分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

このプロトコルの全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼生の脳からニューロン、マクロファージ、ミクログリアを単離し、高品質のRNAを抽出して、qPCRやトランスクリプトミクスなどのダウンストリーム解析を行うことです。トランスジェニック幼生ゼブラフィッシュは、ライブイメージングの強力なツールであり、ミクログリアのような個々の細胞をその生活環境内で経時的に観察する機会を提供してくれます。しかし、その機能を詳細に理解するためには、その遺伝子発現プロファイルを理解する必要があり、当社の単離および選別プロトコルはこの目的のために設計されています。

この技術の主な利点は、遺伝子発現プロファイルへの最小限の変更で中枢神経系からさまざまな種類の細胞を分離できるため、細胞の機能と特性を特徴付けることができることです。このプロトコルの効率は、その有効性に反映されています。このプロトコルでは、さまざまなダウンストリームアプリケーションに対して、短時間で十分な量のRNAを産生することができます。

テキストプロトコルに従ってPTUを含むE3培地でゼブラフィッシュの胚を育てた後、蛍光実体顕微鏡を使用して、GFP陽性マクロファージとDsRED陽性ニューロンのミクログリアについて2 dpfで幼虫をスクリーニングします。1点で胚を均質化するには、麻酔を準備するために、中程度から50匹の幼虫50mlあたり5mlの15ミリモルトリカイン。次に、3 mlのパスツールピペットを使用して、一度に10匹の幼虫を、トリカイン入りの氷冷E3培地で満たされた55 mlのシャーレに移し、最終的に麻酔をかけます。

子宮鏡下で、10匹の幼虫をペトリ皿の中央に整列させ、次に外科用マイクロハサミを使用して卵黄嚢の上の幼虫の頭を横断します。3mlのパスツールピペットを使用して、すべてのヘッドを取り、できるだけ少ない液体で、氷冷メディアA.氷冷E3とトリカインを含む各小さなペトリ皿を30分ごとに新しいものと交換し、冷たいE3とトリカイン培地で切断が行われることを確認します。色が退色し始めたら、ガラスホモジナイザーの氷冷したメディアAを交換します。

頭部の全グループが集められたら、ガラスのホモジナイザーからすべての媒体Aを取除き、氷上にまだ氷で冷たくした媒体A.Withのホモジナイザーの1つのmlと取り替えて下さい、3から5つのdpfの幼虫のための40の押しつぶしそして回転および7および8つのdpfの幼虫のための50の回転を行うことによって脳ティップスを破壊する堅い棒棒を使用して下さい。次に、細胞懸濁液に2 mLの培地Aを加えて細胞を希釈し、ミエリンとの凝集を減らします。細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーに通し、氷上の冷たい50mlのファルコンチューブに流すことにより、細胞凝集を排除します。

この手順を 3 回繰り返します。細胞懸濁液1mlアリコートを冷たい1ポイント5mlチューブに移し、300倍g、摂氏4度で10分間回転させます。次に、23ゲージの1インチ針が付いた10mlの注射器を使用して、上清を取り除きます。

氷冷した22%密度グラジエント培地1 mLにゼロポイント5 mLの氷冷1X dbpsを穏やかに重ね合わせ、細胞ペレットを静かに再懸濁します。チューブを950gで回転させ、摂氏4度の低速加速を中断せずに30分間回転させます。スピン後、間期にトラップされたミエリン中のdbps密度勾配媒体を廃棄します。

次に、ゼロポイント5 mlの培地Aと2%のNGSを使用して細胞を洗浄し、チューブを摂氏4度で300倍gで10分間回転させます。できるだけ多くの上清を取り除き、同じ実験条件から細胞ペレットを2%NGSを含む1 mLの培地Aにまとめます。目的の細胞が蛍光タンパク質を発現している場合は、細胞懸濁液を35ミクロンの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷上の冷たい5 mL FACSチューブに移します。

ミクログリアを免疫染色するには、ゼロポイント3 mlの培地Aと2%のNGSを使用して細胞ペレットを再懸濁し、細胞を3本の1ポイント5 mlチューブに分割します。1本は未染色細胞用で自家蛍光を測定し、1本はミクログリアへの二次抗体の非特異的結合を測定するため、もう1本はテスト用です。すべてのチューブに、1%の低エンドトキシンアジドフリーまたは葉を追加して、免疫グロブリンのFCドメインとCD16、CD32の相互作用をブロックします。次に、5分ごとに穏やかに攪拌しながら細胞を10分間インキュベートします。

次に、3本目のチューブに4C4抗体を添加し、10分ごとに穏やかに撹拌しながら30分間インキュベートします。次に、チューブを300倍g、摂氏4度で10分間回転させます。上清を捨てた後、ペレットをゼロポイント5mlの培地Aと2%のNGSで一度洗浄してから、チューブを再度回転させます。

細胞ペレットをゼロポイント5 mLの培地Aと2%のNGSで再懸濁し、次に1%の葉を加え、5分ごとに穏やかに攪拌しながら細胞を10分間インキュベートします。チューブ2と3に二次抗体を添加し、チューブを暗所に置きます。チューブを回転させて上清を捨てた後、ゼロポイント5 mlの培地Aと2%のNGSを使用してサンプルを2回洗浄し、1 mlの培地Aと2%のNGSで細胞ペレットを再懸濁します。

細胞懸濁液を35ミクロンの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷の上の冷たい5mlのFACSチューブに移します。最後に、テキストプロトコルに従ってFACSソーティングとRNA抽出を行います。この研究では、ニューロンとマクロファージ、およびミクログリアを、8匹のdpf mpeg1 EGFP陽性NBT dsRED陽性幼虫から単離しました。

FACSは、細胞のサイズと粒度の機能によって細胞を破片から分離するために使用されました。次に、単一細胞をダブレットまたは細胞凝集体から分離しました。単一細胞集団から、死んだ細胞を排除するためのゲートを引いた。

対応するドットプロットにより、この実験プロトコルは、死細胞の割合がわずか26.7%であるため、細胞原形質膜の完全性を維持することが明らかになりました。ここに示すように、ニューロンとマクロファージ、およびミクログリアは、生細胞の集団ゲートから容易に分離されました。脳内では、ニューロン集団はマクロファージやミクログリアの集団よりも目立つように見えました。

2つ目の研究では、FACSソーティングを用いて、ミクログリアを特異的に標識する抗体である4C4を用いて、幼虫の脳から生きたミクログリアを分離しました。このミクログリアの単離とRNA抽出データの表に要約されているように、ゼブラフィッシュの幼生の脳内のミクログリアの数はさまざまで、3dpfと非常に低くなっています。最後に、5つのdpfゼブラフィッシュの幼生の脳のミクログリアからの1回の実験で得られたRNA抽出結果を、リボソームRNAの明確な視覚化とともにこの電気泳動トレースに示します。

一度習得すると、このテクニックは、条件ごとに必要なヘッドの数にもよりますが、12時間で行うことができます。この手順を試みるときは、RNAの分解を避けるために、すべてを冷たく保ち、表面を清潔に保つことを覚えておくことが重要です。この技術は、開発後、ゼブラフィッシュをモデルとして神経科学の研究者が、生理学的および病理学的条件下でさまざまな細胞の遺伝子発現プロファイルを探索するための道を開くことになります。

ビデオを見れば、ゼブラフィッシュの幼生の脳からニューロン、マクロファージ、ミクログリアを単離する方法や、高品質なRNAを抽出してqPCRやトランスクリプトミクスなどのダウンストリーム解析を行う方法について、十分に理解できるはずです。