Name: アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶプロトタイプフォーミーウイルスインテイソームの組み立てと精製法。生化学的・構造的・動態学的研究に活用でき、レトロウイルス学における統合メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。

1. 熱処理 vDNA の
<ol><li>結合 1 X 10 のバッファー (10 X 10 株式: 100 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 M NaCl 10 mM EDTA)、10 μ M 10 μ M とオリゴ 1 (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG、100 μ M 在庫) オリゴ 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 μ M 在庫) 1.5 mL の最終巻で.60 0.2 mL ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブに分注 25 μ L。 注: アプリケーションによっては、オリゴマーは基本 13 1 オリゴの 5' 端から内部アミノ酸 T として fluorophores が付いてまたは 5' 端または Oligo 2 のタグに修正されるかもしれません。変更したオリゴマーは、アニールする前に、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で精製する必要があります。我々 は、10 倍のインタソーム アセンブリ効率が低下 5' 末端 Cy3 や Cy5 蛍光標識オリゴ 2 を発見しました。内部の蛍光ラベリング組立効率を削減していません。</li>
	<li>アニール時間と温度、たちを使用して: 1 サイクル 94.0 ° C、3 分で 99 サイクル (94.0 ° C 1 分、93.6 ° C 1 分) サイクルあたり 0.8 ° C によって両方の温度を減少させる (最後のサイクルは 14.8 ° C 1 分、14.4 ° C 1 分)、4.0 ° C で保存します。</li>
	<li>すべての 60 のチューブからアニーリング反応を組み合わせます。2 0.5 mL 3 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 超遠心フィルター濃度単位を 500 μ L をロードします。室温 (RT) で 10 分間 14,000 × g で遠心機で遠心分離による焼鈍 vDNA を集中します。 注: 未透過ボリュームは各濃度単位 〜 50 μ L をする必要があります。</li>
	<li>流れを破棄します。各フィルター ユニットに残りの焼なまし材 vDNA の 250 μ L を追加します。スピンを繰り返し、流れを破棄します。450 μ L TE の 3 回を洗浄することによりバッファーの TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) に交換。</li>
	<li>フィルター ユニットと右で 2 分間 1,000 x g でスピンを反転します。各フィルター ユニットの最終未透過ボリュームは、〜 50 μ L. retentates と 1.5 mL スクリュー キャップ チューブへの転送を組み合わせるべき。</li>
	<li>VDNA の 260 nm の紫外線 (UV) の吸光度を測定します。この値を使用して、最終的なモル DNA 濃度を計算します。この vDNA の吸光係数 (ε260) が 622,803 cm-1 M-1で、その分子量は-20 ° C で 23,972 の da ストア。</li>
</ol>2. インタソーム組み立て
<ol><li>可能であれば、小さな部屋に可変サーモスタットとインタソーム組み立てを実行します。約 18-22 ° C にサーモスタットを調整します。 注: 我々 の経験で 4 ° C でのインタソーム組み立ては非効率的です。</li>
	<li>撹拌プレート上の攪拌棒を 2 L のビーカーに透析バッファー (20 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、200 mM の NaCl、2 mM ジチオトレイトール (DTT)、25 μ M ZnCl2) の 1 の L を準備します。少なくとも 6 時間 18-22 ° C の部屋でバッファーを平衡します。</li>
	<li>Intasomes を組み立て、50 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、500 mM の NaCl、120 μ M PFV で、150 μ L の総ボリュームで 50 μ M の vDNA を組み合わせます。 注: PFV のヌクレアーゼ活性7、8を汚染の無料する必要があります。PFV の濃度が 200 μ L に最終巻を増やすことは可能だしは、150 μ L のボリュームで 120 μ M に合わせて希釈も。この手順の重要な要因は、vDNA (2.4: 1,) へのモル比を維持するためにクロマトグラフィーの中に可視化する十分なコンプレックスを持っています。</li>
	<li>10 mm 6-8 kDa MWCO 透析チューブの二重蒸留水 (ddH2O)、または最高の純度水を持つクリップ 〜 10 センチの部分をきれいに。チューブの一方の端をクリップします。 注: 透析チューブは、ラボのスペースから可能な汚染を防ぐために慎重に取り扱う必要があります。</li>
	<li>15 mL の透析チューブ洗浄バッファー (50 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、500 mM の NaCl) を確認します。1-2 の mL 洗浄バッファーで 3 回透析チューブの中をすすいでください。ピペット チップ薄膜ゲルと可能な限り洗浄バッファーの多くを削除します。</li>
	<li>必要に応じて、薄いゲル読み込みヒントは管の端に達する可能性がありますので、透析チューブをカットするのにきれいなかみそり刃やメスを使用します。</li>
	<li>ピペット チップを読み込む薄いゲルと透析チューブ ステップ 2.3 からインタソーム組み立てを転送します。チューブ内に導入された空気の量を最小限に抑え、透析チューブの開放端をクリップします。透析バッファーにチューブを置きます。</li>
	<li>Dialyze チューブの回転が渦ではない穏やかな攪拌と一晩 (16-20 h)。透析の管が水中に、モバイルであることを確認します。約 1 時間後、チューブ内表示されている沈殿物を観察します。 注: Cy3 や Cy5 蛍光ラベル vDNA で沈殿物はより明白です。これは分類される端と内部でラベル付けされた蛍光 vDNA の両方に当てはまります。</li>
</ol>3. インタソーム可溶化
<ol><li>準備 2 つの広いきれいな表面に新しい剃刀やメス刃を 200 μ L チップの端から 2-4 ミリメートルを削除することによってピペット チップを産んだ。 注: ヒントは、3.3、3.5 の手順で使用されます。</li>
	<li>透析チューブを透析バッファーから削除します。クリップ近くチューブの端に残っている透析バッファーとインタソーム サンプルの希釈を防ぐために、余分な透析のバッファーを削除するのに小さなピペット チップとマイクロ ピペットを使用します。透析チューブの一方の端からクリップを削除します。</li>
	<li>使用広いステップ 3.1 氷の上 1.5 mL チューブに透析チューブの中の沈殿物を含むサンプルを転送するからピペット チップを産んだ。回収素材の容量に注意してください。総容積は通常 ~ 140 μ L です。</li>
	<li>沈殿物のサンプルは、200 mM の NaCl;在庫 5 M NaCl 溶液の適切なボリュームを追加して 320 mM の NaCl の最終的な集中に塩を増やします。たとえば、150 μ L のサンプル、追加 3.9 μ L 5 M NaCl と 1.1 μ L ddH2O 155 μ。 転送氷バケツの最終巻の 4 ° c の冷たい部屋にサンプル。</li>
	<li>使用広いステップ再懸濁します、ピペッティングにより沈殿物を可溶化し 3.1 からピペット チップを産んだ。少なくとも 1 h. の沈殿物のほとんどは、解決策に行く必要があります観察に 20 分ごとを繰り返します。 注: 沈殿物を再懸濁しますにピペッティング停止できる沈殿物が時間ポイント間もはや著しく低下が明らかであるとき。VDNA ラベルはありませんかと内部のラベルは、沈殿物は目視検査に基づく ~ 90% 削減します。沈殿物はのみ 〜 20% 減の vDNA と分類される Cy5 端の場合vDNA と分類される蛍光体の端を沈殿物のほとんどが可溶化しません。効果的に可溶化沈殿物の量は可変して経験的に決定する必要があります。</li>
</ol>4. インタソーム浄化
<ol><li>250 mL サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の連続したバッファー (20 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、320 mM の NaCl、10% グリセロール) を準備します。滅菌フィルター バッファー 0.2 μ m フィルター ユニット、4 ° C で保存します。 注: すべての精製工程は 4 ° C の冷たい部屋で実行されます。</li>
	<li>架橋アガロース SEC カラムの平衡 (直径 = 10 mm 長さ = 300 mm; ボリュームをベッド = 24 mL; サンプル ボリューム = 25 500 μ L; 最大圧力 = 1.5 MPa; 排除限界分子量 = 4 × 107 Da; 分離分子量 5 および 5,000 kDa 間マットの表を参照してください。資料) 秒 0.4 mL/min の流量で連続したバッファーを持つ。 注: この浄化は Superose 12 10/300 GL など Superose 6 増加、44 kDa から 300 kDa を効果的に分離することができる場合、異なるサイズ排除カラムに適応があります。Superose 12 10/300 GL が低い解像度ピークのより多くの重複に 。逆に、Superose 6 増加より高い解像度を持つし、良い分離を提供します。</li>
	<li>任意の残りの沈殿物をペレットへの 4 ° C で 10 分間の 14,000 x g でおよび microfuge のインタソーム サンプルを遠心します。上清を慎重に取り外します。上清 200 μ L 注入ループ (〜 200 μ L を保持できるチューブ) をロードします。秒の列にサンプルを適用します。 注: より小さい負荷ボリュームで SEC のより高い解像度は、します。</li>
	<li>秒を実行するバッファーし、270 μ L の 95 分画を収集 25 mL で溶出 SEC クロマト グラムで 3 A280/A260ピーク (図 1) が表示されることを確認します。 注: 最初の集計 (~9.0 - 11.5 mL 溶出)、続いて PFV テトラマー インタソーム ピーク (~12.0 - 14.75 mL 溶出) と無料 vDNA ピーク (~15.0 - 18.0 mL) PFV のモノマーをする必要があります。</li>
</ol>5. 統合鎖伝達アッセイ、分数の選択、およびストレージ
<ol><li>各インタソーム ピーク画分および 50 の 2 μ L を組み合わせて ng 3 kb スーパー プラスミド DNA (ストック濃度は 50 ng/μ L) 最終的な反応量 15 μ L の反応バッファー (10 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、110 mM の NaCl、5 mM MgSO4, 4 μ M ZnCl2, 10 mM DTT) に。5 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>ない追加 PFV インタソームをネガティブ コントロールが含まれます。0.75 μ L プロティナーゼ K との反応 (20 mg/mL 原液) および 0.75 μ L SDS を停止 (10% 原液)。1 h. ストア サンプル後の分析のための-20 ° C で必要に応じての 55 ° C で孵化させなさい。 注: このアッセイは、統合アクティビティの定性的な評価です。この試金の前に、各画分のインタソーム モル濃度は決定されていません。統合鎖伝達アッセイに含まれる分数を格納できる統合まで (夜の記憶を含む) 氷の上活動を確認し、選択した分数は避けよう。ここで我々 は pMP2、pUC19 デリバティブ9を使用します。我々 はまた正常に 5.4 kb のプラスミド pcDNA 3.1 を使用しています。解決できるプラスミド リラックス円、直線とスーパー フォームは、統合のためターゲットとして使用する可能性があります。</li>
	<li>0.1 G/ml エチジウム ブロマイド (EtBr、10 mg/mL 原液)10で 1 × TAE バッファー (40 mM トリス酢酸、1 mM EDTA) の量 (w/v) agarose のゲルあたり 120 mL の 1% の重量を準備します。アガロース溶液を溶かすし、15 cm × 10 cm ゲル鋳造トレイにそれを注ぐ。5 mm 幅、0.75 mm 厚の井戸と 15 も櫛を挿入します。 注: 狭い井戸は 1.5 mm 厚の井戸と比較してより良いバンド解像度を得られます。</li>
	<li>常温で固化するゲルを許可します。0.1 μ g/ml の EtBr 1 × TAE でゲルを浸します。</li>
	<li>5.2 から各統合の反作用に 3 μ L の 50% のグリセロールを追加します。ゲルに全体の反作用ボリュームをロードします。1 μ L のサンプル; のいずれかの側の車線に 10 kb DNA サイズ マーカー (150 ng/μ L ストック濃度) を読み込むつまり、DNA サイズ マーカーはサンプル レーンを逃げする必要があります。</li>
	<li>外側の車線、6 μ L オレンジ G 染料 (0.25% オレンジ G、30% のグリセロール) をロードします。定電圧、周囲温度 1 h またはオレンジ G 染料前ゲルの端に到達するまでに 10 V/cm (100 V) でゲルを実行します。</li>
	<li>すぐに EtBr (532 nm 励起、610 nm 発光フィルター) を検出する蛍光スキャナーの agarose のゲルをイメージします。適切な fluorophore 設定もイメージの蛍光ラベル vDNAs を使用した場合 注: たとえば、cy5 の組合せを検出する分類される DNA、633 nm の励起と 670 nm 発光フィルターを使用してイメージ。~ 3 kb で協調統合製品 (CI、線形 DNA) サイズに該当する実行、未反応スーパー プラスミド (SC) を高速化 (~ 2 kb) を実行し、半サイト統合製品 (HSI、リラックスした環状 DNA) 遅い (~3.5 kb) を実行する必要があります。〜 40 で未反応の vDNA サイズに該当する実行 bp。</li>
	<li>イメージング ソフトウェア7各レーンのバンドを定量化します。DNA は、CI、HSI、または SC; 各レーンの割合を計算します。vDNA は、この計算には含まれません。 注: 統合の効率、またはリニア製品に変換 SC の分数を協調統合製品 (CI) のピクセル ボリューム 3 つのバンド (HSI + CI + SC) の総画素量で割ることによって求めた。Intasomes は蛍光ラベルである場合、HSI と CI の製品は蛍光を用いた測定も可能性があります。</li>
	<li>最も協調された統合アクティビティを持っている分数を選択します。 注: 我々 の経験で、統合協調ピークは 4 量体 PFV intasomes として識別された蛋白質のピークと一致します。これらの画分のそれぞれの A280を測定し、最終のインタソーム濃度を計算します。ここで説明した 2 つの vDNAs を持つ野生型 PFV での四量体の ε280が 908,339 cm-1M-1で、分子量は 225.5 kDa。濃度は、SEC クロマト グラム ピークとストランド転送アッセイの同じパターンに従う必要があります。</li>
	<li>5 μ 因数で各分画を配布し、スナップ液体窒素で凍結します。因数-80 ° C で保存します。ストレージの端数は通常 200-600 nM の間です。</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
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<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
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<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

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レトロ ウイルスをポリコームタンパク統合を実行し、ウイルスのライフ サイクルを続行するウイルスのゲノム DNA との複合体を形成します。テトラマー、octamers、または可能性が高いため多量11,12,13,14インタソームあたり単量体の数があります。PFV intasomes は、組換えウイルスのゲノム DNA を模した二本鎖 DNA オリゴマーとの四量体の両端3.されてこれらの intasomes は、構造と動的研究3,5,13,14で使用されています。</p...

宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合は、すべてのレトロ ウイルス1のライフ サイクルの必須のステップです。ウイルス酵素インテグラーゼ (IN は) ホスト DNA にウイルスのゲノム DNA の両端の共有結合に参加する触媒作用を及ぼします。細胞感染の間の統合を仲介事前統合複合体の一部です。組み換え体の二重鎖 DNA オリゴマー ウイルス DNA の両端を模倣した複合体2の in vitroターゲット DNA の統合を実行できます。一般的な統合アッセイの in vitro DNA ターゲットとしてスーパー プラスミドを利用します。プラスミッドを両方ウイルス DNA オリゴマー (vDNA) の統合は、リニア製品の結果し、協調統合 (図 2 a) と呼ばれています。統合分析、体外したリラックスしたサークルの結果ターゲット プラスミドに参加して 1 つだけ vDNA と製品をもたらすことがあります。この半サイト統合製品は、 in vitroアッセイのアーチファクトのように見えます。
組換えと vDNA を生体外の統合、実行可能性がありますが、単量体では関連する可視化に覆い隠さときはダイナミクスの研究や統合複合体の構造のための理想的な試薬。精製された統合の複合体、または「intasomes」が動的 1 分子解析または構造研究のため必要です。PFV のと vDNAs が組み立てられる透析によって比較的高い塩濃度バッファーから低い塩分濃度3,4。透析、沈殿物中のフォーム。この沈殿物が透析から削除され、塩濃度が増加します。高い塩濃度は可溶性沈殿物含む PFV intasomes です。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) では、intasomes は、精製します。組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) では最大 225 μ M5濃度でソリューションの単量体として存在する示されています。秒分別は効果的に (44.4 kDa) の単量体 PFV と無料 vDNA (24.0 kDa) から PFV のと 2 つの vDNAs の四量体が含まれています、PFV intasomes (225.5 kDa) を分離します。PFV intasomes は凍結する可能性があり、-80 ° C でのストレージの少なくとも 6 ヶ月間統合アクティビティを保持します。
組換え PFV intasomes は、アミノ酸置換、トランケーション変異またはフルオロまたはビオチン4,6の付いた vDNAs を含むように修正されるかもしれません。精製 PFV intasomes は容易に体外DNA プラスミドのスーパー ターゲットへの統合を実行します。Intasomes で一括生化学的統合アッセイは、阻害剤、または他の化学添加物の突然変異での効果をテストします。ビオチン化 intasomes は、核酸やタンパク質との親和性を調査する使用できます。PFV intasomes は、vDNA の両端またはターゲット上のインタソーム検索を視覚化する全反射蛍光の接合間の時間を測定する磁気ピンセットによる単一分子顕微鏡分析を可能周囲温度機能DNA6。また、PFV intasomes が最初に構造的に特徴付けられる大幅レトロ ウイルス統合3のフィールドに影響を与えます。

<table><tbody><tr><td>DNAオリゴマー</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>カスタム DNA オリゴ</td></tr><tr><td>トリス ウルトラピュア</td><td>ゴジラ ファインケミカルズ</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS プロパン、>=99.0% (滴定)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングのヒント、1 - 200 &mu;L</td><td>コーニング</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード;片刃;100/パック;100 フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ディスポーザブルフィルターユニット PES メンブレン付き > 250mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブクリップ</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm 透析チューブ</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>ハイレゾ標準 アガロース</td><td>AGTC バイオプロダクツ</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>オレンジ G</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>ハイラダー 10kb、500レーン</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes の精製

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A 宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合機能とレトロ ウイルスのライフ サイクルの必要なステップを定義することです。すべてのレトロ ウイルスは、ホスト DNA ストランド転送として知られているウイルスの共有結合を触媒するインテグラーゼ (IN) 酵素をエンコードします。統合では、組換えレトロ ウイルスの inの in vitroモデル化されるとウイルスのゲノムの端を模倣した DNA オリゴマーを可能性があります。密接に発生する生体内で、統合統合反応を要約するためには、削減塩濃度バッファーで透析による組換えと合成オリゴマーから錯体をまとめます。インタソームと呼ばれる、複雑な統合は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製があります。プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) 場合、インタソームは 4 量体で、2 つの DNA オリゴマーと容易に単量体と無料オリゴマー DNA から分離されています。PFV intasomes の統合効率は、さまざまなダイナミクスを理解する実験条件やレトロ ウイルスの統合の仕組みの下で試金することがあります。

PFV intasomes は組換えのおよび vDNA から組み立てられて。組立後 intasomes は秒 (図 1) で精製しました。各分画の統合アクティビティを測定する、スーパー DNA ターゲットとアガロースゲル電気泳動 (図 2) とします。このゲルは EtBr (および蛍光、蛍光ラベル vDNA が使用されている場合) を検出する蛍光スキャナーでイメージしています。画像解析ソフトを使用して、統合効率 (図 3) を計算するバンド ピクセル ボリュームを使用できます。分数の最高の統合効率は、冷凍保存用スナップです。冷凍の分数は、組み立てられた intasomes の長期的な保存を可能にする統合アクティビティ (図 4) を保持します。任意のラベルの分子と、vDNA 内の位置のインタソーム組立効率 (<strong class=...

組換えレトロ ウイルス ・ ウイルス DNA の両端を模倣した DNA オリゴマー、インタソームと呼ばれる酵素によって実行中の複合体を形成できます。Intasomes は、生化学、構造、および速度論的研究に使えます。このプロトコルは、組み立てるし、プロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes を浄化する方法をについて説明します。

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

この手順の全体的な目標は、プロトタイプの泡状ウイルスインタソームを組み立てて精製し、生化学的、構造的、および速度論的研究に使用できるようにすることです。この方法は、統合の力学やダイナミクスなど、レトロウイルス学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、種の不均一な混合物ではなく、統合複合体の分離を可能にすることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、最適なインタソーム収率を確保するためには、統合複合体の回収と可溶化が重要であるため、有益です。まず、1XTENバッファー、10マイクロモルオリゴ-1、および10マイクロモルオリゴ-2を最終容量1.5ミリリットルに組み合わせます。次いで、混合物の25マイクロリットルを60 0.2ミリリットルのポリメラーゼ変化反応チューブに分注する。サーモサイクラーを使用して、テキストプロトコルに記載されている時間と温度でDNAをアニールします。反応後、60本のチューブすべてからのアニーリング反応を組み合わせます。次に、2つの0.5ミリリットル3キロダルトン分子量カットオフ超遠心フィルター濃縮ユニットの500マイクロリットルをロードします。アニーリングしたウイルスDNAを、室温で10分間、gの14,000倍で微量遠心分離機で濃縮します。フロースルーを廃棄した後、残りのアニールされたウイルスDNAを250マイクロリットルを各フィルターユニットに加えます。約50マイクロリットルが残るまでスピンを繰り返し、流れを捨てます。次に、バガーは450マイクロリットルのTEで3回洗浄することにより、サンプルをTEバッファーに交換します。バッファー交換後、フィルターユニットを反転させ、室温で2分間1000gで回転させます。各ろ過ユニットの最終的な保持容量は約50マイクロリットルである必要があります。保持物を結合し、1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに移します。最後に、ウイルスDNAの260ナノメートルの紫外線吸収率を測定して、DNA濃度を計算します。インタソームを組み立てるには、50ミリモルビストリスプロパンpH 7.5、500ミリモル塩化ナトリウム、120マイクロモルPFVインテグラーゼ、および50マイクロモルウイルスDNAを総容量150マイクロリットルに組み合わせます。直径10mm、分子量6〜8キロトンの10cmの長さの部分、分子量カットオフ透析チューブ、および関連するクリップを、二重蒸留水または利用可能な最高純度の水で清掃します。チューブの一方の端をクリップで留め、透析チューブの内側を1〜2ミリメートルのリンスバッファーで3回すすぎます。ピペットと細いゲルローディングチップで、リンスバッファーをできるだけ取り除きます。次に、ピペットと細いゲルローディングチップを使用して、インタソームアセンブリを透析チューブに移します。アセンブリが透析チューブの底に直接排出されていることを確認してください。透析チューブの開放端をクリップで留めて、チューブ内に導入される空気の量を最小限に抑えます。次に、チューブを透析バッファーに入れます。チューブが回転するが渦に巻き込まれないように、穏やかに攪拌しながら一晩透析します。透析チューブが水没して可動式であることを確認してください。約1時間後、沈殿物はチューブ内に見えるはずです。200マイクロリットルの先端から2〜4ミリリットルを取り外して、きれいな表面に新しいカミソリまたはメスの刃を付けて、2つの広口径ピペットチップを準備します。透析チューブを透析バッファーから取り外します。クリップ近くのチューブの端に残る可能性のある透析バッファーでインタソームサンプルが希釈されるのを防ぐために、小さなピペットチップ付きのマイクロピペットを使用して、余分な透析バッファーを取り除きます。透析チューブのこの端からクリップを取り外します。アセンブリを回収する際には、できるだけ多くの溶液を回収し、沈殿させることが重要です。ワイドボアプロペットチップを使用して、透析チューブ内の沈殿物を含むサンプルを氷上の1.5ミリリットルチューブに移します。回収された材料の総量に注意してください。総容量は通常約140マイクロリットルです。沈殿物を含むサンプルは200ミリモルの塩化ナトリウムです。ストック5モルの塩化ナトリウム溶液の適切な量を添加することにより、塩を最終濃度の320ミリモル塩化ナトリウムまで増やします。サンプルを入れたアイスバケツを摂氏4度の冷蔵室に移します。ワイドボアピペットチップを使用して、ピペッティングにより沈殿物を再懸濁し、可溶化します。20分ごとに少なくとも1時間繰り返します。沈殿物の大部分は溶液に入るべきです。インタソームを精製するには、架橋されたアガロースサイズ排除クロマトグラフィーまたは SEC カラムを SEC ランニングバッファーと 0.4 ミリリットル/分の流速で平衡化します。マイクロフュージでインタソームサンプルを14, 000倍g、摂氏4度で10分間遠心分離し、残りの沈殿物をペレット化します。上清を慎重に取り除いた後、200マイクロリットルの注入ループにロードします。サンプルを SEC 列に適用します。25ミリリットルのSECランニングバッファーで溶出し、270マイクロリットルの95画分を収集します。SEC クロマトグラムに 3 つの A280 および A260 ピークが表示されていることを確認します。各インタソームピーク画分の2マイクロリットルを、50ナノグラムの3キロベーススーパーコイル血漿DNAに組み合わせ、最終反応容量15マイクロリットルにします。また、PFVインタソームを添加していないネガティブコントロールも含まれます。摂氏37度で5分間インキュベートします。0.75マイクロリットルのプロテイナーゼKと0.75マイクロリットルのSDSで反応を停止します。.次に、サンプルを摂氏55度で1時間インキュベートします。次に、各統合反応に3マイクロリットルの50%グリセロールを加えます。全反応容量を1容量あたり1%の重量にロードします アガロースゲル。また、10キロバイトのDNAサイズマーカーを1マイクロリットルをサンプルの両側のレーンにロードします。外側のレーンに、6マイクロリットルのオレンジ色のG染料をロードします。ゲルを一定電圧、10ボルト/センチメートル、周囲温度で1時間、またはオレンジ色のG染料の前面がゲルの端に達するまで泳がせます。すぐに、エチジウムブロマイドを検出するように設定された蛍光スキャナーでアガロースゲルをイメージングします。この画像は、3キロベースでサイズに忠実に動作するバンドとしての協調統合を示す必要があります。イメージングソフトウェアで各レーンのバンドを定量化した後、最も協調的な積分活動を持つフラクションを選択します。各フラクションを5マイクロリットルのアリコートに分配します。最後に、アリコートを液体窒素でスナップフリーズしてから、摂氏マイナス80度で保存します。PFVインタソームアセンブリ精製の代表的なクロマトグラムを示します。3つのピークが見えます。中央のピークは、正しく組み立てられたインタソームと相関しています。中心のクロマトグラフィーピークからの割合で示した積分効率を示します。インタソームは、凍結融解の有無にかかわらず活性について試験されました。凍結融解は、インテグレーション反応生成物のエチジウムブロマイド染色アグラオースゲルに差を示さなかった。ここでは、スーパーコイルプラスビッド、協調統合製品、ハーフサイト統合製品、および未反応ウイルスDNAが示されています。エチジウムブロマイド画像からの積分効率の定量化も、凍結融解後の積分活性の損失がないことを確認しています。これにより、長期保存が可能になります。標識分子と位置は、PFVインタソーム集合の効率に影響を与えます。非標識インタソームと内部Cy5標識は、同等の組み立て効率を示します。しかし、末端標識のCy5またはビオチンは、組み立て効率を低下させます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。この手順に続いて、生化学的アッセイや単一分子アッセイなどの他の方法を実行して、統合、速度論、およびダイナミクスに関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、PFVインタソームの組み立て、精製、機能評価の方法について十分に理解できるはずです。

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Immunology and Infection

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学ぶプロトタイプフォーミーウイルスインテイソームの組み立てと精製法。生化学的・構造的・動態学的研究に活用でき、レトロウイルス学における統合メカニズムの理解に貢献します。

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