シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

このプロトコルの目的は、プラスミド DNA を定義された dna-タンパク質クロスリンクの修理を定量化します。破壊のプラスミドは受信者哺乳類セルラインと複数時間ポイント後トランスフェクションで収穫される低分子の重量に導入しました。DNA 修復速度は qPCR 続いて特異的プライマー拡張を使用して量を示されます。

この環太平洋プライマー拡張QPCRエッセイの全体的な目標は、哺乳類細胞へのトランスフェクション後のプラスミドDNAに架橋された付加体の修復を定量的に評価することです。この方法は、DNA修復分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。DNAタンパク質架橋の修復にどのような経路が関与しているかなど。

この手法は、DNA損傷応答の理解を深める可能性を秘めています。なぜなら、DNAタンパク質の架橋の修復や他の種類のDNA損傷がないことを選択的に研究することを可能にするからです。この方法は、DNAタンパク質架橋の修復に関する洞察を得ることができますが、他のタイプのDNA損傷にも適用できます。

非塩基性部位、および他のポリメラーゼブロッキング付加体など。この技術の主な利点は、付加物を含むプラスミドの修復を2時間という早い時点で検出できることです。当初は、ハウス細胞の再活性化を使用して修復を研究する予定でしたが、これらのアッセイでは修復を直接測定しないか、修復効率を過大評価する可能性があります。

特に、RNAポリメラーゼが不完全な修復産物を読み取ることができる場合。この方法の視覚的なデモンストレーションは、精製およびストランド特異的なプライマー伸長ステップを視覚化するのが難しいため、非常に重要です。オリゴヌクレオチドを含む8個のオキソグアニンの80ピコモルを含む溶液20マイクロリットルと5マイクロリットルの10xリガーゼ緩衝液を混合します。

そして、10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液の1マイクロリットルを追加します。最終容量を50マイクロリットルに調整し、チューブを水浴中で37°Cで30分間インキュベートします。次に、氷上でのプライマー伸長反応を構成します。

サーモサイクラーにプログラムをセットし、運転を開始します。インキュベーション後、さまざまな試薬、酵素、バッファーを加えて、総容量を375マイクロリットルに調整します。次に、反応を摂氏37度の水浴で一晩インキュベートします。

フェニル-クロロホルム混合物を50:50の比率で調製するには、等量のフェノールとクロロホルムを加えます。次に、両方の成分を混合し、卓上遠心分離機で21、130 Gで5分間遠心します。スピンが終了したら、プライマー伸長反応に375マイクロリットルの有機層を加えます。混ぜる。

そして再び21、130 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、最上層を慎重にピペットで掴みます。そして、酢酸アンモニウムと最終濃度0.3モルまで混合します。

次に、それに100%エタノールを2容量加えます。混合物をマイナス20°Cで少なくとも30分間から一晩保管します。インキュベーション期間が終了したら、サンプルを摂氏4度で15, 000RPMで10分間遠心分離します。

次に、上清を捨て、ペレットを70%エタノールで洗浄します。テーブルトップ遠心分離機でサンプルを15, 000 RPMで4°Cで5分間再度回転させます。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを100マイクロリットルの水に溶解します。

50マイクロリットルのDNAを34マイクロリットルの水と16マイクロリットルの6xゲルローディング色素と組み合わせます。10 cm、0.8%低融点のアガロースゲル、1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのエチジウムブロマイドを含有し、1x TAEバッファー中で2ボルト/センチメートルで6時間分析します。次に、カミソリの刃を使用して、スーパーコイル状のDNAを切り取ります。

そして、ゲルスライスの重さを量ります。次に、1マイクロリットルのβ-アガラーゼ反応バッファーを添加して、ゲルスライス10ミリグラムごとに消化します。次に、スライスを摂氏65度で10分間インキュベートし、続いてサーモサイクラーで摂氏42度で冷却します。

ゲルスライスが溶解して摂氏42度まで冷却されたら、10ユニットのベータアガラーゼを加え、摂氏42度でサーモサイクラーに1時間放置します。1時間後、溶解したゲルスライスの容量を測定し、酢酸アンモニウムを最終濃度0.3モルまで加え、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、混合物を室温で15,000 Gで15分間遠心分離します。

次に、スーパーナタントを収集し、2容量のイソプロパノールをピペットで移して混合します。次に、混合物を摂氏マイナス20度で一晩保管します。翌日、精製したスーパーコイルDNAを卓上遠心分離機で15, 000 RPMで摂氏4度で10分間遠心分離します。

スーパーナタントを取り除き、ペレットを40マイクロリットルの水に再懸濁します。次に、12ピコモルのDNAを含む溶液15マイクロリットルと、バッファー中のオキソグアニングリコシラーゼ36ピコモノの溶液1マイクロリットルを組み合わせ、最終容量を30マイクロリットルに調整します。次に、混合物を摂氏37度で水浴中で30分間インキュベー

トランスフェクションの前日に、6ウェル培養プレートに細胞を播種します。翌日、1.5マイクログラムの架橋プラスミドと300マイクロリットルの無血清培地を1本のチューブに混合し、ゼロ時間のサインポイントとして1マイクロリットルのDNAを保存するようにします。別のチューブに、12マイクロリットルのトランスフェクション試薬と300マイクロリットルの無血清培地を混合します。

次に、300マイクロリットルの架橋DNAを等量の希釈トランスフェクション試薬と組み合わせます。そして、層流フード内で室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、2つのウェルのそれぞれに250マイクロリットルの複合体を加え、摂氏37度でインキュベートします。

最低1時間後、培地を取り出し、0.6%ドデシル硫酸ナトリウム溶液1ミリリットルを0.1モルEDTAで加え、室温で10〜15分間インキュベートします。その後、ゴム製のポリスマンで掻き取って細胞をはがし、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。次に、200マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム溶液を最終濃度1モルまで加え、チューブを5回反転させます。

その後、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを21、130Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離後、スーパーナタントを回収します。

そして、酢酸アンモニウムを最終濃度0.3モルまで加え、100%エタノールを2容量混合して加え、DNAを沈殿させます。混合物をマイナス20°Cで最低30分間保管します。回収したDNAサンプルをエタノールで沈殿させ、回収したDNAサンプルを50マイクロリットルの水に再懸濁した後、ゼロ時間サンプルを500マイクロリットルの水で希釈し、トランスフェクトされていないサンプルとトランスフェクションされたサンプルを使用してPCR反応を構成します。

次に、プログラムをサーモサイクラーに設定し、実行を開始します。このトランス特異的プライマー伸長ステップは、損傷した鎖の増幅を購入するため、非常に重要です。使用しない場合、デルタCT値は1未満になり、低レベルのDPC修復を検出するのが難しくなります。

8サイクル終了後、2つ目のプライマーを100ピコモル加えます。次に、トランスフェクションしていないサンプルとトランスフェクションしたサンプルから1マイクロリットルの未増幅DNAを、2倍マスターミックス、水、および両方のプライマーの100ピコモルと混合して、最終容量60マイクロリットルにします。サンプルを3重にロードし、96ウェルPCRプレートにロードします。

30サイクルの定量的PCRを実行し、各トリプリケートサンプルのサイクル閾値を平均化します。この研究では、修復されたプラスミドDNAの割合を計算するために、鎖特異的プライマー伸長の有無にかかわらずQPCRを実行します。プライマー伸長サンプルと非プライマー伸長サンプルとの間のサイクル閾値の差はデルタと呼ばれ、ここで見られる CT.As ように、SSPE-QPCRに供された修復されたサンプルは、修復されていないサンプルよりもデルタCTが大きくなります。

デルタCT値から計算された修復率の代表データは、トランスフェクションの3時間後に回収されたサンプルが66%修復され、8時間後に回収されたサンプルが93%修復されたことを示しています。ここでは、タンパク質架橋効率がそれぞれ高いサンプルと低い2つのコントロールサンプルから計算されたバックグラウンド値の割合を示します。コントロールに存在するバックグラウンドの割合が低いことは、トランスフェクションに効率的に架橋された基質のみが使用される理由を示しています。

このテクニックをマスターすると、2〜3時間で完了します。この手順を試行する際は、このアッセイからバックグラウンドを差し引くために、時間ゼロサンプルを採取することが重要です。この手順に続いて、シーケンス分析などの他の方法を実行して、次のような追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、哺乳類細胞における付加物含有プラスミドの調製、トランスフェクション、修復の定量方法について十分に理解できるはずです。フェノール、クロロホルム、臭化エチジウムの取り扱いには危険が伴うことを忘れないでください。また、手袋を着用したり、ドラフトで作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があります。