Name: シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶDNA-タンパク質クロスリンク修復の定量アッセイ法。プラスミドDNAを哺乳類細胞にトランスフェクションし、ストランド特異的プライマー延伸とqPCRで修復動態を測定する。DNA損傷応答の理解に有用です。

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この仕事は健康の国民の協会 (ES023350) によって賄われていた。リサ Chesner は、5T32HL007741 のトレーニングの許可によってサポートされます。ナタリア Tretyakova (ミネソタの大学) とアシス Basu (コネチカットの大学) とサポートと初期の中に技術的なアドバイスやこの作品の中間の段階の彼らの研究室のメンバーに感謝します

1. DPC 含むプラスミドの世代
<ol><li>T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (1 μ L) 10 x リガーゼ バッファー (5 μ L) を 10 台と 8-オキソグアニン残渣 (20 μ L) を含むオリゴヌクレオチドの 80 pmol を組み合わせます。50 μ L の総ボリュームに到達し, 温水浴で 30 分の 37 ° C で水を追加します。<ol>
<li>リン酸化オリゴヌクレオチド (50 μ L)、単一座礁させた DNA の 80 pmol を組み合わせる (80 μ L) 10 x Taq 反応バッファー (25 μ L) 100 mM ATP で 100 台 Taq のポリメラーゼ (20 μ L) (20 μ L) 10 mM dNTPs (20 μ L)、NEB バッファー 2 (25 μ L) と 8 μ g BSA (20 μ L) 合計 260 μ L 加温、。75 ° C、15 分 5 分の 37 ° C の順で設定たちのサンプルです。100 mM ATP 60 U の T4 ポリメラーゼ (20 μ L)、8,000 U T4 リガーゼ (20 μ L) を次に、追加 (20 μ L) 10 mM dNTPs (20 μ L)、NEB バッファー 2 (15 μ L) と 8 μ g BSA (20 μ L) 合計 375 μ L。 37 ° C (図 1 a) で一晩反応を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>50: 50 バッファー飽和フェノール: クロロホルム混合物を作成します。各コンポーネントは、ミックスの平等なボリュームを追加し、21,130 x g で 5 分の 2 つの層を形成するバッファー飽和フェノール クロロホルム ドライブ水間のテーブル トップ遠心でスピン: 上部の水様の層と下部、有機層。プライマー拡張反応、ミックス、低、有機層の 375 μ l 添加し 21,130 x g で 5 分間のテーブル トップ遠心でスピンします。 注意: フェノールやクロロホルムが有害物質と、目や皮膚との接触を避けるために講じる必要があります。<ol>
<li>以下の遠心分離、慎重に最上位のレイヤーを抽出し、酢酸アンモニウム 100% エタノールの 2 つの容積で続いて 0.3 M の最終的な集中に追加ミックスします。最低 30 分、または一晩の-20 ° C でソリューションを保存します。</li>
		<li>上澄みの回転の 4 ° C で 15,000 x rpm で 10 分削除テーブル トップ遠心分離機のサンプル、70% エタノール 1 mL にペレットを洗ってください。5 分、上清を除去し、水の 100 μ L でペレットを再懸濁しますの回転の 4 ° C で 15,000 x rpm でテーブル トップ遠心分離機のサンプル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>16 μ L 6 × ゲル読み込み染料で前のステップからの DNA と 34 μ L 水の 50 μ L を組み合わせて、0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドを含むゲル 0.8% 低溶解アガロース電気泳動の対象となります。2 V/cm で 6 h 1 x TAE バッファーのため 10 cm のゲルのゲルを実行します。かみそりの刃と重量を量るゲルのスライス (図 1 a) を使用してスーパー バンドを切除します。閉じた共有、スーパー DNA が移行のためのマーカーとして機能する肯定的な制御を実行します。 注意: エチジウム ブロマイドは、変異原性、皮膚との接触を避けるために講じる必要があります。また、プラスミドのサンプルは UV 光の形成を減らすために紫外線にさらされている時間を最小限にすることが重要です。<ol>
<li>ゲルの重量のすべての mg の 10% β agarase 反応バッファーを追加してゲルのスライスを消化します。65 ° C 10 分と 42 ° c. にクールでインキュベートします。Β agarase の 10 U を追加し、42 ° C 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>次潜伏体積を測定、室温で 15 分間 15,000 × g で 15 分遠心分離機のため氷の上 0.3 M と寒さの最終的な集中に酢酸アンモニウムを追加、上澄みを集め、イソプロパノールの 2 ボリュームを追加します。-20 ° C で一晩冷やします。</li>
		<li>4 ° C でテーブル トップ遠心分離機で 15,000 x rpm で 10 分間の精製、スーパー DNA を遠心し、水の 40 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>36 pmol オキソグアニン グリコシラーゼ (1 μ L) 100 mM の NaCl を含むバッファー内に DNA のクロスリンク 12 pmol (15 μ L) (3 μ L) 1 mM MgCl2 (3 μ L)、トリス塩酸 pH 7.0 (6 μ L) 20 mM と 10 mM ナトリウム シアノ水素化ホウ素 (2 μ L) 37 ° C で 30 μ L の最終巻に到達するには30 分の26。架橋試料 1 μ L を削除し、データ ポイントし、手順 3 で PCR 分析 0 h として機能する水の 500 μ L で希釈します。</li>
</ol>2. kCl/SDS 析出
<ol><li>架橋効率を視覚化するには、制限は、1 μ g を 2 つの異なる大きさで分類された DNA のフラグメントを生成する 1 h 37 ° C で 10 x バッファーに 1 μ Bsp・ ディ ・架橋プラスミドのダイジェストします。 注: 1 つのフラグメントになります架橋タンパク質 (4.4 kb) を他はしません (2.8 kB) (図 1 b)。<ol>
<li>最終濃度 0.5% の両方に SDS を追加、半分でサンプルを分割し、65 ° C で 10 分間インキュベートします。</li>
		<li>KCl を追加 (最終濃度 100 mM) サンプルの 1 つにし、氷上で 5 分間加温します。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間、12,000 × g で両方のサンプルを遠心し、DNA12蛋白質のパーセントの共役を推定する agarose のゲル上培養上清を実行します。 注: KCl/SDS 析出は、品質管理、ない基板の準備に使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 哺乳類細胞にトランスフェクション
<ol><li>6 ウェル プレートで細胞/ウェル プレート 0.5 x 106トランスフェクション前日は。次の日は、無血清培地の 300 μ L で (ステップ 1.6) から DPC を含むプラスミドの 1.5 μ g (30 μ L) をミックスします。別の管でトランスフェクション試薬の 12 μ L と無血清培地の 300 μ L を混ぜます。希釈トランスフェクション試薬 300 μ L 300 μ L 希釈した DNA を組み合わせて、室温で 5 分間インキュベートします。それぞれ 2 つの井戸の錯体の 250 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間以上インキュベート</li>
	<li>次の孵化、メディアを削除、0.6 %sds/0.01 M EDTA の 1 mL を加えるし、10 ~ 15 分こすりゴム警官を使用してセルのために、室温でインキュベート 1.5 mL および microfuge の管に転送。軽く 5 回 5 M の NaCl (最終濃度 1 M) 反転の 200 μ L を追加し、4 ° C 夜間27で孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 30 分間のテーブル トップ遠心 21,130 x g でサンプル、前述のように、培養上清、エタノール沈殿物を収集し、水の 50 μ L で再懸濁します。</li>
</ol>4. SSPE qPCR
<ol><li>各時間ポイント (含む 0 h)、SYBR グリーン PCR マスター ミックス (30 μ L)、水、27 μ、1 μ L (100 pMol) プラスミド (プライマー R、図 2) の損傷の繊維に補足プライマーの x 2 から回復 DNA の 1 μ L を一緒に混ぜます。次の条件を使用して PCR を行う: 最初の 8 サイクルに続いて、90 ° C で 10 分間の前の溶融: 90 ° C、15 s、65 ° C、1 分。サイクルの終了時に 8 は 60 μ L (プライマー L,図 2)28を合計する第二のプライマーの 1 μ L (100 pMol) を追加 (詳細については試薬材料表を参照してください)。</li>
	<li>ミックス 1 μ L 増幅されていないのは、各時間のポイント (0 h 含む)、マスター ミックス (30 μ L)、水、27 μ、1 μ L 各プライマー (100 pMol) 60 μ L の合計の x 2 から DNA を回復しました。</li>
	<li>手順 4.1 と 4.2 (20 μ L/ウェル、3 通) から 96 ウェル PCR プレート サンプルをロードし、上記の条件を使用して 30 のサイクル qPCR を実行します。</li>
	<li>帳票サンプルの各セットの CT 値を平均します。4.2 デルタ各サンプルの CT 値を取得するためのステップの手順 4.1 で生成された CT 値を減算します。任意の背景 (詳細についてを参照してください代表結果セクション) を削除するデルタ CT 値から 0 h 時間ポイントを減算します。</li>
	<li>数式を使用してパーセント修理にデルタ CT 値を変換します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57413/57413eq1v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Protein+Cross-links%3A+Formation%2C+Structural+Identities%2C+and+Biological+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes.</a> Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

SSPE qPCR 法では、1 つ、定義された DPC 病変を含む同種の人口の修理を調べることによって他のアプローチに比べて数多くの利点を提供しています。注目、タンパク質と DNA に蛋白質を接続するために使用化学架橋タイプの id を制御するだけでなくそれは、DPC 病変の導入をシーケンス コンテキストを簡単に操作することが可能です。DPC 導入のどちらかに病変を認め、テンプレートまたはアクティブなプロモーター軌跡の下流にプラスミッドの鎖を符号化の修復に及ぼす影響について解説しました。同様に、含む、HEK293T 細胞にトランスフェクション レプリケーションの SV40 起源 M13 プラスミッドを使用してレプリケーションの DPC 修復に及ぼす影響を調査中です。アッセイ記載直接対策 DPC 修理、直接見積もりを修復ことがない活動24,25ホスト細胞の再活性化など他の戦略とは対照的。さらに、システムは堅牢性、機密、および定量的です。DPC 除去を測定、その他のシステムとは異なりこの試金は完全な修復イベント、すなわちのみを検出、それは DPC 病変が削除されるだけでなく、双方向の DNA の整合性が完全に復元17必要があります。リン酸ジエステル バックボーン内の区切りやニックス脱塩基部位元の DPC 病変29として効果的にアッセイをブロックするためです。
他の蛋白質との病変を伴う Dpc の修復を研究へのアプローチも行っているこのレポートによって作成された水素化ホウ素トラップ酵素反応の中間、DPC の特定のタイプに焦点を当てている間にタンパク質リンケージDNA は、リボースの位置よりもむしろヌクレオシド基盤を通して発生します。還元的アミノ化を使用して、我々 は、グアニン、シトシンに接続されている蛋白質およびペプチッドのクロスリンクを作成している DNA プライマー30の基本。これらのオリゴヌクレオチドは、同質性に浄化され、スーパー プラスミド DNA タンパク質および DNA ペプチドのクロスリンクを含むの生成に使用します。これらの反応の効率がやや詳細上記のオキソグアニン グリコシラーゼ架橋方法の相対的な減少、彼ら成功していたにもかかわらず、野生型のような基板の修理の検査を許可ヌクレオチド除去修復欠損哺乳類セルライン。またオキソグアニン病変の細胞ヌクレオチド切除修理機械31を介して修理する以前示されていた合成リボース コレステロール共役修復を研究する SSPE qPCR アッセイを使いました。図 2をグラフィカルに示していますと、Taq のポリメラーゼによってブロック プライマー拡張、原則として測定できます SSPE qPCR 法による任意の病変の修復します。
DPC 修復の現在のモデルはことをお勧め大きい Dpc (> 10 kDa) 除去32,33,34前に小さいペプチド病変のプロテアーゼによるプロセシングを受けます。このタンパク質の分解に責任がある可能性が最も高い候補者、プロテアソームというスパルタ20,21,35,36,37,細胞における特異的プロテアーゼ活性38. SSPE qPCR 法によるこれらのプロテアーゼの役割へのさらなる調査を実施することができます。プロテアソーム阻害剤は、DPC を含む基板のトランスフェクション前に細胞を前処理にされる可能性があります。また、スパルタ ノックダウン細胞株は大きい Dpc のタンパク質分解におけるその役割を明らかにする破損したプラスミドを導入でした。
クロスリンクを作成に使用する方法に関係なく、または DNA 損傷の性質、SSPE qPCR 法は均質な DPC プラスミド基板の相当量を生成する能力に大きく依存する強調価値があります。手順のこの分析共有の精製に不可欠な次のいずれかの傷を除去するためにプライマー拡張閉じた円形プラスミドや線形プラスミッドの分子。これらの汚染物質を除去して、観察すべての後続の DPC の修理はニック監督または二重鎖のブレーク監督修復プロセスが原因ないことを確認する必要があります。スーパー コイル DNA プライマー拡張反応を次の十分な量を取得に失敗した一本鎖 dna のオリゴヌクレオチドの比を変化させることにより解決できます。SSPE qPCR 法のもう一つの重要なステップは、プラスミッドにタンパク質の架橋効率です。この研究では、効率的な酵素反応が使用されたクロスリンク オキソグアニン グリコシラーゼ タンパク質 8-オキソグアニン巣にします。準最適な架橋は、反応の蛋白質の量を変えることによって改善できます。
このレポートに記載されている結果は、リポフェクション受信者セルに DPC 修理基板を導入するに依存して、事前の理由はない、他の transfections メソッドが採用されていません。予備的研究を行い、そのエレクトロポレーション39も使用できますを観察しました。しかし、それは我々 の経験で注目に値する、エレクトロポレーション トランスフェクション効率はに比べリポフェクション、DPC 基板の 1.5 μ g に加えて (5 μ g) までキャリアの DNA を使用して修復データを取得する必要があるとわかった。全体的に、上記で説明した SSPE qPCR メソッドは、専ら DPC プラスミッド DNA の修復を調べて、DNA 損傷応答に新しい洞察力を生成する革新的な方法を提供します。

記載は PCR アッセイの呼ぶ SSPE qPCR。このメソッドの目的は、プラスミド DNA 修復欠損、熟練した哺乳類細胞にトランスフェクションの DPC 修理を定量化することです。この試金は急速な量的な非常に柔軟な直接対策修復活動。このレポートは、Dpc の修復を研究するこの方法の使用に焦点を当てて、次に示す結果は Taq のポリメラーゼは、この手法を使用して学ぶことができますをブロックする任意の病変の修復を示しています。
このメソッドの開発の後ろの理論的根拠は、哺乳類細胞修復 Dpc メカニズムに洞察力を得ることです。DNA 損傷の他の種類とは異なり Dpc は、大規模な多様な1,2です。細胞蛋白質の数百が細胞の DNA3共有添付になることができる多数のアミノ酸側鎖が、原則として、各蛋白質の DNA に架橋をなることを調査は示した。さらに、ヌクレオチド塩基やリボース砂糖4,5いくつかポジションを含む DNA のバックボーンに蛋白質の多数の化学装着ポイントがあります。この化学的多様性は、異なる生化学的経路は、Dpc の種類を修復するために依存可能性があります見通しを発生させます。心 SSPE qPCR 測定法が開発されたことでこの懸念だった。
いくつかの技術は、細胞の DPC 修復の分子生物学への洞察力を得るために開発されています。以下それぞれの所有に開発されている、主要な概要と強みと弱みの主要なアプローチの概要を説明します。この概要は、哺乳類の細胞培養系で DPC 修復の研究に焦点を当てて、DPC 修復の現在のモデルに大きく貢献されていないことこれで議論されていない微生物および細胞無料のシステムを使って強調し価値があります。原稿。
おそらく DPC 修理の遺伝学への洞察力を得るために取ることができる最も簡単な方法は、Dpc6,7を誘導剤にさらされている野生タイプおよび突然変異体の細胞にみられる細胞死にそれぞれの感度を調べることです。この戦略は、比較的高速な安価なと基本的な細胞培養の技術を実行する能力を超えて専門知識を必要としません。以下を含む数多くの制限は、これらの利点をとるします。まず、アッセイは DNA 修復を直接測定していません。この戦略の基礎となる作業仮定は、関連 DNA 修復タンパク質をコードする遺伝子の突然変異を不活化こと、トリガー プログラム細胞死に損傷 DNA の蓄積の結果です。ただし、非 DNA 修復タンパク質をコードする遺伝子の変異が、プリンシパル、強化 (または削減) 異物による細胞死を細胞の感度。第二に、Dpc を必ず作成エージェント誘発 DNA 損傷の他の種類 (1 つの例外は 5-字-2'-deoxycytadine、しかしこのエージェントはまた細胞メチル基転移酵素のレベル8を激減させます)。したがって、考えられる問題のエージェントに強化された細胞過敏が鎖間の架橋やその他の病変の修復の欠陥を反映可能性がありますです。第三に、前述したように、Dpc クラスを表す非常に異種化学架橋の種類から成る異なる蛋白質パートナーを含みます。これらの病変の 1 つまたは複数のサブ型の修復は、特定の遺伝的背景の変更可能性があります、この相違ないことこのエージェントによる死細胞過敏症を大幅に改変するのに十分なことが可能です。要約すると、この戦略が魅力的な出発点を表します、上記制限は追求する DPC 修理の動力学を調査する他より直接的方法の重要性を強調します。
関連するアプローチの数は、この目的を達成するために開発されています。例えば、捜査官は、'自由' DNA '蛋白結合' DNA9,10,11とを区別する方法を開発しました。これらのアプローチを使用して、Dpc や異なる遺伝的背景で DPC 生産エージェントへの暴露後の定常状態レベルを比較することが可能です。最も広く使用されている 2 つの戦略は、ニトロセルロース膜結合戦略または KCl/SDS 析出12,13を使用して無料の DNA から DPC を含む DNA を分離することを含みます。前者の方法でセルを分離して硝酸セルロース フィルターを通過しました。硝酸セルロース結合するタンパク質と、ので、フィルターには許可を通過する自由な DNA 蛋白質リンクの DNA が引き継がれます。後者の戦略で蛋白結合 DNA は、事実に基づく SDS 蛋白質がない DNA に結合し、KCl の付加によって沈殿することができます無料 DNA から分離されます。その結果、ソリューションの中の非連結の DNA、蛋白質リンク DNA は不溶性になり。標識チミジンを使用して (細胞代謝最初ラベル付けされた) 場合は、DPC の DNA を測定し、ヘキスト 33258 のような DNA 選択的蛍光色素。これらのメソッドは再現可能な手順の数が少ないを必要とされます。ただし、彼らは蛋白質と DNA の関連付けに使用される化学架橋結合の性質に関する情報を提供しません。さらに、注意してください、これらのアッセイが DPC を偽って不完全な修理、すなわち、蛋白質分解処理を簡単にトラップまたは沈殿、善意の DNA としてことができない小さい DNA ペプチド クロスリンクの得点で修復を過大に評価することが重要です。修復します。
彗星の試金を使用して、DPC におけるセル14を視覚化できます。これらの実験で Dpc のプレゼンス低下, プロテイナーゼ K と前処理による元に戻すことができる DNA の移行したがって、尾の長さは、DPC 形成を推定する使用ことができます。ただし、前述のように、DPC 形成薬は尾の長さを変えることができる DNA の損傷の他の種類を作成します。このプロトコルは、高度な技術も、専門知識と共焦点レーザー顕微鏡の訓練が必要です。
質量分析法を使用して、架橋剤15,16,17による DPC 修復動態を勉強できます。これらの実験は DPC 形成剤と細胞を扱う、ビオチン キャプチャまたはフェノール: クロロホルム (1:1) 抽出 Dpc を隔離します。質量分析法は、架橋タンパク質を特定したり、時間をかけて形成された Dpc の量を量的に使用できます。このアプローチの主な利点は、生成されるデータの性質です。正確にカタログ異物、ただし、このプロトコルへの暴露を次架橋になるタンパク質の種類は高価、時間のかかると検出できる架橋型によって制限することが可能です。
Maizelsら開発機密 'レーダー' (DNA の急速なアプローチは、回復を付加体) レーダーの elisa 法を用いたアッセイ18,19付加体の DNA 蛋白質のバイオアセッテイを量的に分析。これらのアッセイは、付加体の一過性細胞を形成し、新しい蛋白質を識別するために質量分析に適したサンプルを生成する中間物を DNA 蛋白質のトラップのために特に便利です。このバイオアセッテイ アッセイ dna-タンパク質クロスリンクをキャプチャする抗体の可用性に依存しているならず、したがって、劣化 DNA ペプチドは、修復中にそのフォームを付加体の検出が可能。最近、特定の DPC は DNA 複製や DNA 依存性メタロプロテアーゼ スパルタが発見された Dpc が、小さいペプチドに限定修理20,21中にリンク経路を修復します。この遺伝子の受継がれた突然変異はヒトでは、Ruijs Aalfs 症候群、ゲノム不安定性、早期老化、肝臓がん22疾患に関連付けられます。遺伝子組み換えの質素な遺伝子異常を持つマウスは、類似した表現型23を表示します。
転写活性の宿主細胞を再活性化は、transfected プラスミッド DNA 基板24,25の現在定義されている病変の修復を研究に使用されています。これらの実験は、Dpc (または他の種類の DNA 病変) を含んでいるプラスミッドの記者が、ルシフェラーゼなどの転写をブロック、細胞にトランスフェクションします。ルミネッ センス測定撮影 24-72 時間後、DPC と相関を修復します。しかし、これら間接修復アッセイが 24 h 後トランスフェクションより早く修復イベントを検出できる、部分的に修復された基板のバイパスによって RNA ポリメラーゼと完全な修復を区別できません。
上記の方法の利点は、DPC 修復の現在のモデルに貢献しています。しかし、SSPE qPCR 法はいくつかのこれらの他のアプローチに関連付けられている制限を回避、その結果 DPC 修復メカニズムにより特定の洞察力を提供することができます。たとえば、SSPE qPCR アッセイは、そのまま哺乳類細胞における DNA のサイト固有の Dpc の修理を直接測定できます。このメソッドは、汎用性、次のハムスターとひと細胞でのトランスフェクション修理結果を得るに使用されています。プラスミッドのトランスフェクションは、培養された哺乳類細胞のリポフェクション エレクトロポレーションを使用して実行できます。また、定義された Dpc の唯一の修理を測定すると、そのほとんどの DPC 形成エージェントによる DNA 損傷の他の種類を保証します。SSPE qPCR です実行する簡単・安価・迅速です。この試金を使用して得られた結果は、早ければ 2 h 後トランスフェクション修復イベントを検出しました。このメソッドを使用して、DPC の修理結果に影響を与える変数は敏感かつ効率的な方法で学ぶことができます。たとえば、DPC 修復における転写の役割はまだ厳しく評価します。SSPE qPCR アッセイの柔軟性のため、この問題に対処する DPC の架橋サイトを操作できます。さらに、DPC 軸受プラスミドにレプリケーション元の導入は DPC 修理上のレプリケーションの影響に対処するため使用できます。さらに、複数個のクロスリンク対単一の DPC の修理の違いを検討するプラスミッドの複数個のクロスリンクを作成できます。これらは、染色体 DNA を用いて回答するは難しいだろうが、SSPE qPCR の試金を使用して簡単に解決することができます質問。全体的に、SSPE qPCR アッセイ マイクログラム量既知の場所の病変を含むプラスミド DNA を精製が必要です。付加体のほかに DPC は、この試金で使用できます、ただし、病変は Taq のポリメラーゼによって拡張子をブロックすることにする必要があります。

<table><tbody><tr><td>8-オキソグアニン修飾オリゴ</td><td>ミッドランド認定試薬会社</td><td>NA</td><td>配列: 5'AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3'</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>一本鎖 M13</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>Taq ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>ATP、100mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix、各 10mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>&β;-アガラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0392S</td><td></td></tr><tr><td>オキソグアニン グリコシラーゼ 1</td><td>NEB</td><td>M0241S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR グリーン PCR マスターミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>グリーン PCR マスターミックス</td></tr><tr><td>プライマー R</td><td>UMN ゲノムセンター</td><td>NA</td><td>5'CGGCTCGTATGTTGTGTG 3'</td></tr><tr><td>プライマーL</td><td>UMNゲノムセンター</td><td>NA</td><td>5'GCTGCAAGGCGATTAAGT 3'</td></tr><tr><td>リポフェクタミン試薬</td><td>Invitrogen</td><td>18324-012</td><td>トランスフェクション試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>BspD1</td><td>NEB</td><td>R0557S</td><td></td></tr><tr><td>NEB バッファー 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure バッファー飽和フェノール</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム、試薬 ACS、スペクトログレード</td><td>ACROS</td><td>40463-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

このメソッドの目的は、哺乳類セルライン dna-タンパク質クロスリンク (DPC) 修復の動態を調べるため柔軟、迅速、かつ定量的手法を提供することです。グローバル異物誘発または自発の染色体 DPC 除去の除去の試金ではなくは、この試金は同質で、化学的に定義された病変のプラスミド DNA 基板内の 1 つのサイトで具体的に導入の修理を調べます。重要なは、このアプローチは、放射性物質の使用を避けるし、高価なまたは高度な専門技術に依存しません。代わりに、それは標準的な組換え DNA プロシージャおよび広く利用可能なリアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) インストルメンテーションに依存します。これらのそれぞれの貢献に対処に変化する添付ファイル サイトの活用戦略の固有の柔軟性、架橋蛋白質のサイズだけでなく、化学のリンケージと正確な DNA の性質を考えるDPC の全体的な効率にパラメーターを修復します。このメソッドを使用すると、サイト固有の DPC を含んでいるプラスミッドは細胞にトランスフェクションされた、低分子量 DNA は様々 な時間でトランスフェクション後回復します。回収された DNA プラスミッドの破損した鎖に相補的なプライマーを用いた特異的プライマー拡張 (SSPE) にさらされます。DPC 病変ブロック Taq DNA ポリメラーゼから非修復する修復された DNA の比率定量的評価できます qPCR を使用します。サイクル (CT) のしきい値値は % 修理それぞれ細胞内のさまざまな時点での計算に使用されます。この SSPE qPCR 法は修理を定量的評価するためにも使用できます任意の DNA の付加物、ブロック Taq ポリメラーゼ。

DPC の細胞の修復を評価する SSPE qPCR アッセイを利用するために質の高い DPC 修理基板の十分な量 (μ g 量) を準備しなければなりません。この製品を得るためには、8-オキソグアニン残渣を含むオリゴヌクレオチドは焼なましに相補的な一本鎖 DNA、プライマー拡張とのみ共有閉じた円形の製品が transfections (図に使用されたことを確保するため精製ゲル1 a). このレポートは、水素化ホウ素トラップが二重鎖円形プラスミド分子組換え人間オキソグアニン グリコシラーゼとリボース ユニット間結合架橋を作成する使用される似ていますが基板に焦点を当ててのアプローチ使用して、化学的に多様な DPC 基板を取得できます。オキソグアニン グリコシラーゼ/水素化ホウ素トラッピング戦略は、架橋反応の非常に高い効率を与え特に魅力的です。図 1 bに示すように、KCl/SDS 析出実行 2 つに消化されていた DPC 基板上のフラグメントとほぼ定量的選択的に枯渇 DPC をかくまっている DNA のフラグメント。これらの結果は、プラスミッドの基質分子のほぼ 100% がタンパク質架橋を含む結論を支持します。
SSPE qPCR の試金のプロトコル」に記載は、DPC 修理哺乳類細胞でのトランスフェクションを次のパーセントを計算する qPCR によって生成された CT 値を利用しています。図 2に示すようタンパク質クロスリンクは DPC 含む繊維に焼鈍 'R' プライマーの拡張から Taq ポリメラーゼをブロックします。このアッセイの第二に、重要な機能 qPCR 測定を実行する前に 8 回 SSPE 反応 (R プライマーを使用) の混入であります。破損していない (または修理) の DNA は、これら SSPE 反応拡張が、下流の 'L' プライマーの結合部位を作成する損傷 DNA (または不完全に修復された DNA) 延長は適用されません。その結果、SSPE 訪れたによって各破損していない (または修理) 繊維の豊富さが増加します。つまり、SSPE 手順を qPCR の前に実行したサンプルを修復、qPCR (図 2) の前に SSPE の実行がされませんでした同一サンプルの得られたより低い 3 つのユニットは、CT 値が表示されます。ΔCT と呼ばれる 2 つの処置の観察された CT 値で 3 単位違いは事実を表してその 8 = 23。このデルタ CT 値は、数式を使用して細胞 DNA の修復活動を計算する使用できます: パーセント DNA 修理 = (2ΔCT/23) x 100。コントロール実験は、デルタ約 3 の CT 値が破損していない基板プラスミドが SSPE qPCR (データは示されていない) にさらされたときが観察された一貫して確認しました。
表 1が DPC 含むプラスミド基板から生成された例 CT 値を示しています同様から時間ゼロのサンプルが 3 h、8 h 後トランスフェクション (表 1 a) がチャイニーズハム スター肺線維芽細胞から回復すなわち、プロトコル セクションで説明されているが、ない (表1 b) の細胞にトランスフェクションするサンプル。テーブルはまた、ΔCT を提供し、% 修理値 (数式を使用して計算される 2ΔCT23 x 100) これらのサンプルから得られます。表 1 aで示すように、サンプルから計算されたパーセントの修理収穫 3 h と 8 h 後トランスフェクションそれぞれ 66% および 93% であった。これらの値は、パーセントを決定する 0 h サンプルの分析から得られるから修復し、減算されます。表 1 bは、効率的な架橋がいたか、導入前に実現しなかった 2 つの異なる 0 h サンプルの CT 値を示しています。効率的に悪い架橋サンプル デルタ 2.5 の CT 値の結果に対し、架橋サンプルはデルタ 0.8 CT 値で起因しました。日には、それされていないの 0.8 バック グラウンド信号のソースを正確に判断することが可能、効率的に架橋 0 h サンプル。そう、このような背景を反映していずれかの自発的な DPC の除去の低レベルまたは、Taq の低レベルのためポリメラーゼ 'バイパス' DPC 病変を合成だ: 高純度単一鎖 M13 基板に対して広範な実験デルタの約 0.8 CT 値が一貫して得られた、すなわち、本質的にこれと同じ '背景' 拡張子 DPC を含む基板に見られます。したがって、SSPE 'L' プライマーを追加すると、その後増幅することができます製品の少量の世代で結果と qPCR 実行時に 'R' プライマーの誤プライミングの度が小さいがあること可能性が高いです。PCR の状態を操作することによってこのような背景を排除する努力が、これまで、この問題を解決するために失敗しました。ただし、上記減算戦略は、DPC 修復活性の正確な推定を許可します。それは価値が高いバック グラウンド値プラスミッドに蛋白質の非効率な架橋を注目になります。これは、非効率的なタンパク質-DNA 架橋が時間 0 の高いデルタ CT 値の結果表 1 bのサンプル データで描かれています。したがって、制御実験は、transfections とデルタ CT 値閾値レベルは破棄されます 0.8 以上上昇と基板を開始する前にない実行されます常。QPCR プロトコルに記載され、各サンプルは、ピペッティングの整合性を確保する 3 井戸に分かれています。これらの複製は、そのサンプルの CT 値を取得する平均します。± 0.1 以上の逸脱がデータ セットから除去されることをレプリケートします。すべての 3 つの複製が互いから ± 0.1 以上逸脱すれば、一貫性のある値が得られるまでに、SSPE qPCR 法がやり直されました。経験は、DPC 修理効率に及ぼす種々 のパラメーターを決定するために統計分析を受けることができますし、信頼性の高いの平均値を取得する、少なくとも 3 の独立した transfections を実行することを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig1.jpg"> 図 1。DPC を含むプラスミドの生成します。(A) オリゴヌクレオチドを含む 8-オキソグアニン残渣 (赤) を一本鎖 DNA (大胆な黒い円) に焼きなまし、二本鎖プラスミド (プライマー拡張製品の破線で示されている) を作成する拡張します。エチジウム ブロマイドの電気泳動、スーパー コイル DNA (赤い箱) に対応するバンドは低溶かす agarose のゲルから摘出、β agarase と消化します。車線: (1) 分子量マーカー、(2) 単一座礁させた DNA (3) 二本鎖 DNA、プライマー (4) 拡張サンプル。(B) 架橋シアノ水素化ホウ素ナトリウムによる 8-オキソグアニン残渣をであり、結果の DPC 基板 2,800 塩基対、無料の DNA 断片と、4,400 を生成する消化オキソグアニン グリコシラーゼ (略称 hOGG1、オレンジ色の丸として描かれている)塩基対のフラグメントがタンパク質に接続されています。SDS は、1 つの KCl と扱われ、堆積物 (オレンジ色のペレットとして描かれている) DPC を含む DNA を遠心分離の 2 つの部分に分割されますをサンプルに追加されます。この後者のサンプル (青い流体遠心管中として描かれている) と KCl にさらされていないサンプルから培養上清は、ゲル電気泳動にさらされます。車線: (1) 分子量マーカー、(2) -KCl、(3) + KCl<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig2.jpg"> 図 2: SSPE qPCR 経由で破損したプラスミドの定量化します。プラスミド DNA の変性、破損した繊維 (R) に相補的なプライマーをアニールし、拡張します。8 サイクルの合計は、このプロセスが繰り返されます。破損した基板 (上)、Taq のポリメラーゼは DPC 病変によってブロックされており、全長製品ストランドは生成されません。対照的に、修復された基板 (下)、Taq のポリメラーゼはプライマー l. の結合部位を含むフルレングス製品ストランドに生成されます。8 サイクル後プライマー L が追加され、サイクルのしきい値値は qPCR を使用して決定されます。QPCR と qPCR 前拡張プライマーはなかった DNA を表す青の前にプライマー拡張を受けた DNA を表す赤い線と右側の破損している、破損していない基板用増幅結果の例を示します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">表 1 a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">時間</td>
			<td rowspan="2">-プライマー拡張</td>
			<td rowspan="2">+ プライマー拡張</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>パーセントの修理</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 h</td>
			<td>23.5</td>
			<td>21.1</td>
			<td>2.4</td>
			<td>66</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 h</td>
			<td>29.4</td>
			<td>26.5</td>
			<td>2.9</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">表 1 b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">時間</td>
			<td rowspan="2">-プライマー拡張</td>
			<td rowspan="2">+ プライマー拡張</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>パーセントの背景</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 h</td>
			<td>15.4</td>
			<td>14.6</td>
			<td>0.8</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 h</td>
			<td>15.4</td>
			<td>12.9</td>
			<td>2.5</td>
			<td>71</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: SSPE qPCR から生成された CT 値を使用して修復するパーセントを計算します。3 h、8 h 後トランスフェクション V79 チャイニーズハム スター肺線維芽細胞 (A) DPC 含む基板の修理が transfected。0 h サンプルない細胞にトランスフェクションの SSPE qPCR を (B)。グリコシラーゼがあった 1 つのサンプル DNA とオキソグアニンの架橋反応の効率化 (このサンプルは、低いデルタ CT 値を得られた) 中の高い他のサンプルのタンパク質架橋効率が低かった (このサンプルは、比較的高いデルタを得られました。CT 値)。代表結果の詳細は本文を参照してください。

このプロトコルの目的は、プラスミド DNA を定義された dna-タンパク質クロスリンクの修理を定量化します。破壊のプラスミドは受信者哺乳類セルラインと複数時間ポイント後トランスフェクションで収穫される低分子の重量に導入しました。DNA 修復速度は qPCR 続いて特異的プライマー拡張を使用して量を示されます。

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

この環太平洋プライマー拡張QPCRエッセイの全体的な目標は、哺乳類細胞へのトランスフェクション後のプラスミドDNAに架橋された付加体の修復を定量的に評価することです。この方法は、DNA修復分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。DNAタンパク質架橋の修復にどのような経路が関与しているかなど。この手法は、DNA損傷応答の理解を深める可能性を秘めています。なぜなら、DNAタンパク質の架橋の修復や他の種類のDNA損傷がないことを選択的に研究することを可能にするからです。この方法は、DNAタンパク質架橋の修復に関する洞察を得ることができますが、他のタイプのDNA損傷にも適用できます。非塩基性部位、および他のポリメラーゼブロッキング付加体など。この技術の主な利点は、付加物を含むプラスミドの修復を2時間という早い時点で検出できることです。当初は、ハウス細胞の再活性化を使用して修復を研究する予定でしたが、これらのアッセイでは修復を直接測定しないか、修復効率を過大評価する可能性があります。特に、RNAポリメラーゼが不完全な修復産物を読み取ることができる場合。この方法の視覚的なデモンストレーションは、精製およびストランド特異的なプライマー伸長ステップを視覚化するのが難しいため、非常に重要です。オリゴヌクレオチドを含む8個のオキソグアニンの80ピコモルを含む溶液20マイクロリットルと5マイクロリットルの10xリガーゼ緩衝液を混合します。そして、10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液の1マイクロリットルを追加します。最終容量を50マイクロリットルに調整し、チューブを水浴中で37°Cで30分間インキュベートします。次に、氷上でのプライマー伸長反応を構成します。サーモサイクラーにプログラムをセットし、運転を開始します。インキュベーション後、さまざまな試薬、酵素、バッファーを加えて、総容量を375マイクロリットルに調整します。次に、反応を摂氏37度の水浴で一晩インキュベートします。フェニル-クロロホルム混合物を50:50の比率で調製するには、等量のフェノールとクロロホルムを加えます。次に、両方の成分を混合し、卓上遠心分離機で21、130 Gで5分間遠心します。スピンが終了したら、プライマー伸長反応に375マイクロリットルの有機層を加えます。混ぜる。そして再び21、130 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、最上層を慎重にピペットで掴みます。そして、酢酸アンモニウムと最終濃度0.3モルまで混合します。次に、それに100%エタノールを2容量加えます。混合物をマイナス20°Cで少なくとも30分間から一晩保管します。インキュベーション期間が終了したら、サンプルを摂氏4度で15, 000RPMで10分間遠心分離します。次に、上清を捨て、ペレットを70%エタノールで洗浄します。テーブルトップ遠心分離機でサンプルを15, 000 RPMで4°Cで5分間再度回転させます。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを100マイクロリットルの水に溶解します。50マイクロリットルのDNAを34マイクロリットルの水と16マイクロリットルの6xゲルローディング色素と組み合わせます。10 cm、0.8%低融点のアガロースゲル、1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのエチジウムブロマイドを含有し、1x TAEバッファー中で2ボルト/センチメートルで6時間分析します。次に、カミソリの刃を使用して、スーパーコイル状のDNAを切り取ります。そして、ゲルスライスの重さを量ります。次に、1マイクロリットルのβ-アガラーゼ反応バッファーを添加して、ゲルスライス10ミリグラムごとに消化します。次に、スライスを摂氏65度で10分間インキュベートし、続いてサーモサイクラーで摂氏42度で冷却します。ゲルスライスが溶解して摂氏42度まで冷却されたら、10ユニットのベータアガラーゼを加え、摂氏42度でサーモサイクラーに1時間放置します。1時間後、溶解したゲルスライスの容量を測定し、酢酸アンモニウムを最終濃度0.3モルまで加え、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、混合物を室温で15,000 Gで15分間遠心分離します。次に、スーパーナタントを収集し、2容量のイソプロパノールをピペットで移して混合します。次に、混合物を摂氏マイナス20度で一晩保管します。翌日、精製したスーパーコイルDNAを卓上遠心分離機で15, 000 RPMで摂氏4度で10分間遠心分離します。スーパーナタントを取り除き、ペレットを40マイクロリットルの水に再懸濁します。次に、12ピコモルのDNAを含む溶液15マイクロリットルと、バッファー中のオキソグアニングリコシラーゼ36ピコモノの溶液1マイクロリットルを組み合わせ、最終容量を30マイクロリットルに調整します。次に、混合物を摂氏37度で水浴中で30分間インキュベートします。トランスフェクションの前日に、6ウェル培養プレートに細胞を播種します。翌日、1.5マイクログラムの架橋プラスミドと300マイクロリットルの無血清培地を1本のチューブに混合し、ゼロ時間のサインポイントとして1マイクロリットルのDNAを保存するようにします。別のチューブに、12マイクロリットルのトランスフェクション試薬と300マイクロリットルの無血清培地を混合します。次に、300マイクロリットルの架橋DNAを等量の希釈トランスフェクション試薬と組み合わせます。そして、層流フード内で室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、2つのウェルのそれぞれに250マイクロリットルの複合体を加え、摂氏37度でインキュベートします。最低1時間後、培地を取り出し、0.6%ドデシル硫酸ナトリウム溶液1ミリリットルを0.1モルEDTAで加え、室温で10〜15分間インキュベートします。その後、ゴム製のポリスマンで掻き取って細胞をはがし、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。次に、200マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム溶液を最終濃度1モルまで加え、チューブを5回反転させます。その後、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを21、130Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離後、スーパーナタントを回収します。そして、酢酸アンモニウムを最終濃度0.3モルまで加え、100%エタノールを2容量混合して加え、DNAを沈殿させます。混合物をマイナス20°Cで最低30分間保管します。回収したDNAサンプルをエタノールで沈殿させ、回収したDNAサンプルを50マイクロリットルの水に再懸濁した後、ゼロ時間サンプルを500マイクロリットルの水で希釈し、トランスフェクトされていないサンプルとトランスフェクションされたサンプルを使用してPCR反応を構成します。次に、プログラムをサーモサイクラーに設定し、実行を開始します。このトランス特異的プライマー伸長ステップは、損傷した鎖の増幅を購入するため、非常に重要です。使用しない場合、デルタCT値は1未満になり、低レベルのDPC修復を検出するのが難しくなります。8サイクル終了後、2つ目のプライマーを100ピコモル加えます。次に、トランスフェクションしていないサンプルとトランスフェクションしたサンプルから1マイクロリットルの未増幅DNAを、2倍マスターミックス、水、および両方のプライマーの100ピコモルと混合して、最終容量60マイクロリットルにします。サンプルを3重にロードし、96ウェルPCRプレートにロードします。30サイクルの定量的PCRを実行し、各トリプリケートサンプルのサイクル閾値を平均化します。この研究では、修復されたプラスミドDNAの割合を計算するために、鎖特異的プライマー伸長の有無にかかわらずQPCRを実行します。プライマー伸長サンプルと非プライマー伸長サンプルとの間のサイクル閾値の差はデルタと呼ばれ、ここで見られる CT.As ように、SSPE-QPCRに供された修復されたサンプルは、修復されていないサンプルよりもデルタCTが大きくなります。デルタCT値から計算された修復率の代表データは、トランスフェクションの3時間後に回収されたサンプルが66%修復され、8時間後に回収されたサンプルが93%修復されたことを示しています。ここでは、タンパク質架橋効率がそれぞれ高いサンプルと低い2つのコントロールサンプルから計算されたバックグラウンド値の割合を示します。コントロールに存在するバックグラウンドの割合が低いことは、トランスフェクションに効率的に架橋された基質のみが使用される理由を示しています。このテクニックをマスターすると、2〜3時間で完了します。この手順を試行する際は、このアッセイからバックグラウンドを差し引くために、時間ゼロサンプルを採取することが重要です。この手順に続いて、シーケンス分析などの他の方法を実行して、次のような追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、哺乳類細胞における付加物含有プラスミドの調製、トランスフェクション、修復の定量方法について十分に理解できるはずです。フェノール、クロロホルム、臭化エチジウムの取り扱いには危険が伴うことを忘れないでください。また、手袋を着用したり、ドラフトで作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があります。

a-simple-rapid-quantitative-assay-to-measure-repair-dna-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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学ぶDNA-タンパク質クロスリンク修復の定量アッセイ法。プラスミドDNAを哺乳類細胞にトランスフェクションし、ストランド特異的プライマー延伸とqPCRで修復動態を測定する。DNA損傷応答の理解に有用です。

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

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