分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出
2018年4月27日
ニューロン、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳生理学的および病理学的条件の下でからを分離するためのプロトコルを提案します。分離時にこれらの細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するから RNA を抽出します。このプロトコルは、qPCR とトランスクリプトミクスのような下流の分析を実行するため高品質の RNA のコレクションをできます。
このプロトコルの全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼生の脳からニューロン、マクロファージ、ミクログリアを単離し、高品質のRNAを抽出して、qPCRやトランスクリプトミクスなどのダウンストリーム解析を行うことです。トランスジェニック幼生ゼブラフィッシュは、ライブイメージングの強力なツールであり、ミクログリアのような個々の細胞をその生活環境内で経時的に観察する機会を提供してくれます。しかし、その機能を詳細に理解するためには、その遺伝子発現プロファイルを理解する必要があり、当社の単離および選別プロトコルはこの目的のために設計されています。
この技術の主な利点は、遺伝子発現プロファイルへの最小限の変更で中枢神経系からさまざまな種類の細胞を分離できるため、細胞の機能と特性を特徴付けることができることです。このプロトコルの効率は、その有効性に反映されています。このプロトコルでは、さまざまなダウンストリームアプリケーションに対して、短時間で十分な量のRNAを産生することができます。
テキストプロトコルに従ってPTUを含むE3培地でゼブラフィッシュの胚を育てた後、蛍光実体顕微鏡を使用して、GFP陽性マクロファージとDsRED陽性ニューロンのミクログリアについて2 dpfで幼虫をスクリーニングします。1点で胚を均質化するには、麻酔を準備するために、中程度から50匹の幼虫50mlあたり5mlの15ミリモルトリカイン。次に、3 mlのパスツールピペットを使用して、一度に10匹の幼虫を、トリカイン入りの氷冷E3培地で満たされた55 mlのシャーレに移し、最終的に麻酔をかけます。
子宮鏡下で、10匹の幼虫をペトリ皿の中央に整列させ、次に外科用マイクロハサミを使用して卵黄嚢の上の幼虫の頭を横断します。3mlのパスツールピペットを使用して、すべてのヘッドを取り、できるだけ少ない液体で、氷冷メディアA.氷冷E3とトリカインを含む各小さなペトリ皿を30分ごとに新しいものと交換し、冷たいE3とトリカイン培地で切断が行われることを確認します。色が退色し始めたら、ガラスホモジナイザーの氷冷したメディアAを交換します。
頭部の全グループが集められたら、ガラスのホモジナイザーからすべての媒体Aを取除き、氷上にまだ氷で冷たくした媒体A.Withのホモジナイザーの1つのmlと取り替えて下さい、3から5つのdpfの幼虫のための40の押しつぶしそして回転および7および8つのdpfの幼虫のための50の回転を行うことによって脳ティップスを破壊する堅い棒棒を使用して下さい。次に、細胞懸濁液に2 mLの培地Aを加えて細胞を希釈し、ミエリンとの凝集を減らします。細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーに通し、氷上の冷たい50mlのファルコンチューブに流すことにより、細胞凝集を排除します。
この手順を 3 回繰り返します。細胞懸濁液1mlアリコートを冷たい1ポイント5mlチューブに移し、300倍g、摂氏4度で10分間回転させます。次に、23ゲージの1インチ針が付いた10mlの注射器を使用して、上清を取り除きます。
氷冷した22%密度グラジエント培地1 mLにゼロポイント5 mLの氷冷1X dbpsを穏やかに重ね合わせ、細胞ペレットを静かに再懸濁します。チューブを950gで回転させ、摂氏4度の低速加速を中断せずに30分間回転させます。スピン後、間期にトラップされたミエリン中のdbps密度勾配媒体を廃棄します。
次に、ゼロポイント5 mlの培地Aと2%のNGSを使用して細胞を洗浄し、チューブを摂氏4度で300倍gで10分間回転させます。できるだけ多くの上清を取り除き、同じ実験条件から細胞ペレットを2%NGSを含む1 mLの培地Aにまとめます。目的の細胞が蛍光タンパク質を発現している場合は、細胞懸濁液を35ミクロンの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷上の冷たい5 mL FACSチューブに移します。
ミクログリアを免疫染色するには、ゼロポイント3 mlの培地Aと2%のNGSを使用して細胞ペレットを再懸濁し、細胞を3本の1ポイント5 mlチューブに分割します。1本は未染色細胞用で自家蛍光を測定し、1本はミクログリアへの二次抗体の非特異的結合を測定するため、もう1本はテスト用です。すべてのチューブに、1%の低エンドトキシンアジドフリーまたは葉を追加して、免疫グロブリンのFCドメインとCD16、CD32の相互作用をブロックします。次に、5分ごとに穏やかに攪拌しながら細胞を10分間インキュベートします。
次に、3本目のチューブに4C4抗体を添加し、10分ごとに穏やかに撹拌しながら30分間インキュベートします。次に、チューブを300倍g、摂氏4度で10分間回転させます。上清を捨てた後、ペレットをゼロポイント5mlの培地Aと2%のNGSで一度洗浄してから、チューブを再度回転させます。
細胞ペレットをゼロポイント5 mLの培地Aと2%のNGSで再懸濁し、次に1%の葉を加え、5分ごとに穏やかに攪拌しながら細胞を10分間インキュベートします。チューブ2と3に二次抗体を添加し、チューブを暗所に置きます。チューブを回転させて上清を捨てた後、ゼロポイント5 mlの培地Aと2%のNGSを使用してサンプルを2回洗浄し、1 mlの培地Aと2%のNGSで細胞ペレットを再懸濁します。
細胞懸濁液を35ミクロンの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷の上の冷たい5mlのFACSチューブに移します。最後に、テキストプロトコルに従ってFACSソーティングとRNA抽出を行います。この研究では、ニューロンとマクロファージ、およびミクログリアを、8匹のdpf mpeg1 EGFP陽性NBT dsRED陽性幼虫から単離しました。
FACSは、細胞のサイズと粒度の機能によって細胞を破片から分離するために使用されました。次に、単一細胞をダブレットまたは細胞凝集体から分離しました。単一細胞集団から、死んだ細胞を排除するためのゲートを引いた。
対応するドットプロットにより、この実験プロトコルは、死細胞の割合がわずか26.7%であるため、細胞原形質膜の完全性を維持することが明らかになりました。ここに示すように、ニューロンとマクロファージ、およびミクログリアは、生細胞の集団ゲートから容易に分離されました。脳内では、ニューロン集団はマクロファージやミクログリアの集団よりも目立つように見えました。
2つ目の研究では、FACSソーティングを用いて、ミクログリアを特異的に標識する抗体である4C4を用いて、幼虫の脳から生きたミクログリアを分離しました。このミクログリアの単離とRNA抽出データの表に要約されているように、ゼブラフィッシュの幼生の脳内のミクログリアの数はさまざまで、3dpfと非常に低くなっています。最後に、5つのdpfゼブラフィッシュの幼生の脳のミクログリアからの1回の実験で得られたRNA抽出結果を、リボソームRNAの明確な視覚化とともにこの電気泳動トレースに示します。
一度習得すると、このテクニックは、条件ごとに必要なヘッドの数にもよりますが、12時間で行うことができます。この手順を試みるときは、RNAの分解を避けるために、すべてを冷たく保ち、表面を清潔に保つことを覚えておくことが重要です。この技術は、開発後、ゼブラフィッシュをモデルとして神経科学の研究者が、生理学的および病理学的条件下でさまざまな細胞の遺伝子発現プロファイルを探索するための道を開くことになります。
ビデオを見れば、ゼブラフィッシュの幼生の脳からニューロン、マクロファージ、ミクログリアを単離する方法や、高品質なRNAを抽出してqPCRやトランスクリプトミクスなどのダウンストリーム解析を行う方法について、十分に理解できるはずです。
概要
この研究は、幼生ゼブラフィッシュの脳からニューロン、マクロファージ、マイクログリアを分離するためのプロトコルを提示し、生理学的および病理学的条件に焦点を当てています。主な目的は、qPCRやトランスクリプトミクスを含む下流の分析のために高品質のRNAを抽出し、これらの細胞タイプの遺伝子発現プロファイルを理解することです。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝学
背景
- トランスジェニックな幼生ゼブラフィッシュは、個々の細胞の生体内イメージングに効果的です。
- 特定の細胞タイプの分離は、それらの機能を調査するために重要です。
- 遺伝子発現プロファイルの理解は、細胞の特性を特徴づけるのに役立ちます。
- このプロトコルでは、分離中の遺伝子発現への変更を最小限に抑えることができます。
研究の目的
- 幼生ゼブラフィッシュを中枢神経系細胞の分離モデルとして使用すること。
- 分離されたニューロン、マクロファージ、マイクログリアの遺伝子発現プロファイルを分析すること。
- qPCRやトランスクリプトミクスなどの下流アプリケーションを容易にすること。
使用された方法
- 様々な条件下での幼生ゼブラフィッシュの脳からの分離。
- 特定の細胞タイプを識別し分離するために蛍光を使用。
- 純度を得るための複数の遠心分離と再懸濁のステップ。
- 細胞を破片や重複から分離するためにFACSソーティングを使用。
主な結果
- この研究は、最小限の細胞死で高純度での細胞分離を達成しました。
- RNA抽出は下流の分析に十分でした。
- 遺伝子発現プロファイルに関する洞察は、細胞機能の理解を深めると予想されます。
結論
- このプロトコルは、ゼブラフィッシュから重要な中枢神経系細胞タイプの効果的な分離を可能にします。
- 遺伝子発現と細胞機能の研究の可能性を高めます。
- 健康と疾病における神経機構の理解への影響は重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating specific CNS cell types from larval zebrafish without altering their gene expression enables mechanistic de-risking in early target validation. This approach supports phenotypic screening and assay development by providing disease-relevant systems with high transcriptional fidelity. The resulting RNA quality (RIN > 7) allows reliable qPCR and transcriptomic analysis, improving predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neurons, macrophages, and microglia with preserved gene expression profiles.
- Operational Value: Uses transgenic lines (NBT:DsRed, mpeg1:eGFP) and 4C4 antibody staining for specific cell isolation without enzymatic digestion that could alter cellular states.
- Predictive Value: Supports biological de-risking and functional target validation by providing access to native CNS cell populations for pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological suspensions ready for downstream functional assays and compound screening.
- Operational Value: Employs FACS with 35 micron straining and density gradient purification to ensure single-cell suspensions free of agglomerates and debris.
- Assay Readiness: Delivers high-quality RNA (RIN > 7) suitable for quantitative gene expression analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant larval zebrafish brains to study CNS cell roles in development and pathology, supporting biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables transcriptomic analysis of microglia and qPCR in neurons/macrophages, facilitating risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Links isolation protocol to gene expression readouts that help clarify cell-specific mechanisms in neurodevelopment and disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neuroinflammatory and neurodegenerative targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating live CNS cells with intact gene expression for mechanistic studies.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, reproducible cell isolation and RNA extraction yielding quantitative transcriptional outputs.
- Analytics: Generates high-integrity RNA (RIN > 7) for qPCR and transcriptomics, providing measurable readouts to compare genetic conditions or treatment effects.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by enabling microglial and neuronal profiling in zebrafish disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for isolating zebrafish CNS cells applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS cell function through native-state isolation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cold mechanical homogenization, FACS gating, and RNA quality controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early transcriptional data from disease-relevant systems, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated CNS cell expression profiles from zebrafish models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, fluorescent microscopy, and FACS operation for accurate cell sorting.
- Depends on access to cold homogenizers, centrifuges, cell strainers (40 and 35 micron), and FACS equipment maintained at 4°C.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols (e.g., 4C4 antibody, NGS blocking) and RNA extraction QC to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol across different larval ages (3–8 dpf) and transgenic lines.
- Includes practical limitations such as low microglia yield at early stages (3 dpf) and the need to avoid RNA degradation through strict cold-chain and aseptic handling.
