Name: HFOB 1.19 によって生成される鉱物と Sao 2 セルを使用して透過型電子顕微鏡エネルギー分散型 x 線微小分析での分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 学ぶ透過型電子顕微鏡エネルギー分散型X線微小分析によるhFOB 1.19およびSaos-2骨細胞の鉱物化プロファイル比較法。この手法は骨生物学研究における細胞レベルの鉱物核生成メカニズム解明に貢献します。

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MK と ASK が手動操作を実行して映画を作った LB 図面を準備します。ASK は原稿、LB はスクリプトを書いたし、MK は、表を作成しました。SM, RB, SP は批判的にテーブル、スクリプト、原稿を読みます。著者らは、超と彼女の優れた支援のためハンナ Chomontowska と同様、シモン十五夜とヘンリク Bilski TEM EDX 分析優秀な援助のために感謝したいと思います。著者は、dr プロ英語補正のためパトリック畑とバーバラ Sobiak の手順を記録するために感謝したいと思います。
この作品は、LB と 2016/23/N/NZ1/02449 MK、EU FP7 プロジェクト BIOIMAGINE に国立科学センター、ポーランド 2016年/23/N/NZ4/03313 から助成金を付与依頼、するポーランド科学高等教育省から N N401 140639 によって支えられました。: バイオ イメージング技術革新の研究と教育、GA 号 264173 と法定資金の Nencki 研究所の実験生物学、ポーランド科学アカデミー。

1. 細胞の培養と治療
<ol><li>層流フードの下で必要なすべての材料を入れ、紫外線の下でそれらを殺菌します。文化メディア: 1:1 の混合物ハムの F12 と DMEM メディア 2.5 mM L グルタミンを添加した 100 U/mL ペニシリン、100 U/mL ストレプトマイシン、0.3 mg/mL G418、10% ウシ胎児血清 (FBS) (v/v) 胎児 hFOB 1.19 SV40 large T 抗原の導入のため骨芽細胞と 1.5 mm L グルタミン 100 U/mL ペニシリン、100 U/mL ストレプトマイシン、15% を添加したマッコイの 5 a 媒体 Sao 2 ひと骨肉腫細胞の FBS (v/v)。</li>
	<li>5% CO2の雰囲気の中で 34 ° C で hFOB 1.19 細胞と 5% の雰囲気の中で 37 ° C で Sao 2 細胞文化 CO2.層流フードのインキュベーターから細胞培養、hFOB いずれか 1.19 または Sao 2 のセルを転送し、媒体を FBS で新鮮な培養液 10 mL に変更します。</li>
	<li>(静止期細胞) を刺激することがなくセルを孵化させなさいまたは 50 μ G/ml アスコルビン酸 (AA) 7.5 mM β-グリセロリン酸 (β-GP)、純水で前準備し、0.22 μ m シリンジ フィルターで濾過後にそれらを刺激します。培地の表面にプラスチック遠心管から刺激を追加します。優しく培養皿をかき混ぜるし、7 日間インキュベートします。</li>
</ol>2. カルシウム鉱物の検出
<ol><li>リン酸バッファー生理食塩水で細胞培養を洗う (PBS: 125 mM NaCl、KCl、5 mM 10 mM ナ2HPO4、1 mM KH2PO4、pH 7.0)。</li>
	<li>2% (g:100 mL) 5 mL を加える PBS、pH 5.0 で AR S と鉱物を染色する 30 分の版を孵化させなさい。</li>
	<li>3 回を PBS で洗浄します。慎重に、皿の壁に PBS を追加鉱物を破壊しないようにします。</li>
	<li>倒立顕微鏡下でカルシウム鉱物を観察し、画像を撮影します。</li>
</ol>3. 紫外線の下でプローブの可視化
<ol><li>セル lysates のコラゲナーゼの消化力のプロトコルの24によると、安静時または 7 日間の刺激、細胞培養を扱います。</li>
	<li>培養細胞から媒体を収集し、PBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>3 ml の溶液 0.25 M ショ糖、0.12 M NaCl 0.01 M KCl と 0.02 M トリス塩酸バッファー pH 7.45、3 h の 37 ° C で 500 U/mL コラゲナーゼの細胞を消化します。</li>
	<li>機械的に細胞をこすり、プラスチック遠心管に移して、0.5 × 16 針で 1 mL 40 U シリンジを 10 回渡します。</li>
	<li>(500 g) × 5 分のサンプルを遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、合成の軟骨リンパ (SCL、100 mM の NaCl、12.7 mM KCl、0.57 mM MgCl2、1.83 NaHCO3、0.57 mM NaH2PO4、5.5 mM 63 mM ショ糖、16.5 mM Hepes、pH 7.4 D-グルコース) を 500 μ l 添加の細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>UV transilluminator のボトルからヘラでハイドロキシアパ タイト (HA)、アパタイト (FA) とアパタイト (CA) 粉末を転送し、コントロールとして使用します。</li>
	<li>プラスチックのヒント プラスチック チューブからセル lysates を転送、UV transilluminator に慎重に。</li>
	<li>可視画像と UV 光を取る。</li>
</ol>4. 電子顕微鏡 EDX のプローブの準備
<ol><li>否定的な汚損のためミネラルの準備<ol>
<li>500 μ L の脱イオン水で HA, CA, FA ミネラルを総合的に生産25 2.5 mg を中断し、37 ° c 1 時間 5% CO2の大気中でインキュベートします。</li>
		<li>静電気防止ピンセットでボックスからホルムバール/カーボン 300 メッシュ Ni グリッドを取る、磁器のウェル プレート上に配置し、グリッドに HA, CA, FA の懸濁液の 10 μ L をドロップします。</li>
		<li>室温で 30 分間試料を乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>安静時の準備、 26の埋め込みのための細胞を刺激<ol>
<li>培養細胞から媒体を収集し、(125 mM の NaCl、KCL、10 mM NaHCO35 mM、1 mM KH2PO4、10 mM グルコース、20 mM HEPES、pH 7.4) の生理学的脱感作 (PD) 培地で細胞を洗浄します。</li>
		<li>5 ml の 100 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2、ヒューム フードの下で室温で 1 時間に 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) グルタルアルデヒドの混合物のセルを修正します。</li>
		<li>100 mM リン酸ナトリウム緩衝の 5 mL の細胞を洗浄し、洗浄後、バッファーを慎重に取り外します。</li>
		<li>暗い部屋で 100 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2、ヒューム フードの下で室温で 20 分間の 1% (g:100 mL) 四酸化オスミウムの 2 ml サンプルを後置します。</li>
		<li>四酸化オスミウムを削除し、それを利用します。</li>
		<li>5 ml の 100 mM リン酸ナトリウム緩衝のセルを洗浄します。</li>
		<li>その後、室温で傾斜エタノール ソリューション シリーズの因数を 5 mL のサンプルを脱水: 5 分 (体積) 25%、10 分間 (体積) 50%、15 分間 (体積) 75%、20 分間 (体積) 90%。最後に無水エタノールを 2 回使用し、30 分と 12 時間孵化させなさい。</li>
		<li>機械的プラスチック シャーレ文化から細胞をこすりプラスチック遠心管に収集し、遠心分離機の 130 x グラムで 1 分のサンプル。</li>
		<li>培養上清を削除し、LR ホワイト樹脂と無水エタノールを容積比で 1:2 の混合物の 1 mL の細胞を中断します。</li>
		<li>使用前にガラス管の内容をよく混合し、室温で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>130 x グラムで 1 分のサンプルを遠心します。</li>
		<li>培養上清を削除し、LR ホワイト樹脂とエタノールの 1:1 混合物の 1 つの mL を使用して前の手順を繰り返します。</li>
		<li>よく混合し、室温で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>130 x グラムで 1 分のサンプルを遠心します。</li>
		<li>培養上清を削除します。</li>
		<li>最後に、サンプルに 1 mL の純粋な LR ホワイト樹脂を 2 回追加し、プラスチック製のチューブに室温で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>ゼラチン カプセルに 500 μ L の各サンプルを配置します。 注: サンプルは樹脂ラベルを破壊しないので、紙と鉛筆の小さなシートを使用して表示されます。</li>
		<li>ゼラチン カプセルを閉じプラスチック遠心管に入れてスイング アウト ローターで 1 分間 130 × g で遠心分離します。</li>
		<li>真空ポンプを使用してプラスチック製のチューブからカプセルを削除します。</li>
		<li>オーブンにサンプルを移動し、48 h 56 ° C で重合します。</li>
		<li>ホルダーにマウントしてピラミッドにトリミングしてブロックを準備します。</li>
		<li>ウルトラミクロトームにホルダーを入れ、ダイヤモンド超 45 ° ナイフを添付し、脱イオン水でそれを埋める付随的空気の泡からブレードをきれいにしてください。</li>
		<li>それから風呂の脱イオン水にダイヤモンド ナイフを使用してセクション (700 Å) を切った。</li>
		<li>牛のまつげと場所ホルムバール/カーボン 300 の光沢のある面にはメッシュを使用してスクラップ Ni グリッドを設定して、乾燥させる.</li>
		<li>ヒューム フードの下で暗闇の中で無水エタノールに酢酸ウラン (体積) 2.5% を準備します。鉛の容器で酢酸ウランを保つし、堆積物をピックアップしていない覚えています。</li>
		<li>暗い部屋で合成アパタイトとヒューム フードの下で室温で 20 分間エタノールに酢酸ウラニウム (体積) 2.5% 細胞サンプルのグリッドを counterstain します。</li>
		<li>50% エタノールでグリッド (巻) で、脱イオン水で洗って 24 時間常温乾燥します。最後に、ボックスに、グリッドを置きます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 電子顕微鏡 EDX 分析
<ol><li>透過型電子顕微鏡 (TEM) による電子顕微鏡イメージング装備フルレンジ エネルギー分散型 x 線微小分析 (EDX) システムと 11 メガピクセル カメラ<ol>
<li>ミネラル、細胞観察のためのベリリウム ホルダーを用意します。帯電防止ツールを使用します。</li>
		<li>ネジのペアを外し、ベリリウム板と押さえの残りの部分からベリリウム洗濯機。</li>
		<li>グリッドは、光沢のある面をホルダーにマウントします。</li>
		<li>慎重に洗濯機ベリリウムとベリリウム板を置き、固定ねじをしっかりと。</li>
		<li>ホルダーを入れ真空チャンバーと真空ポンプをオンに。</li>
		<li>真空が達成されれば優しくイメージングの商工会議所にホルダーを挿入し、ビーム入れます。</li>
		<li>蛍光モニターに顕微鏡の絞り値パラメーターを設定します。実行イメージ非点収差補正。ズーム、フォーカス、およびフレームを設定します。50 の倍率で TEM 画像を取ると 000 X。</li>
	</ol>
</li>
	<li>幹の画像とスペクトルと化学組成分析のための x 線の微量分析<ol>
<li>スキャン伝達電子顕微鏡 (茎) イメージング室にエネルギー分散 x 線 (EDX) 検出器を挿入します。</li>
		<li>フォーカス モードで画像のシャープネスを調整します。</li>
		<li>15 の倍率で幹の画像を取る 000 X。</li>
		<li>X 線微量分析のためのサンプル点を選択し、スペクトルを収集します。</li>
		<li>(100%) としてサンプルでは周期表のすべての要素のすべての原子の重さを合計し、選択した要素の内容を示すデータを取得: Ca、F、Cl、P (として原子 %)。各サンプルの Ca、F や P に Cl の比率を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イオン マッピング<ol>
<li>カルシウム、フッ素、塩素イオン マッピングおよびサンプルの選択した要素の EDX マップを行うのためのリンなどの要素を選択します。</li>
		<li>分析要素の局在を示すことによってデータを取得: Ca、F、Cl、P (原子 %) として、各サンプルの Ca は、F または P と Cl の (%) の共局在を計算。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

現在の紙の AR s 染色、フルオロアパ タイトの UV 光識別プロトコルについて述べるし、MVs.によって生成される電子顕微鏡 EDX体外イメージング細胞の石灰化が発表した MVs と鉱物いくつかの一般的なトラブルシューティングの手順に従うことによって上記のすべてのメソッドに対応することが可能です。最適な結果を得るためにいくつかの重要な手順を慎重に実行する必要があります。まず、培地の pH 7.4 を維持するために (これはアルカリ) β GP に続いて AA (これは酸性) を追加することをお勧めします。第二に、AR-S 染色後、染色のカルシウム沈着が非常に壊れやすいとセル PBS を追加する時に結晶の破壊防止に細心の注意を洗うべきであります。第三に、常に鉛容器で酢酸ウランを保つし、希薄化後の一部分だけ固定に使用するため堆積物が検出されません。第四に、AA とウラニル酢酸は光に敏感で、暗い部屋で処理する必要があります注意してください。第五に、LR ホワイトの無水エタノールとの混合物はサンプルに追加される前によく混合する必要があります。第六に、ゼラチン カプセルのサンプルは樹脂ラベルを破壊しないので...

骨は 2 つの部分から成る結合組織の種類: 有機性 (細胞と膠原線維) とミネラル (カルシウムとリン酸の化合物)。骨の主な無機成分は、アパタイト1です。骨 (骨芽細胞)、歯 (象牙芽細胞) および軟骨 (軟骨) の鉱化作用有能なセルの種類鉱化作用の初期の段階を調節する細胞外マトリックス (ECM) の蛋白質を生産し、行列を離すこと小胞 (MVs) (図 1)。MVs は 100-300 nm 径小胞カルシウムとアパタイト核生成を促進するリン酸を蓄積し、その後コラーゲン2,3にバインドします。その後、細胞外媒体にアパタイトを解放する MVs が崩壊します。アパタイトは、コラーゲン線維と接触して成長し、骨マトリックスを形成し続けます。石灰化は、P は私と Ca2 +細胞中の一定した供給によって支えられています。いくつかの最近公開されたデータは、当社モデル4,5をサポートします。軟部組織は生理学的条件下で石化しません。ただし、異所性石灰化は、血管石灰化3など病理学的条件下で生じる。血管の細胞、骨芽細胞の表現型を取得は、アパタイトの核形成を誘導し、血管の壁の内側と内膜層の鉱化作用を開始して MVs を生成できます。異所性石灰化以来正常軟骨石灰化3、骨細胞の石灰化の分子機構の解明に似ており、軟骨、軟組織の異所性石灰化のいくつかの手がかりを提供形成されます。
骨格組織の開発は、様々 な酵素、成長因子、プロモーターや鉱化作用の阻害剤によって調整されます。拮抗作用組織非特異型アルカリホスファターゼ (TNAP) (図 1) と ectonucleotide ピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼの私 (NPP1)、アンキリン (アンク) と制御 (PP私) 無機ピロリン酸濃度6TNAP; で加水分解 PP私、ハ形成の強力な阻害剤。NPP1 では、アンクがセルから ECM に PP は私をエクスポート中 PP は私を形成するヌクレオチド三リン酸塩を加水分解します。Pi/PPi 比は、アパタイト形成7,8可能な病理学的結果9を調整するかもしれない。
MV の膜は、イオン輸送タンパク質核形成過程 (図 1) 中のカルシウムとリン酸、MVs の中の初期析出を促進することで濃縮されています。リン酸輸送体 1 (PiT) は、P私MVs10、11perivesicular 空間の生成を組み込むのに役立ちます。アネキシンは、バインドし、Ca2 +の輸送と MV ルーメン12,13の鉱化作用を開始する生物物理プロセスにかかわることも。述べましたが、ECM14,15中を伝搬する前に MV の中のアパタイトの内部の核細胞質内小胞内鉱化作用の仮説を支持します。In vitroモデルは、Ca2 +/P私錯体形成16PS と AnxA5 から作られたプロテオリポソームの誘導を確認しました。その蓄積可能性がありますの Ca2 +P私、微絨毛のような membranesrepresent M対アネキシンと TNAP 内アパタイトの核生成コア (NC) の脂質ラフトの AnxA5 と PS の錯体は、コラーゲン結合をまた所有しています。コラーゲン線維に沿って MVs を配置して、ECM の鉱化作用の伝播を刺激することで役立つことができる能力。フェツイン、オステオポンチン (OPN)17は膠原線維の足場に鉱化作用の伝播が遅くアパタイト形成の阻害剤として知られています。核生成と伝播が異なるイベント、上記後者の元と両方が病理学的無機化プロセスに関連する可能性があります。
カルシウム複合体の化学的性質がどのように変化生理的石灰化と異所性石灰化を発見し、細胞によって生成される鉱物を識別するために必要です。アパタイト カルシウムとリン酸鉱物、一般的な結晶単位セル数式 Ca10(PO4)6X2のグループは、ここで、X = Cl, F, オハイオ。18次のように分類されます: アパタイト (FA) Ca ハイドロキシアパ タイト (HA) Ca10(PO4アパタイト (CA) Ca10(PO4)6Cl2 10(PO4)6F2)6(OH)2。
鉱物の形成を誘導する骨芽細胞のセルラインの選択は、各セルライン鉱化作用の異なるプロファイルを表わすので、重要です。本報告では、鉱化作用の 2 つの選択したひと細胞モデルによる鉱物の核形成を比較: 1.19 骨芽細胞 hFOB 細胞と細胞骨肉腫 Sao 2。骨肉腫由来細胞の骨芽細胞のモデルとして使われ、Sao 2 細胞は未分化のヒトの胎児 hFOB 細胞は骨芽細胞の通常のモデルとして幅広く使われている間最も成熟した骨芽細胞の文字19を維持してきた分化20。鉱化作用のプロファイルは、さまざまな方法によって分析された: アリザリン赤 S (イオウ) の染色、紫外線 (UV) 光の可視化、透過電子顕微鏡 (TEM) イメージング、エネルギー分散 x 線 (EDX) の微量分析の定量、およびイオンマッピング。以前の研究で使用される代替技術上の TEM EDX の利点は、アパタイト結晶4,5,21イオン交換の定量的および定性的な結果を与えるということです。TEM EDX を使用しての全体的な目標は、イメージングおよび石灰化過程の異なる段階で細胞の種類から様々 なミネラル Ca、F および Cl イオンの分布の定量化のため簡単な方法を見つけることだった。このメソッドが正常に使用されて、たとえば、共存する化学物質と亜鉛ナノ粒子との結合に及ぼす水生生物22の相互作用を監視するため。別の研究で銅触媒水溶液中でのチタン材料を広く誘導結合プラズマ発光分光分析法 (ICP-OES) N2 物理吸着 (ベット) によって特徴付けられた XRD, 紫外-可視 DRS、FT-IR、ラマン分光法、電子顕微鏡 EDX、および光電気化学測定23。私たちの目的は、小胞および石灰化骨分化を制御するメカニズムを理解する 2 つのセルラインの鉱物の性質と起源を比較しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> 図 1.骨細胞の細胞外マトリックス (ECM) 蛋白質合成と膜からマトリックスの小胞 (MVs) のリリースにおける鉱化作用の初期の段階の。MVs は、リン酸、無機リン酸トランスポーター (PiT) の作用により組織非特異的アルカリホスファターゼ (TNAP) 脱する活動が続く、アネキシン カルシウム結合蛋白質の作用によりカルシウムを蓄積します。PP私P は私、それによってアパタイト核生成を促進します。その後、MVs は崩壊して細胞外媒体にアパタイトをリリースします。石灰化は、P は私と Ca2 +細胞外媒体4、5の安定供給によって支えられています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハム」s DMEM/F12 培地混合物</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy's 5A medium</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>抗生物質混合物 (ペニシリン/ストレプトマイシン)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U/mL each</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 & micro;-</td></tr><tr><td>GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7.5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>for HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td> 米国で<td>合成</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>米国で合成された リン酸ナトリウム緩衝液 Na2HPO4/NaH2PO4混合物</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.0,</td></tr><tr><td>AR-S in PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ型 IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Sil</td></tr> Sister <tr><td>Produced by us Ethanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>絶対99.8%および溶液25、50、75、90%</td></tr><tr><td>酢酸ウラニル50%エタノール</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0.25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD 培地</td><td></td><td></td><td>pH 7.4、当社調製</td></tr><tr><td>固定混合物 (パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>固定後 OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR エタノール中の白色樹脂</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2、1:1、100%</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>pure</td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1.2 mL</td></tr><tr><td>プラスチック ペトリ培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352096 および 352070</td><td>15 mL および 50 mL</td></tr><tr><td>セロロジカル ピペット</td><td>ファルコンおよびVWR</td><td>357521 および 612-3700</td><td>1 および 10 mL</td></tr><tr><td>プラスチック微量遠心チューブ</td><td>シグマ</td><td>Z688312 および Z628034</td><td>1.5 mL 黒 および 2 mL</td></tr><tr><td>透明 プラスチックチップ</td><td>VWR</td><td>613-0364、613-0239、および613-1050</td><td>0.1-10 &micro;Lナチュラル、1-200&マイクロ;Lイエローと200-1000&マイクロ;L、青</td></tr><tr>、<td>プラスチックラック、</td><td>ライトラボ</td><td>A-7055-Z、A-7053-C、</td><td>チューブは緑、マイクロチューブはオレンジ、TEMプローブは青</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>KS12</td><td>HEPAフィルター(DIN EN 1822に準拠したH14)</td></tr><tr><td>インキュベーターHera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34&deg;hFOB 1.19および37&degのC。Saos-2用C</td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>TEM染色用</td></tr><tr><td>ガラスビン</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050および1632414501100</td><td>50および100 mL</td></tr><tr><td>石英ガラス管</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>ポンプ</td><td>IBS インテグラ バイオサイエンス</td><td>真空</td>オーブン<td>用</td>真空安全快適</tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg;C</td></tr><tr><td>磁器マルチウェルプレート</td><td>ローゼンタールテクニック</td><td>229/12</td><td>12</td></tr>ウェル <tr><td>ガラスビーカー</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>ガラスビン</td><td>ポコード</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>プラスチックボックス</td><td>寒天科学株式会社</td><td></td><td>暗闇用</td></tr><tr><td>スナップフィットゼラチンカプセル</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>サイズ1</td></tr><tr><td>Formvar / Carbon 300メッシュNiグリッドボックスAgar</td><td>Scientific Ltd.</td><td>S162N3</td><td>フィルム 光沢面</td></tr><tr><td>シリコンセルスクレーパー</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>サイズ 1.8/25cm</td></tr><tr><td>針付きシリンジ</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>シリンジ 1mL 40 U、針 0.5 x 16</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>チラナ</td><td>CH005L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>MPW 医療機器</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g および 500 x g</td></tr><tr><td>UV トランスルミネーター</td><td>UVP</td><td>M-20</td><td>可視光・紫外線用</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; 切片</td></tr><tr><td>ブロックホルダー</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>丸型</td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>サイズ3</td></tr><tr><td>まつげホルダー</td><td></td><td></td>ウ<td>シ、私たちによって調製</td></tr><tr><td>された鉗子</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>グリッド用帯電防止</td></tr><tr><td>ヘラは</td>、粉末用の<td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>帯電防止</td>を設定します</tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerShot G9</td><td></td><td></td><td>を搭載したCanon AxioObserver Z1を備えた逆光顕微鏡ツァイス位相差、透過光、20倍対物レンズ、RGBフィルター</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>TEM Jeol Co. with Oxford Instruments社とSiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM フルレンジのINCAエネルギー分散型X線微量分析(EDX)システムと11メガピクセルのMORADA G2カメラ</td><td>倍率 TEMは50,000倍、STEMおよびEDXは15,000倍</td></tr><tr><td>カメラ本体とレンズ</td><td>ニコン</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>動画撮影用</td></tr><tr><td>マイク</td><td>MXL マイク</td> 音声<td>録音用</td> <td>Tempo</td></tr></tbody></table>

hfob 1.19 によって生成される鉱物と sao 2 セルを使用して透過型電子顕微鏡エネルギー分散型 x 線微小分析での分析

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

このビデオは、エネルギー分散型 x 線微小分析 (TEM EDX) 小胞の 2 つの人間の骨細胞によって放出における鉱物の状態を比較すると透過型電子顕微鏡の使用を提示: hFOB 1.19 と Sao 2。アスコルビン酸 (AA) と β-グリセロリン酸 (β-GP)、治療後、これらの細胞株における鉱化完全な骨増殖から分化転換を受けるし、アパタイト核生成をトリガーするマトリックスの小胞 (MVs) を生成、細胞外マトリックス (ECM)。
アリザリン赤 S (イオウ) の染色と紫外線 (UV) を使用してセル lysates または続いて EDX 定量とイオン マッピング TEM 画像を用いたベシクルの鉱物組成の分析に基づいて、我々 はその骨肉腫を推論できる Sao 2 及び骨芽細胞hFOB 1.19 セルでは、異なる鉱化作用プロファイルを明らかにします。Sao 2 セル hFOB 1.19 細胞よりもより効率的に石化し、は紫外線の下で見えないがであるより多くの Ca と F の置換ハイドロキシアパ タイト (HA) に類似しているより大きい鉱物沈殿物を作り出します。
これらの技術を使用して得られた結果は、鉱化作用のプロセスがセルの種類によって異なることを結論することできます。細胞レベルでは、小胞の起源性事前鉱物の種類を提案します。

TEM EDX 行列小胞 (MVs) の石灰化細胞によって放出・ M対このテクニックを使用して得られた結果を示す無機化プロセス可能性があります異なる進むことによって生成されるミネラルの体外イメージングが可能になります細胞の様々 なタイプ。2 つのセルの行が、同じ骨芽細胞分化転換治療を受け、まだ AR S によって証明されるよう刺激 Sao 2 細胞鉱 hFOB よりも効率的に 1.19 骨芽細胞染色 (図 2)。これは Sao 2 セル19 hFOB 1.19 細胞20と比較してのより成熟した骨芽細胞の表現型があります。作られた UV transilluminator を使用したサンプルの可視化だけ fluorapatites することができます紫外線 (図 3) の下で観察されることを明らかに。TEM 画像刺激の Sao ...

小胞の 2 つの人間の骨細胞によって放出における鉱物の状態を比較するためのプロトコルを提案する: hFOB 1.19 と Sao 2。自分の鉱化作用のプロファイルによってアリザリン赤-S (イオウ) 染色, 紫外線 (UV) 光可視化、伝達電子顕微鏡検査 (TEM) イメージング、エネルギー分散型 x 線微小分析 (EDX) を行った。

HFOB 1.19 によって生成される鉱物と Sao 2 セルを使用して透過型電子顕微鏡エネルギー分散型 x 線微小分析での分析

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

石灰化の初期段階では、細胞は細胞外マトリックスタンパク質を産生し、カルシウムとリン酸塩を蓄積するマトリックス小胞を放出してアパタイト核形成を促進します。このレポートでは、骨芽細胞hFOB 1.19と骨肉腫Saos-2細胞の2つの選択されたヒト細胞モデルによるミネラルの核形成を比較します。それらの鉱化プロファイルは、さまざまな方法で分析されました。すべての材料を層流の下に置き、UV光の下で滅菌します。培地をウシ胎児血清を含む新鮮な培地10ミリリットルに変更します。休止細胞は刺激装置なしでインキュベートされますが、刺激細胞はアスコルビン酸とβ-グリセロリン酸の両方で処理されます。まず、アスコルビン酸を最終濃度50マイクログラム/ミリリットルまで培養培地の表面に穏やかに滴下し、細胞を刺激します。次に、培地中の最終濃度7.5ミリモルまでβ-グリセロリン酸を添加し、細胞を刺激します。培養皿を静かにかき混ぜ、インキュベーターに7日間入れます。インキュベーションの7日後、細胞培養物をリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄します。2%アリザリンレッドを5ミリリットル加え、プレートを30分間インキュベートしてミネラルを染色します。PBSで3回洗います。皿の壁にPBSを慎重に追加します。ミネラルを破壊しないようにしてください。倒立型光学顕微鏡で鉱物を観察します。細胞培養物から培地を採取し、PBSで細胞を洗浄します。休眠細胞または刺激細胞を500単位/ミリリットルのコラゲナーゼ溶液で37度で3時間3時間消化します。次に、細胞を機械的にこすり落とします。プラスチック製の微量遠心チューブに移します。それらを注射器に10回通します。サンプルを500 gで5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを500マイクロリットルの合成軟骨リンパ液に懸濁します。ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、クロラパタイトの粉末をボトルからUVトランスイルミネーターにヘラで移し、コントロールとして使用します。プラスチックチューブから細胞ライセートをプラスチックチップで移し、UVトランスイルミネーターに慎重に置きます。2.5ミリグラムのヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、およびクロラパタイト粉末を500マイクロリットルの脱イオン水に懸濁します。37度で1時間インキュベートします。帯電防止鉗子付きの箱からFormvar/カーボンニッケルグリッドを取り出し、磁器のマルチウェルプレートに置きます。10マイクロリットルのヒドロキシアパタイト懸濁液をグリッドに落とします。クロラパタイトとフルオロアパタイトについても同じことを行います。サンプルを室温で30分間乾燥させます。休止細胞と刺激細胞を埋め込むための準備をします。細胞培養物から培地を回収します。細胞を生理的脱感作培地で洗浄します。3%パラホルムアルデヒドと1%グルタルアルデヒドの混合物5ミリリットルで、100ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液に細胞を室温で1時間固定します。細胞を5ミリリットルの100ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄します。洗浄後、バッファーをそっと取り出します。暗室で、100ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液に2ミリリットルの四酸化オスミウム1miumでサンプルを後固定します。サンプルをドラフト内で室温で20分間インキュベートします。四酸化オスミウムを除去し、利用します。細胞を5ミリリットルの100ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄します。次に、等級付けされたエタノール溶液シリーズの5ミリリットルアリコートでサンプルを室温、25、50、75、および90%エタノールで脱水します。最後に、無水エタノールを2回使用し、30分と12時間インキュベートします。培養皿から細胞を機械的に掻き取ります。細胞をプラスチック製の微量遠心チューブに集めます。サンプルを130 gで1分間遠心分離します。上清を取り除きます。LR White樹脂と無水エタノールの混合物に細胞を1対2の体積比で懸濁します。よく混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。サンプルを130 gで1分間遠心分離します。上清を取り除きます。LR White樹脂と無水エタノールの1対1の混合物を使用して、前の手順を繰り返します。よく混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。サンプルを130 gで1分間遠心分離します。上清を取り除きます。純粋なLRホワイトレジンをサンプルに加え、プラスチックチューブ内で室温で1時間インキュベートします。サンプルを130 gで1分間遠心分離します。上清を取り除きます。純粋なLRホワイト樹脂を再度追加します。各サンプルの500マイクロリットルをゼラチンカプセルに入れます。サンプルには、レジンがラベルを壊さないように、小さな紙と鉛筆を使用してラベルが付けられていることに注意してください。ゼラチンカプセルを閉じます。カプセルをプラスチック製の微量遠心チューブに入れます。スイングアウトローターで130gで1分間遠心分離します。真空ポンプを使用してプラスチックチューブからカプセルを取り出します。サンプルをオーブンに移し、56度で48時間重合します。ブロックをホルダーに取り付けて準備します。ホルダーをウルトラミクロトームに入れます。ダイヤモンドナイフを取り付けます。脱イオン水で満たします。偶発的な気泡からブレードを清掃することを忘れないでください。次に、脱イオン水浴でダイヤモンドナイフを使用して切片を切断します。ウシのまつげを使ってスクラップをセットします。次に、Formvar/カーボンニッケルグリッドの光沢のある面に置き、乾燥させます。暗室で、合成アパタイトと細胞サンプルのグリッドをエタノール中の2.5%酢酸ウラニルで室温で20分間、ヒュームフードの下で対比染色します。グリッドを50%エタノールで洗浄し、次に脱イオン水で洗浄し、室温で24時間乾燥させます。最後に、グリッドをボックスに入れます。ミネラルや細胞を観察するためにベリリウムホルダーを準備します。帯電防止ツールを使用してください。一対のネジを外します。ベリリウムプレートとベリリウムワッシャーを持ち上げて、リテーナーの残りの部分から離します。グリッドを光沢のある面を上にしてホルダーに取り付けます。ベリリウムワッシャーとベリリウムプレートを慎重に配置します。固定ネジをしっかりとねじ込みます。ホルダーを真空チャンバーに入れ、真空ポンプをオンにします。真空状態になったら、ホルダーをイメージングチャンバーにそっと挿入し、ビームをオンにします。蛍光モニターで、顕微鏡の絞りパラメータを設定します。画像乱視補正を行います。ズーム、フォーカス、フレームを設定し、透過型電子顕微鏡画像を撮影します。検出器をイメージングチャンバーに移動します。フォーカスモードで画像のシャープネスを調整します。X線微量分析のためにサンプル内のポイントを選択し、スペクトルを収集します。カルシウム、フッ素、塩素、リンなどの元素を選択してイオンマッピングを作成し、選択した元素のマッピングを実行します。刺激されたSaos細胞は、hFOB骨芽細胞よりも効率的に石灰化されました。紫外線励起下ではフルオロアパタイトのみが観察できます。HFOB細胞ライセートはSaosよりも蛍光性が高く、これらの細胞にはフルオロアパタイトがより豊富に存在することが示唆されました。刺激を受けたSaos細胞は、hFOB細胞や休眠中のSaos細胞と比較して、ミネラルを含む小胞をより多く産生します。合成アパタイトは、さまざまな鉱物形態を持っていました。上記に適用した手順は、休止および刺激条件下でhFOBおよびSaos細胞に小胞が存在することを示しました。赤色の点はカルシウム、緑リン、青色のフッ素の分布を示しています。刺激条件下では、Saos細胞が産生する小胞中のカルシウムとリンの分布、およびhFOB細胞が産生する小胞中のフッ素とリンとの間には強い重複が見られました。結論として、私たちの調査結果は、小胞が特に細胞レベルでミネラル核形成の主要な決定要因であることを示しています。より効率的に石灰化するSaos-2細胞から放出される小胞と、hFOB 1.19細胞から放出される小胞との比較は、マトリックス小胞がミネラルで満たされた小胞であるという仮説を支持しています。このことは、アパタイト核形成を誘導するためにマトリックス小胞の存在が必要かどうか、そしてこれが生理学的から病理学的に石灰化をどのように変化させるかという疑問を未解決のまま残します。

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学ぶ透過型電子顕微鏡エネルギー分散型X線微小分析によるhFOB 1.19およびSaos-2骨細胞の鉱物化プロファイル比較法。この手法は骨生物学研究における細胞レベルの鉱物核生成メカニズム解明に貢献します。

HFOB 1.19 によって生成される鉱物と Sao 2 セルを使用して透過型電子顕微鏡エネルギー分散型 x 線微小分析での分析

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