する前にウォームアップするのに5〜10分かかります。フラットキャップ0.20ミリリットルのPCRチューブをホルダーにセットします。

スライドをバッグから取り出した後、フラットベッドスキャナーを使用してPETスライド上の組織切片の光学画像を撮影します。スライドをスライドホルダーに置き、ティッシュ面を下に向けて置きます。顕微鏡ソフトウェアを使用して、特定の肉芽腫領域に別々のコレクションチューブを割り当てます。

通常、これらは関与していない肺、細胞性肉芽腫、およびカケースですが、肉芽腫生検の特定の病状によって異なる場合があります。5X顕微鏡対物レンズを使用して組織に焦点を合わせます。この倍率は、細胞性肉芽腫領域と壊死性肉芽腫領域の両方を含む組織の良好な概観を提供するはずです。

ソフトウェアで、カゼムと指定されたチューブを選択して、組織の下の位置に移動します。必要な解剖パラメータを入力します。厚さ25ミクロンの肺切片の一般的な設定は、レーザー出力30、速度15、および絞り35です。

ただし、これらは使用する顕微鏡や、レーザーの年齢による出力の低下の可能性によって異なります。フリードローツールを選択し、マウスまたはタッチスクリーンペンを使用して、解剖したい領域の輪郭を描きます。領域の表面積がソフトウェアに表示されます。

選択した領域を500、000平方ミクロン未満に保ち、解剖を容易にします。チューブキャップに合計300万平方ミクロンが集まるまで、解剖を繰り返します。場合によっては、解剖された領域が周囲の膜に付着したままで、収集キャップに入らないことがあります。

これらの領域を累積表面積の合計から削除するには、ソフトウェア内で手動で選択して削除します。次に、細胞病変用のキャップを選定し、同じプロセスで300万平方ミクロンの組織を採取します。関与していない肺のキャップを選択し、同じプロセスを使用して300万平方ミクロンの組織を採取します。

関与していない肺組織には、多くの細気管支と肺胞腔が含まれていることに注意してください。これらを定義された組織領域から除剖するように細心の注意を払ってください。キャップホルダーを取り外し、各チューブのクリップを慎重に外し、密封し、ラベルを付けます。

解剖した組織を周囲の空気の乱れから保護します。解剖した組織はすぐに分析するか、摂氏マイナス80度で保存し、解凍してから処理およびLC/MS分析を行います。組織密度を1ミリリットルあたり1グラムと仮定して、50ミリグラムのコントロール組織を秤量し、PBS緩衝液を添加して希釈することにより、ホモジネートストックを調製します。

ビーズホモジナイザーで肺組織とPBSバッファーを1750rpmで5分間ビーズで叩くことにより、組織をホモジナイズします。次に、1ミリグラム/ミリグラムの薬物ストックを1対1のアセトニトリル/水で希釈し、標準曲線のスパイク溶液を作成します。スパイク容量と標的組織容量に基づいて、スパイク標準濃度を決定します。

図の例は、10マイクロリットルのスパイク容量を使用した100ナノグラム/ミリリットルの標準です。マイクロダイセントされた組織を含むチューブをマイナス80°Cの保管から取り出し、室温で5分間待ちます。10マイクロリットルの1対1のアセトニトリル/水溶液と2マイクロリットルのPBSバッファーを、マイクロディスセッション組織を含むチューブに加えます。

標準曲線および品質管理チューブの場合は、10マイクロリットルのスパイク溶液を2マイクロリットルのコントロール肺ホモジネートに加えます。各チューブに50マイクロリットルの抽出溶液を追加します。各チューブを5分間ボルテックスします。

その後、5分間超音波で洗います。次に、チューブを5, 000rpmで5分間遠心分離し、各チューブにフィルムと組織のペレットを形成します。遠心分離後、50マイクロリットルの上清を96ウェルのディープウェルプレートに移し、各ウェルでさらに50マイクロリットルの脱イオン水で希釈します。

最後に、テキストプロトコルに記載されているように、LC-MS/MS 分析と分析法バリデーションを実施します。LCM-LC/MS法は、エタンブトールをスパイクした組織ホモジネートからレーザーマイクロダイセクション領域を分析することにより、最初にバリデーションされました。ここに示すように、この方法は再現性が高く、優れた薬物回収率を示しました。

複数の肺組織でLCM-LC/MSによって測定されたエタンブトール濃度は、確立されたLC/MSアプローチによって決定された濃度と直接比較することにより、さらに検証されました。両方の手法で同等の濃度が検出されました。関与していない肺実質、細胞病変縁、および壊死性カケース内の絶対エタンブトール濃度は、LCM-LC/MSによって決定されました。

結核菌の滅菌レベルは、すべての病変コンパートメントで到達しました。マクロファージ中の細胞外複製桿菌の99%および細胞内桿菌の99%を死滅させるために必要な最小濃度が示されています。このビデオを見れば、定義された肺肉芽腫構造内の組織をマイクロダイセクションし、薬物レベルを定量化する方法について十分に理解できるはずです。

この技術により、抗菌薬研究の分野の研究者は、投与された薬剤が滅菌濃度で標的病原体集団に到達しているかどうかを正確かつ定量的に評価することができます。このアプローチは、多くの異なる組織や病態に幅広く適用できます。