自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

このイメージングおよび分析法の全体的な目標は、蛍光標識されたスライドマウント組織サンプルの自動セグメンテーションのためのセットアップが容易なワークフローを生成することです。この方法は、関心のある組織サンプルの特定の領域内に特定のタンパク質がどれだけ含まれているかという生物科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、自動セグメンテーションのためのプロトコルを最適化する時間を節約でき、この方法をその後の蛍光標識スライドマウント組織サンプルに適用できることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、脳組織の新しい細胞を高倍率で定量する必要があったときでした。ジャーナルをインポートした後、Plate Acquisition Setupダイアログボックスを開き、対物レンズとカメラタブを開きます。[Magnification (倍率)] を 4 倍に、[Camera Binning (カメラのビニング)] を 1 に、[Gain (ゲイン)] を 2 に設定します。

「Plate Slide Scanning」タブを開き、適切な実験設定を入力します。「Sites to Visit」タブで、ウェルに施設を均一に充填し、「Edit Plate Bottom Settings」タブを開いて適切な実験値を入力します。これらの設定を設定Aとして保存した後、[対物レンズ]タブと[カメラ]タブを開き、[倍率]を40倍に、[カメラのビニング]を1に、[ゲイン]を2に設定します。

[Plate Slide Scanning]タブと[Edit Plate Bottom Settings]タブのすべての設定が[Setting A]で入力したものと同じであることを確認し、[Acquisition Loop]タブを開きます。サンプルに存在する波長の数を入力し、[Enable laser-based focusing with the laser-based focusing and Enable image-based focusing]オプションをオンにします。次に、これらの設定を設定Bとして保存します。次に、最大3つのスライドを配置し、ノッチの側面にあるラベルでスリップを下にしてスライドアダプターに覆います。

そして、F4を押してメインメニューを開きます。[スライドスキャン]を選択し、[オープンドアイジェクトスライド]をクリックして、スライドアダプターをワイドフィールドハイコンテント分析システムに挿入します。次に、「Close Door」、「Load Slide」をクリックします。

まず、適切な波長が選択されていることを確認します。対象領域が見つかるまで、ライブ フィーチャ イメージ内の別のサイトに移動します。地域に焦点を当てます。

ピントが合っていない場合は、オートフォーカスボタンを使用するか、ピントが合うまでステップサイズを調整します。スナップを使用して画像をキャプチャします(ステップサイズを変更して手動でフォーカスを調整する場合)。以前のスキャンを設定するには、まず設定Aをロードし、[スライドのプレビュー]を選択します。

スライドの数を指定し、[OK] を選択します。倍率として4倍を選択します。次に、[カバースリップ]を選択し、前のスキャンの基本設定を選択します。[Acquisition setting] と [Calibrations] の両方がチェックされていることを確認してから、[Cancel] を選択し、[Continue] を押します。

「W1:DAPI」タブで、「Live」をクリックし、「Auto Expose」をクリックし、「Snap」をクリックします。この後、[閉じる]を押します。ディレクトリを選択し、以前のスキャン名を入力します。

[領域の描画]ダイアログボックスが自動的に表示されます。長方形の領域ツールを使用して、前のスキャン領域全体を選択し、[続行]をクリックします。前回のスキャンの最後に、設定Bをロードし、[訪問するサイト]タブを開きます。

まず、適切な波長が選択されていることを確認します。対象領域が見つかるまで、ライブ フィーチャ イメージ内の別のサイトに移動します。地域に焦点を当てます。

ピントが合っていない場合は、オートフォーカスボタンを使用するか、ピントが合うまでステップサイズを調整します。スナップを使用して画像をキャプチャします(ステップサイズを変更して手動でフォーカスを調整する場合)。次に、[W1 DAPI]タブで[Auto Expose]をクリックし、[Plate Acquisitions Snap DAPI]画像が鮮明であることを確認します。

メイン メニューで [ジャーナル] をクリックし、プルダウン メニューで [ジャーナルの実行] を選択します。「Slide Region Acquisition Setup Journal」をダブルクリックして起動し、「Setup Slide Region Acquisition」ダイアログ・ボックスが表示されたら「Continue」をクリックします。指示されたら、DAPIスキャンを選択して低倍率のスライド画像を選択し、[OK]をクリックします。Plate Acquisition Snap(プレート取得スナップ)を求められたら、Plate Acquisition Snap-DAPIをハイライト表示し、OKをクリックします。「領域の作成またはロード」ボックスが表示されたら、「矩形領域」ツールを使用して DAPI スキャンの対象領域を選択し、「続行」をクリックします。

ロケーター ツールを使用して、対象地域をハイライト表示し、[Select Region] ダイアログ ボックスの下にある [Continue] をクリックします。「領域の確認」ボックスが表示されたら、「続行」をクリックし、「領域の保存」ダイアログ・ボックスが表示されたら、領域を保存する必要があるかどうかを決定します。3つのダイアログボックスが表示されます。

[続行] をクリックして [セットアップ完了] ボックスを閉じます。サンプルサイト検索の当て推量を排除するには、「Display Settings」タブの「Display images during acquisition」にチェックが入っていることを確認し、「Summary」タブを開いて「Acquire Plate」をクリックし、事前に選択した関心領域のステージを配置します。対象のセルを含むサイトをカメラでパンしたら、[キャンセル] をクリックして画像取得を停止します。

画像のピントが合っていない場合でも心配しないでください。この手順は、選択した関心領域に最初のサイトのステージを配置するためだけのものです。ステージがサンプルの上にあり、サイト数が正しく入力されていることを確認します。

波長設定を最適化して、高ダイナミックレンジの画像が得られるようにします。次に、「サマリー」タブを再度開き、「プレートを獲得」をクリックします。解析の最後に、[表示]タブを選択します。

「Image Overlay」プルダウン・メニューで、「Show well information」を選択して、左上隅にサイト番号を表示します。サイトをスクロールして、焦点が合っていないサイトや、組織のひだや組織内の気泡や裂け目が含まれているサイトを除外します。この代表的な画像では、定義された関心領域内のすべてのサイトの高倍率サムネイルが表示されています。

各サイトを確認して、分析から除外する必要があるサイトを特定する必要があります。たとえば、この実験では、サイト 149 は焦点が合わず、サイト 219 には気泡があり、サイト 54 には折り目が含まれていました。これら3つのサイトはすべて分析から除外されました。

ここでは、多波長細胞スコアリングモジュールによって生成された対応するオーバーレイは、実験仕様に従ってカスタマイズされたサイト59で実施された自動セグメンテーションの結果を実証する。セグメンテーション後、各マーカー、両マーカー、マーカーなし、平均染色面積、および平均蛍光強度について、陽性染色した細胞の割合の定量データを得ることができる。このビデオを見れば、スライドマウントされた組織サンプルのイメージングとセグメンテーションのための自動ワークフローを作成するための広視野ハイコンテント解析システムのセットアップ方法について十分に理解できるはずです。