検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

この新しい RNA in-situ ハイブリダイゼーションアッセイの全体的な目標は、中枢神経系疾患におけるドーパミン作動性機能障害の解明に重要な特定の脳領域の単一 RNA 分子を可視化することです。この方法は、ドーパミン作動性異常、行動反応の媒介、作業記憶機能の調節など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、中枢神経系疾患の進行中のドーパミン系機能障害を調査するための新しいin-situハイブリダイゼーション技術を提供することです。

この方法は、特定の脳領域における標的mRNAの全体的な発現レベルに関する洞察を得ることができますが、mRNA転写産物が特定の領域の細胞全体にどのように分布しているかを決定するためにも適用できます。この手順を開始するには、成体ラットの脳を採取してから5分以内に、液体窒素に15秒間浸します。次に、クライオスタットでマイナス20°Cの脳を1時間平衡化します。

1時間後、側坐核を含む30ミクロンの切片をブレグマの前方2.76ミリメートルから2.28ミリメートルに切断し、スライドにマウントします。次に、切片をマイナス20°Cで10分間乾燥させます。その後、スライドを予め冷やした4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で1時間浸します。

次に、スライドを室温で増加するエタノール勾配に置き、スライドを新鮮な100%エタノールにさらに5分間移します。その後、スライドを吸収紙の上に置いて風乾させます。バリアペンで各セクションの周りにバリアを描きます。

バリアを1分間完全に乾かします。脳切片を前処理するには、オーブンの電源を入れ、温度を摂氏40度に設定します。各脳部分に3滴の前処理試薬を追加します。

次に、切片を室温で30分間インキュベートします。次に、スライドを室温で1X PBSに1分間浸し、スライドを新鮮な1X PBSにさらに1分間移します。スライドは1X PBSに15分以上留まってはいけません。

マルチプレックスアッセイを実行するには、ターゲットプローブをウォーターバスで摂氏40度で10分間温めた後、室温まで冷却します。RNA試薬を室温で置きます。吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。

次に、各サンプルスライスにプローブとしてDrd1alphaを3滴加え、サンプルを摂氏40度で2時間インキュベートします。その後、スライドを1X洗浄バッファーで2分間、室温で2回洗浄します。次に、吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。

インキュベーションステップの合間に脳の切片を乾燥させないでください。各サンプルスライスにAMP 1FLを3滴加え、サンプルを摂氏40度で30分間インキュベートします。その後、スライドを1X洗浄バッファーで2回、室温で毎回2分間洗浄します。

次に、吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。その後、各サンプルスライスにAMP 2FLを3滴加えます。サンプルを摂氏40度で15分間インキュベートします。

次に、スライドを1X洗浄バッファーに2分間、室温で2回浸します。吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。各サンプルスライスにAMP 3FLを3滴加え、サンプルを摂氏40度で30分間インキュベートします。

次に、スライドを1X洗浄バッファーで2分間、室温で2回洗浄します。吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。次に、各サンプルスライスにAMP 4FL ALT Aを3滴加え、サンプルを摂氏40度で15分間インキュベートします。

スライドを1Xウォッシュバッファーで2分間、室温で2回洗浄します。スライドから余分な液体を取り除き、すぐに各セクションに2滴の封入試薬を置きます。次に、22 mm x 22 mm のカバースリップを各脳部分の上に置きます。

次に、スライドを暗所で摂氏2〜8度で乾くまで保管します。イメージングには、共焦点顕微鏡の電源を入れ、60倍対物レンズに切り替えます。Zスタック画像を取得し、側坐核領域のDrd1alpha標識細胞の画像を取得します。

離散的なドット染色パターンを示した側坐核からの画像について、発現のダイナミックレンジを半定量分析を使用して評価しました。各セルは、セルあたりのドット数に基づいて 0 から 9 まで採点されました。したがって、このハイブリダイズシグナルスコア法は、個々の細胞間でのDrd1alpha発現の程度および変動性を評価することができる。

これは、離散的なドット染色パターンを持つ雄および雌ラットにおけるDrd1α発現の代表的な共焦点画像です。ネストされたデータ構造を説明するために、各カテゴリの平均カウント値が計算され、統計分析に使用されました。Mann-Whitney U検定は、雄と雌のラットにおける細胞数の中央値の違いを評価するために実施されました。

各カテゴリのセルの度数は、相対度数と累積度数を使用して分析されます。雌動物は、雄動物と比較して下位のカテゴリーの細胞の頻度が高いほど、分布に有意な変化を示しました。全体として、結果は側坐核におけるDrd1α発現の明確な性差を示唆しています。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば7時間で完了します。この手順を試みる際には、温度変化や組織の乾燥がmRNAを損傷し、信頼性の高いシグナルを得る能力を妨げる可能性があるため、迅速に作業することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、皮質組織でin-situハイブリダイゼーション技術を実行する方法、選択した脳領域内のmRNA転写産物を蛍光画像化する方法、統計解析のためのmRNA転写産物の分布を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。