Name: 自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ 蛍光標識組織の自動セグメンテーション手法。広視野高コンテンツ分析システムを用いて、組織内タンパク質の定量化を迅速かつ正確に行うワークフローを確立します。

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このプロジェクトは、健康の研究のカナダの協会、アルバータ州の革新 - 健康ソリューション/アルバータ州がん財団からの助成金によって賄われていた。著者は神経生物学コア施設機器、建物、スライド、WHCAS でスキャン可能にされた、財団と製品の作成者のポーラの Gedraitis の仕事の使用のために再生装置を認めるたいです。分子デバイスは、この資料に記載されています。

腫瘍の標本は、ローカル施設内審査委員会および倫理委員会で承認された各国の規制に従って実施プロトコルに従って得られました。WHCAS とその関連ソフトウェアのこの記事で使用の材料表のとおりです。
1. 仕訳帳をインポートします。
<ol><li>関連付けられたソフトウェアを開きます。</li>
	<li>材料の表に示されているジャーナル スイートをダウンロードします。</li>
	<li>メイン メニューのジャーナルの見出しをクリックして、適切なディレクトリにジャーナル スイートをインポートインポート仕訳帳スイート...を選択し、インポートをクリックします。</li>
</ol>2. 作成の設定プレビュー スキャン取得
<ol><li>プレート獲得のセットアップ] ダイアログ ボックスでに行く目的とカメラ] タブ [4 X 倍率、カメラのビニングとして 1 と 2 のゲインとして。</li>
	<li>図 1 aにタブ板-Slidescanningの下の設定を入力します。 注: これらの設定は、ユーザーに表示し、最大 3 つのスライドを移動できるように作成されています。各スライドは、簡単なナビゲーションのための 3 の隣接する井戸に分割されているし、'ライブ' 組織スライスまたは細胞の可視化。</li>
	<li>[訪問サイト] タブでサイトに井戸を均一に埋めます。</li>
	<li>プレート下部設定の編集...] をクリックし、図 1 bに表示される値を入力します。</li>
	<li>集録ループ] タブで、[プレビュー スキャンの所望の波長 (この例では、核の染色) を入力します。最高のコントラストと画像ベースの焦点は、最も明るい蛍光信号 (例えば、しばしば核染色) を使用します。 これにより、バック グラウンドと比較してコントラストの高いのでメモ: 核染色など明るい染みのついた組織を染色推奨します。サンプルの場所にこの援助をするだけ、明るい色を他の色のイメージのオフセットを基に使用されます次の高倍率獲得の 1 つ以上の蛍光イメージングしているとき、。</li>
	<li>画像を一緒にステッチするプレート ・ アクイジション ・ モードでは、シェーディング補正を有効にします。</li>
	<li>A. 設定としてこの設定を保存します。</li>
</ol>3. 高倍率でスライド取得の設定の作成
<ol><li>プレート獲得のセットアップ] ダイアログ ボックスでに行く目的とカメラのタブ選択 40 X (最高デジタル解像度の)、ビニング カメラとして 1 と 2 (信号と画像の明るさを向上させる) を利得として、倍率として。 注: は、対物レンズの倍率を低く設定を使用できますが、筆者は 40 X 人間ミクログリアと多波長セル スコアリングモジュールを使用して脳腫瘍組織におけるマクロファージの分析に最適の設定をします。</li>
	<li>プレート-Slidescanningおよび編集プレート下部の設定... ] タブと同じ A の設定は、すべての設定を確認 (手順 2 を参照してください)。</li>
	<li>得られる画像が鮮明ではなく、フォーカスを調整する井戸の深さ、プレートの高さ、およびプレートの下の設定を変更します。フォーカスの問題はまだ、オート フォーカス オプション] セクションの下でイメージの回復とレーザーを選択します。</li>
	<li>集録ループ] タブで、[、サンプルで現在の波長の数を入力します。レーザー ベースの焦点を有効にして、イメージ ベースの (買収またはレーザー回復) の焦点を有効にするオプションを確認します。</li>
	<li>[オート フォーカス] タブ [プレートと下部にもフォーカスを選択します。</li>
	<li>仕訳帳] タブで、図 2も選択できないようにする非同期ハードウェアに移動を確実に記載されているオプションを選択します。</li>
	<li>B. 設定としてこの設定を保存します。</li>
</ol>4. 広視野高コンテンツ分析システムでスライドを配置します。
<ol><li>メイン メニューを表示f4 キーを押します。スライドのスキャンを選択します。オープンドア-取り出しスライドをクリックし、(図 3 a と 3 b) WHCAS スライドとスライド アダプター (が最大 3 つのスライドを保持できる) に挿入します。下向き coverslip スライド アダプター (図 3 a) の切り込み側にラベルとスライドを向き。 注: この実験で使用するスライドは、1 mm スライド x 75 x 標準 25 でした。</li>
	<li>ドアを閉じる-スライドをロードするをクリックします。</li>
</ol>5. プレビュー スキャンを取得
<ol><li>スクリーニングの見出しの下プレート集録/制御.とプレートの取得設定を選択し、設定 A に読み込む</li>
	<li>訪問する井戸タブの下も含むサンプルでは、マウスの右ボタンを使用して移動します。訪問するサイトタブの下には、セルがあるまでライブ画像キャプチャと別のサイトに移動します。手動でサンプルに焦点を当てるか、オート フォーカスを使用します。スナップを使用して、イメージをキャプチャします。 注: このサンプルは、詳細サイトやフィッティングもサイトで検索が容易に (手順 2.3 を参照してください)。</li>
	<li>メイン メニューのスライドのプレビューを選択します。</li>
	<li>自動的にポップアップ表示されるダイアログ ボックスでスキャンしようとしているどのように多くのスライドを反映してオプションを選択します。一度に 1 つのスライドをスキャンします。[Ok]を押します。倍率として 4 X を選択します。[Ok]を押します。スライドの向きを (使用する補正カラー別 coverslip の厚さが使用される場合) としてCoverslip (0.17 mm) ダウンを選択します。[Ok]を押します。続行をクリックします。 注: ユーザーが 2 以上のスライドのプレビュー スキャンを取得しようとすると、各プレビュー スキャンは、個別に対応する高倍率の画像の獲得の前に開きます。</li>
	<li>[ロード スキャン スライド設定]取得の設定、キャリブレーションのボックスがチェックされますを確認します。ボタンを押してキャンセルします。スライド設定のスキャンボックスが再び表示される場合は、続行を選択します。</li>
	<li>スライドをスキャン] ダイアログ ボックスが表示されたら、図 4 a-4 Cで推奨されている設定を調整します。閉じる終了を選択します。 注: は、低いデジタル解像度、ダイナミック レンジ、それぞれ、それ故に減少の画質とはいえ高速スキャンになりますカメラのビニングとカメラの露光時間の減少を増加します。シェーディング補正は単一の視野間一様な強度を保ちます。スキャンは、フォーカス、走査速度が低下、ハードウェアとイメージのオート フォーカス オンされますを確認します。時間を節約、低倍率のスキャンを取得しながら陰影補正とハードウェアとオフ画像のオート フォーカスを持っているが、これらのオプションを持っているオン手順 6 の高倍率画像の中にそれをお勧めします。低倍率のスキャンの解像度は、高倍率のスキャンの解像度には影響を与えません。</li>
	<li>スライドのスキャニング データ用のディレクトリを選択します。[Ok]をクリックします。ファイルの名前を入力します。[Ok]をクリックします。</li>
	<li>描画領域] ダイアログ ボックスが自動的に表示されます。図 5 bに示すように、全体のプレビューのスキャン領域を選択するには、矩形ツール (図 5 a) を使用します。続行をクリックします。</li>
	<li>[セットアップの完了] ダイアログ ボックスが表示されます。続行を選択します。 注: プレビュー スライドのスキャンを開始します。</li>
	<li>プレビューを完了すると、スキャン完了のダイアログ ボックスが表示されます。続行を選択します。プレビュー スキャン ウィンドウは閉じないで (この例では、 DAPI スキャンウィンドウは図 6を参照)。 注: セットアップと低倍率スキャン習得過程約 20 分になります。後続の高倍率画像の取込時間は各チャンネルの露出度だけでなく、選択したサイトの数によって異なります。</li>
</ol>6. 高倍率のスキャン
<ol><li>B. の設定をロードします。</li>
	<li>イメージを作成する井戸を決定します。訪問する井戸タブの下も含むサンプルでは、マウスの右ボタンを使用して移動します。 注:、技術がよく 1 をイメージングによって実証ここ。</li>
	<li>訪問するサイトのタブの下には、細胞や組織があるまでLiveの機能を持つ別のサイトに移動します。手動でサンプルに焦点を当てるか、オート フォーカスを使用します。スナップを使用して、イメージをキャプチャします。 注: 高倍率でサンプルを見つけるを支援するためには、どこでも 5 からオート フォーカスできない場合は、サンプルを見つけるの 100 μ m のステップ サイズ調整するのにプレート集録/制御ダイアログを使用します。</li>
	<li>W1 DAPI ] タブで、[自動公開をクリックします。鮮明なプレート取得スナップ - DAPIイメージを確認します。</li>
	<li>メイン メニューで、[ジャーナルプルダウン ・ メニューを明らかにするためにクリックします。ジャーナル. を実行を選択します。</li>
	<li>それを起動してスライド領域取得セットアップジャーナルをダブルクリックします。セットアップのスライド領域の取得] ダイアログ ボックスが表示されたら、続行を選択します。</li>
	<li>指示されると、正しく、 DAPI スキャン低倍率スライド イメージを選択するを選択します。[Ok]を押します。同様に、強調表示プレート取得スナップ - DAPI プレート取得スナップを求められたとき。[Ok]をクリックします。</li>
	<li>作成またはロード領域ボックスが表示されたら、DAPI スキャン (図 6) 利息の (a) の地域を選択するのに四角形領域ツールを使用します。続行を押します。 注: 40 X で選択できる最大面積は、45 列、35 行です。興味の複数の領域を選択すると、最大領域] ボックスに領域のサイズが変更されます。サイズ変更後は、ボックスの位置を変更できます。</li>
	<li>負荷領域] ダイアログ ボックスでいいえを選択します。 注: 選択はい負荷以前に保存したスライドのバッチのための領域の興味の場所の同じ地域。</li>
	<li>検索ツールを使用すると、関心の最大領域をハイライトし、 [領域の選択] ダイアログ ボックスで続行を押します。領域の確認ボックスが表示されたら、続行を選択します。保存領域] ダイアログ ボックスが表示されたら保存する領域が必要かどうかを決定します。</li>
	<li>サイトの間隔、次のダイアログ ボックスでは、タイル重複、または10% の重複なしでイメージで結果を選択することができます。オプションを選択し、 [ok]をクリックします。著者は、タイルを選んだ。</li>
	<li>3 つのダイアログ ボックスが今すぐ表示されます。セットアップの完了ボックスは、続行を押すことで閉じることができます。40 X の取得サイトのセットアップボックス (図 7 a) を開いたまま今のところ明確などのように多くの列になりますので行プレート取得セットアップボックス (図 7 b) に入力する必要があります。WellPositionsボックス (図 7) が表示されたら左下隅で開いたまま、イメージングの持続期間のため。</li>
	<li>訪問する井戸、下のプレート取得セットアップボックスで以前に選択した関心領域と同数の井戸がある必要があります (図 7) を強調表示します。 注: スライドあたりの金利の 9 つの地域の最大のこのプロトコルを開発しました。場合はより多くがある、関心領域の数を反映するプレート - SlideScanningタブに列または行の数を増やします。これらの井戸が空間的任意の方法で関心領域の場所を表さないが、適切な数は、強調表示されている (左クリック) をする必要があります。</li>
	<li>プレート取得設定ボックスで訪問するサイト] タブに移動は、提示された列と行 (図 7 b) を入力します。タイルのサイト上をクリックしてください。</li>
	<li>サンプルが含まれているサイトを見つけることの当て推量を排除するために事前に選択した関心領域にステージを配置する[概要] タブの下でプレートの取得を押します。カメラをパン細胞を含むサイトを一度、画像の取得を停止するには、右下隅でキャンセルを押します。舞台は現在を確認、サンプル上に位置します。</li>
	<li>重点的と高ダイナミック レンジ画像が得られることを確保するための波長設定を最適化します。問題がなければ、[概要] タブとプレートの取得をクリックします。</li>
</ol>7. 画像解析
<ol><li>目的のカスタム モジュールを選択します。 注: 著者は、脳腫瘍のスライドの自動セグメンテーションを実証する多波長セル スコアリングモジュールを選んだ。</li>
	<li>すべてのサイトの分析を実行します。解析パラメーターは、多くのスライドのため同じです、プレート取得セットアップボックス [投稿買収] タブで分析が囲めます。</li>
	<li>分析が完了すると、結果をバイアスしないように画質の悪さのすべてのサイトを除外します。この分析の目的は小グリア細胞および腫瘍細胞のマクロファージを定量化するため、腫瘍サンプルのエッジに関心の領域を選択します。さらに、焦点がずれているおよび/または組織のひだまたは泡およびティッシュで涙を含むサイトを除外します。デモンストレーションでは、代表の結果を参照してください。また、どのサイトが除外される以下のしきい値としてレーザー反射の振幅によってサイトごとに生成されるレーザー フォーカス スコアを使用して (しきい値は、カスタマイズと露光時間などのパラメーターによって異なります、使用するメディアの種類)。 メモ: 高倍率画像ください必要に応じて具体的には大きな血管や壊死の領域などの構造を除外すること。また、hypercellular などの関心のある分野だけを含めることが可能です。このように、特異性、分析の精度を向上できます。</li>
</ol>

<ol><li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li>
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<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li>
</ol>

著者は、本稿に記載されている製品の金銭的な利益と開示する他の何もあります。

生物科学の研究の効率を妨げる共通の問題まだ蛍光標識した組織の公平な正確なそして正確な定量化とその構造内のプロトコルの開発であります。時間と労力のかなりの量は、彼らのイメージが作成された後、組織スライドを分析する方法を見つけるし向けています。多くの既存メソッドは、ユーザーがプログラム12,13,14内を再作成するためのアルゴリズムを提供します。これらのメソッドは受け入れられる, しかし、この報告書の意義は、簡単かつ迅速に確立包括的な画像の獲得および分析のプロトコル、ユーザーは、WHCAS へのアクセスを持っている場合することができます。たとえば、細胞の種類を区別し、複数の構造とプロセス、細胞周期解析、核移行を定量化の試金は関連するソフトウェアで利用可能な既に。
セットアップには、いくつかの重要な手順が含まれます。まず、スライドの空間パラメーターは、プレートであるかのように定義されます。第二に、高倍率のイメージングのための関心領域の選択元となる低倍率の概要スキャンが作成されます。最後に、精度と解析の精度に影響を与えるサイトは除外されます。この技法の最大の制限は、適用性に依存しているかどうか、ユーザーは、WHCAS へのアクセスです。ただし、ハイコン テント分析システムの増加する必要性とでは、競争力のある15のままに自分の研究者にこれらの多くの機関を提供します。トラブルシューティングが必要最もよくティッシュ セクションは同じ厚さを持っていないときです。興味の複数の領域が選択されている場合いくつか焦点になります一方、他の人はしません。理想的には、断面、中にユーザーを取る気になる同質なサンプルを作成します。ただし、サンプルの整合性がない場合関心ごとアウト フォーカス領域とビューの各フィールド フォーカスするために使用、核染色波長 (またはユーザーの最も明るい蛍光) にフォーカスが調整できます。他の波長は単に核染色の波長からオフセット、区画整理この波長だけ必要があります。
このレポートでは、スキャンおよび WHCAS と関連付けられているソフトウェアを使用してスライドを分析する方法を詳しく説明します。多波長セル スコアリング モジュールでは、蛍光ラベル付けされているすべての核、細胞質マーカーを自動的にカウントすることができます。フォーカス設定を調整し、幅や組織のイメージを作成するモジュールをカスタマイズするエリアなど携帯電話の特性を定義した後にさらにイメージ化されたスライドと定量的データを取得するユーザーの介入の必要性があります。最大 3 つのスライドのイメージを作成時に、興味の複数の領域を定義することができます。このプロトコルではスライドを分析する必要がある WHCAS ユーザーを活用、カスタマイズ可能な多目的、自動ワークフローには少しの最適化を必要とし、将来的に組織の組織学的解析を含むすべてのプロジェクトで適用できます。

スライドに蛍光標識した組織の正確かつ正確な定量は多くの科学分野で非常に人気の技術です。ただし、研究者は多くの場合手動で標本をカウントまたはこれを達成するために密教の自動化された技術の開発にかなりの時間を過ごします。ここで、自動スライドのスキャニングと、WHCAS とその関連のソフトウェアを用いた例として冷凍人間の脳腫瘍のセクションの自然免疫系細胞の細胞の定量のためのプロトコルを提供します。関連ソフトウェアは、神経突起伸長細胞型1,2,3,4,5,の分化にカウントから組み込みカスタマイズ可能なモジュールの広い範囲を提供しています6。 このメソッドの目標の画像を取得し、任意のスライド マウントの組織内のエンティティの蛍光標識を量的に表わす開始から終了まで、簡単に再現できるプロトコルを研究者に提供することです。
このプロトコルでは、WHCAS は、イメージング関連ソフトウェアのそれに続く分析のためプレート スライド アダプターと基本スライド スキャン7利用可能であったにもかかわらずに用いられます。製品担当者と連絡を合わせた loadouts を作成、適切な仕訳帳の選択取得面積の注意空間キャリブレーションが必要なのでイメージのスライドに法外だった。専用スライド画像や分析装置8、購入の代わりに、文献の広いボディでは、このソフトウェアへのアクセスを以前の技術レポートは WHCAS 全体で9のスライド画像の獲得を回避しました。画像集録や画像解析を実行する異なるプラットフォーム上には、それぞれが他と互換性があることを確認する追加の作業が必要となります。
イメージをキャプチャする、WHCAS とそのソフトウェアを使用する能力は、検索またはこれらのツールをワークフロー エイリアンの開発の不必要な合併症を避けるでしょう。この記事で、プレートとしてスライドを扱うことで低倍率の概要スキャンおよび対応する高倍率画像の作成に必要な手順と多波長セル得点セグメンテーション モジュールを使用して以降の解析を可能にする、WHCAS の転用。WHCAS で画像を集録したら、アルゴリズムまたはマルチ ステップ カウント プロトコル10,11を開発する必要性がないために、この容易に利用可能なプロトコルは代替技術上の優位性を提供します。このプロトコルは定量法の最適化に必要な時間を軽減より正確な12と手動カウントよりも効率的、WHCAS を最大限に利用し。画像とスライドに蛍光標識したティッシュの分析が可能になります、このプロトコルを広く簡単に使用することができます。

<table><tbody><tr><td>ImageXpress MicroXLS</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>画像取得用装置</td></tr><tr><td>MetaXpress 5.1</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>ImageXpress MicroXL用の関連ソフトウェア(Windowsオペレーティングシステムを搭載したPC上で動作します)。</td></tr><tr><td>スライドアダプター</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>ImageXpress MicroXL</td></tr><tr><td>Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide またはMolecular Devices代表の連絡先から入手できる</td></tr><tr><td>Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL</td><td>Molecularデバイス</td><td>NA</td><td>ステップ 6.6 でこのジャーナルを選択します。</td></tr></tbody></table>

自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

自動スライドのスキャニング、蛍光標識した組織の分割全体スライドや大きなティッシュ セクションを分析する最も効率的な方法です。残念ながら、多くの研究者は、大量の時間とリソースの開発と独自の実験には、ワークフローの最適化を過ごします。この記事に関連するソフトウェアは、あらかじめ構築されたモジュール内でカスタマイズするためのオプションと、スライド マウントする任意の組織をイメージする広視野高内容分析システム (WHCAS) へのアクセスとのそれらによって使用できるプロトコルについて述べる.本来意図しないスライドをスキャンするため、この資料で説明されている手順は、関連ソフトウェアにインポートすることができます WHCAS のイメージをスキャンするスライドを得ることが可能。この例では、脳腫瘍のスライドの自動セグメンテーションを示したが、蛍光標識した核や細胞質マーカーの自動セグメンテーションが可能です。さらに、蛋白質のローカリゼーション/転置、細胞の増殖・生存率/アポトーシス、および実行することができます血管新生アッセイを含む他の定量的なソフトウェア モジュールのさまざまながあります。この手法は研究者の時間と労力を節約、スライド分析の自動化されたプロトコルを作成します。

WHCAS ソフトウェア内で画像を表示できます。図 8には、関心の特定の領域内のすべてのサイトの高倍率のサムネイルが表示されます。(例図 8 図 9、低、高倍率でそれぞれ) 解析から除外すべきものを識別するために各サイトを確認してください。たとえば、サイト 149 が合って (図 9 a)、サイト 219 は泡 (図 9 b) およびサイト 54 倍 (図 9) を含む、除外する必要があります。イメージを作成するすべてのサイトの 10-15% を除外するが一般的です。例では、サイトの 15.3% を除外した (25/300 いた泡、17/300 が合っていた、3/300 が折り畳まれた, し、1/300 の端にあった)。図 10 aは、分析 (対応する低倍率サムネイルは図 8に示す) 代表的なイメージです。多波長セル スコアリング モジュールによって生成された対応するオーバーレイが著者の仕様に合わせてカスタマイズ サイト 59 に対して自動分割の結果を示すここでは、(核最小幅 2.5 μ m、最大幅を = = 7.5 μ m上記のローカル背景強度 = 35 graylevels;CD11b 陽性細胞の最小幅 4 μ m、最大幅を = = 18 μ m、最小すすけるエリア = 15 μ m2、上記のローカル背景強度 = 310 graylevels;CD45 陽性細胞の最小幅 4 μ m、最大幅を = = 18 μ m、最小すすけるエリア = 15 μ m2、上記のローカル背景強度 50 graylevels を =)。次の分割、各マーカー陽性細胞の割合の定量的データ (6.2 ± 5.1% と cd11b 3.8 ± 2.1%+と CD45+<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank"></a>

ここで広視野高内容分析システム (WHCAS) を使用してスライドに蛍光に分類された組織の自動抽出のためのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、生物科学、医用工学、健康科学など生体内蛍光マーカーの定量を含む任意のフィールドで幅広い用途があります。

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

このイメージングおよび分析法の全体的な目標は、蛍光標識されたスライドマウント組織サンプルの自動セグメンテーションのためのセットアップが容易なワークフローを生成することです。この方法は、関心のある組織サンプルの特定の領域内に特定のタンパク質がどれだけ含まれているかという生物科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、自動セグメンテーションのためのプロトコルを最適化する時間を節約でき、この方法をその後の蛍光標識スライドマウント組織サンプルに適用できることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、脳組織の新しい細胞を高倍率で定量する必要があったときでした。ジャーナルをインポートした後、Plate Acquisition Setupダイアログボックスを開き、対物レンズとカメラタブを開きます。[Magnification (倍率)] を 4 倍に、[Camera Binning (カメラのビニング)] を 1 に、[Gain (ゲイン)] を 2 に設定します。「Plate Slide Scanning」タブを開き、適切な実験設定を入力します。「Sites to Visit」タブで、ウェルに施設を均一に充填し、「Edit Plate Bottom Settings」タブを開いて適切な実験値を入力します。これらの設定を設定Aとして保存した後、[対物レンズ]タブと[カメラ]タブを開き、[倍率]を40倍に、[カメラのビニング]を1に、[ゲイン]を2に設定します。[Plate Slide Scanning]タブと[Edit Plate Bottom Settings]タブのすべての設定が[Setting A]で入力したものと同じであることを確認し、[Acquisition Loop]タブを開きます。サンプルに存在する波長の数を入力し、[Enable laser-based focusing with the laser-based focusing and Enable image-based focusing]オプションをオンにします。次に、これらの設定を設定Bとして保存します。次に、最大3つのスライドを配置し、ノッチの側面にあるラベルでスリップを下にしてスライドアダプターに覆います。そして、F4を押してメインメニューを開きます。[スライドスキャン]を選択し、[オープンドアイジェクトスライド]をクリックして、スライドアダプターをワイドフィールドハイコンテント分析システムに挿入します。次に、「Close Door」、「Load Slide」をクリックします。まず、適切な波長が選択されていることを確認します。対象領域が見つかるまで、ライブ フィーチャ イメージ内の別のサイトに移動します。地域に焦点を当てます。ピントが合っていない場合は、オートフォーカスボタンを使用するか、ピントが合うまでステップサイズを調整します。スナップを使用して画像をキャプチャします(ステップサイズを変更して手動でフォーカスを調整する場合)。以前のスキャンを設定するには、まず設定Aをロードし、[スライドのプレビュー]を選択します。スライドの数を指定し、[OK] を選択します。倍率として4倍を選択します。次に、[カバースリップ]を選択し、前のスキャンの基本設定を選択します。[Acquisition setting] と [Calibrations] の両方がチェックされていることを確認してから、[Cancel] を選択し、[Continue] を押します。「W1:DAPI」タブで、「Live」をクリックし、「Auto Expose」をクリックし、「Snap」をクリックします。この後、[閉じる]を押します。ディレクトリを選択し、以前のスキャン名を入力します。[領域の描画]ダイアログボックスが自動的に表示されます。長方形の領域ツールを使用して、前のスキャン領域全体を選択し、[続行]をクリックします。前回のスキャンの最後に、設定Bをロードし、[訪問するサイト]タブを開きます。まず、適切な波長が選択されていることを確認します。対象領域が見つかるまで、ライブ フィーチャ イメージ内の別のサイトに移動します。地域に焦点を当てます。ピントが合っていない場合は、オートフォーカスボタンを使用するか、ピントが合うまでステップサイズを調整します。スナップを使用して画像をキャプチャします(ステップサイズを変更して手動でフォーカスを調整する場合)。次に、[W1 DAPI]タブで[Auto Expose]をクリックし、[Plate Acquisitions Snap DAPI]画像が鮮明であることを確認します。メイン メニューで [ジャーナル] をクリックし、プルダウン メニューで [ジャーナルの実行] を選択します。「Slide Region Acquisition Setup Journal」をダブルクリックして起動し、「Setup Slide Region Acquisition」ダイアログ・ボックスが表示されたら「Continue」をクリックします。指示されたら、DAPIスキャンを選択して低倍率のスライド画像を選択し、[OK]をクリックします。Plate Acquisition Snap(プレート取得スナップ)を求められたら、Plate Acquisition Snap-DAPIをハイライト表示し、OKをクリックします。「領域の作成またはロード」ボックスが表示されたら、「矩形領域」ツールを使用して DAPI スキャンの対象領域を選択し、「続行」をクリックします。ロケーター ツールを使用して、対象地域をハイライト表示し、[Select Region] ダイアログ ボックスの下にある [Continue] をクリックします。「領域の確認」ボックスが表示されたら、「続行」をクリックし、「領域の保存」ダイアログ・ボックスが表示されたら、領域を保存する必要があるかどうかを決定します。3つのダイアログボックスが表示されます。[続行] をクリックして [セットアップ完了] ボックスを閉じます。サンプルサイト検索の当て推量を排除するには、「Display Settings」タブの「Display images during acquisition」にチェックが入っていることを確認し、「Summary」タブを開いて「Acquire Plate」をクリックし、事前に選択した関心領域のステージを配置します。対象のセルを含むサイトをカメラでパンしたら、[キャンセル] をクリックして画像取得を停止します。画像のピントが合っていない場合でも心配しないでください。この手順は、選択した関心領域に最初のサイトのステージを配置するためだけのものです。ステージがサンプルの上にあり、サイト数が正しく入力されていることを確認します。波長設定を最適化して、高ダイナミックレンジの画像が得られるようにします。次に、「サマリー」タブを再度開き、「プレートを獲得」をクリックします。解析の最後に、[表示]タブを選択します。「Image Overlay」プルダウン・メニューで、「Show well information」を選択して、左上隅にサイト番号を表示します。サイトをスクロールして、焦点が合っていないサイトや、組織のひだや組織内の気泡や裂け目が含まれているサイトを除外します。この代表的な画像では、定義された関心領域内のすべてのサイトの高倍率サムネイルが表示されています。各サイトを確認して、分析から除外する必要があるサイトを特定する必要があります。たとえば、この実験では、サイト 149 は焦点が合わず、サイト 219 には気泡があり、サイト 54 には折り目が含まれていました。これら3つのサイトはすべて分析から除外されました。ここでは、多波長細胞スコアリングモジュールによって生成された対応するオーバーレイは、実験仕様に従ってカスタマイズされたサイト59で実施された自動セグメンテーションの結果を実証する。セグメンテーション後、各マーカー、両マーカー、マーカーなし、平均染色面積、および平均蛍光強度について、陽性染色した細胞の割合の定量データを得ることができる。このビデオを見れば、スライドマウントされた組織サンプルのイメージングとセグメンテーションのための自動ワークフローを作成するための広視野ハイコンテント解析システムのセットアップ方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

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自動スライドスキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

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