膠芽腫の治療の幹細胞シード足場の頭蓋内注入画像誘導切除

腫瘍を求めて治療間葉系幹細胞 (MSCs) 侵襲神経膠芽腫のための処置として約束を示します。最適な移植には、足場に腫瘍切除キャビティへの MSCs の配信が含まれます。ここでは、神経膠芽腫の MSC 治療を研究する臨床技術を含んで提供される: 画像ガイド下腫瘍切除;MSC シード足場; の注入術後療法を追跡します。

この手順の全体的な目標は、マウスの脳腫瘍を外科的に切除し、腫瘍ホーミング治療幹細胞を播種した足場を術後切除腔に移植することです。この方法は、外科的切除が手術腔への細胞移植にどのように影響するか、新しい治療薬が術後脳腫瘍にどの程度効果的であるか、スキャフォールドベースの送達システムが治療結果にどのように影響するかなど、細胞治療および神経腫瘍学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、脳腫瘍の介入を、ヒト患者の臨床標準治療に厳密に模倣する方法でマウスで研究できることです。

この方法は、足場上で行われる幹細胞治療に関する洞察を得ることができますが、ナノ粒子、低分子、腫瘍溶解性ウイルス、その他の新しい治療法など、他の介入にも適用できます。マウスに移植する48時間前に、まずPLAの足場を約2×2mmの切除空洞サイズの断片に切断して、足場を作製します。足場を70%エタノールに15分間浸して滅菌します。

15分後、足場をPBSに浸します。次に、10%のウシ胎児血清と1%のペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地に足場を置き、播種用の細胞を準備します。細胞を調製するには、まず0.05%トリプシンを使用して培養MSCをリフトします。

摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞が浮き上がったことを確認します。次に、フラスコにDMEMを追加してトリプシンを不活性化します。

次に、フラスコの内容物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、各足場の5回10〜5番目のMSCにペレットを100回gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を吸引し、MSCを5番目の細胞の10倍あたり5マイクロリットルのDMEMに再懸濁します。次に、鉗子によるDMEM浸漬から足場を取り外し、6ウェルプレートの蓋に置きます。足場を持ち上げて蓋から外し、余分なDMEMの液滴を残します。

足場を再び蓋に戻し、新しい乾燥した場所に置きます。3〜5回繰り返します。次に、部分的に乾燥した足場を新しい6ウェルプレートに入れて播種します。

部分的に乾燥した足場は、最適な細胞播種結果を提供します。足場が濡れすぎていると、細胞が足場から滑り落ちて下のプレートに付着します。足場が乾燥しすぎると、液滴が足場全体に広がらず、初期細胞の分布が悪くなります。

ピペットを使用して、MSCのチューブを穏やかに混合し、一部の細胞が底に沈殿した可能性があるため、懸濁液を均質化します。2.5マイクロリットルの新たに混合したMSC懸濁液を足場に直接ゆっくりとピペットで移し、足場の上部に小さな液滴を作ります。各ウェルのエッジに300マイクロリットルのDMEMを添加して、細胞滴の急速な蒸発を防ぎます。

摂氏37度で30分間インキュベートし、細胞を足場に付着させます。インキュベーション後、鉗子を使用してウェルプレートの足場を静かに裏返します。新たに混合したMSC懸濁液の2.5マイクロリットルを播種して、足場ごとに播種した5番目の細胞に合計10倍を与えます。

細胞を足場に付着させるために30分間のインキュベーションを行った後、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを追加して、DMEMで足場を覆います。足場をそっと持ち上げて、メディアが足場の下を流れるようにします。この状態で摂氏37度で48時間インキュベートしてから、着床手術を行います。

まず、蛍光解剖実体顕微鏡のステージに定位固定装置フレームを配置します。次に、麻酔をかけたマウスを定位固定装置フレームに固定し、イソフルラン鼻コーンアダプターを介して連続的に吸入麻酔を供給します。温熱パッドで体温を維持します。

角膜の乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。.次に、頭皮の切開部位を一連の3つのアルコールワイプと3つのベタジンワイプで滅菌します。各手足でつま先ピンチ反射テストを実施し、陰性反応を確認して適切な麻酔を確実にします。

鉗子を使って頭皮をつまんでそっと持ち上げます。手術用ハサミで正中線の直線的な吻側-尾側切開を行った後、PBSで切開部位を洗浄し、綿の先端アプリケーターで円形のブラッシング動作で皮下脂肪を除去します。以前に確立された頭蓋窓が完全に見えるように皮膚を配置します。

18ゲージの針を使用して、頭蓋窓の境界のすぐ内側に硬膜を優しく穿刺します。切開部が窓の内部を完全にトレースするまで繰り返します。硬膜を細い鉗子で剥がして取り除き、下にある実質と腫瘍を露出させます。

次に、室内の照明を暗くし、実体顕微鏡の蛍光モードをオンにします。U87 mCherryおよびホタルルシフェラーゼ発現腫瘍を同定します。200マイクロリットルのピペットチップを真空ポンプのチューブの端にロードします。

次に、真空ポンプをオンにします。シグナルが残らなくなるまで蛍光組織を穏やかに吸引することにより、腫瘍を切除します。出血を抑えるには、冷たいPBSで灌漑し、綿の先端アプリケーターで一定の圧力をかけます。

生理食塩水、綿の先端アプリケーターによる定常圧、および/またはSURGICELなどの止血剤を組み合わせて使用し、足場を埋め込む前に出血を止めます。適切に制御しないと、潜在的に危険な血腫が形成される可能性があります。切除後、真空ポンプの電源を切り、ピペットチップを廃棄してください。

蛍光を消すと、部屋の照明が再び点灯します。移植の直前に、MSCシードPLA足場をPBSにゆっくりと浸して、不要な媒体と関連コンポーネントを取り除きます。足場を切除腔に移植します。

必要に応じて、1マイクロリットルのフィブリノーゲンを追加し、続いて1マイクロリットルのトロンビンを追加して、足場を所定の位置に固定します。硬膜を切除し、頭蓋窓の骨フラップをすでに廃棄した状態で、皮膚を閉じて外科用接着剤を塗布して傷を密封します。動物を吸入麻酔薬から取り出し、加熱された表面で回復させます。

これらの位相コントラスト、蛍光、および組み合わせた画像は、mCherryおよびホタルルシフェラーゼマーカーを発現するようにレンチウイルスコンストラクトで操作されたU87がん細胞を示しています。これらの位相コントラスト画像、蛍光画像、および組み合わせた画像は、診断用GFP-Renillaルシフェラーゼまたは治療用GFP-TRAILを発現するように操作された幹細胞の対応する画像を示しています。この明視野と蛍光の重ね合わせ画像は、腫瘍の位置を示しています。

ここでは、腫瘍病巣が残存する術後切除腔が見られます。この画像は、MSC-TRAILを播種したPLAの足場を埋め込んだものです。ここでは、足場を重ねた死後の脳組織が見られます。

この蛍光オーバーレイは、GFP-TRAIL細胞をハイライトします。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、各マウスで30分以内に実行できます。この手順を試みる際には、クリニックで見られるのと同様に、マウスごとに達成される切除の範囲に本質的なばらつきがあることを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、脳腫瘍の外科的切除を行う方法と、足場ベースの幹細胞療法を含む治療介入への影響を評価する方法について十分に理解しているはずです。