Name: ・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 学ぶYAPを用いた体細胞の幹細胞再プログラミング法。分化細胞を組織特異的な前駆細胞へ変換し、再生医療や細胞可塑性の研究に応用可能です。マウス乳腺組織を用いた詳細なプロトコルを解説します。

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重音テト-ヤップS127Aマウス; の贈り物ありがとう f ・ カマルゴR26 rtTAM2マウス (株式 #006965)、ジャクソン研究所から購入しました。FACS 手順のヘルプについては、キアラ Frasson とジュゼッペ ・通奏低音をありがとうございます。この作品は AIRC 特別プログラム分子臨床腫瘍 ' 5 パーミル」によってサポートされ、AIRC PI-、S.P とエピジェネティクスの旗艦プロジェクト CNR Miur によって許諾する s. p.このプロジェクトは、欧州連合のホライゾン 2020年研究および革新プログラム (許諾契約 DENOVOSTEM 号 670126) の下で欧州研究会議 (ERC) からの資金を受けています。

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
<li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

ここで1を既に報告されているヤップの一過性の発現によって対応する前駆細胞の細胞 (または ySCs) にさまざまな組織の前のヴィヴォ最終分化した上皮細胞をプログラムし直すためのプロトコルは提示します。我々 は 2 つの手順の詳細な: 1 つレンチウイルスベクターとウイルス感染を回避し、トランスジェニック ヤップ式の活用第 2 1 つを FACS 精製細胞のプログラムし直すことができます。各プロトコルを分離するための効率的な戦略を提示し、プライマリ分化細胞の培養と外因性を強制する戦略ヤップ・ デ ・ ノボ体性組織固有拡張可能な幹細胞 (参照を生成する分化した細胞の遺伝子発現図 1 aと2 aのスキーム)。
我々 は決して否定的なコントロールのサンプル (図 1および2 C) から任意の副産物を検出という事実によって示されるように分化した細胞の純粋な人口を効果的に紹介する分離戦略に分離を行った。
本研究で一次乳腺 LD 細胞のリプログラミング用レンチウイルスベクターはドキシサイクリン誘導、遺伝子発現のタイトなコントロールの可能性を提供します。これにより、オンにして外因性ヤップ オフで表現されます。特に注意は、リプログラミング効率の面で支障が出るこのすることができます過剰なウイルス力価の使用を避けることで配置必要があります。プライマリ腺房細胞の場合我々 は最小限の操作でヤップ依存型のリプログラミングを取得する完全に遺伝子組換え手法に切り替えました。この後者の戦略は孤立した腺房クラスター、やっとのことでレンチ ウイルスの感染を受けやすい、非常に壊れやすい主膵腺に特に適しています。形質転換戦略では、ドキシサイクリン依存性遺伝子発現のタイトなコントロールのレンチウイルスベクターの同じ利点を提供しています。また、主な膵腺と悪用される形質転換戦略は LD の乳腺細胞のウイルス誘導リプログラミングと比較してはるかに高いリプログラミング効率の付加的な利点を負いません。異なったティッシュから得られるセルに関連付けられている異なる組み込み可塑性、を超えて膵リプログラミングが多い可能性がありますに由来するすべての制服と自律のヤップ式に関連付けられた式の高効率explanted セルです。特に、外因性ヤップがもはや必要である ySCs (yMaSC のコロニーおよび yDucts) の生成後自己再生能力に影響を与えずに実証しました。YSCs 内因性ヤップ/タズを再アクティブ化して外因性ヤップ1オフになっているときの自己更新のためそれらを使用するためです。
YSCs は確かに分化した細胞から現れる遺伝的系統トレース検証1リプログラミング実験の起源の細胞を制御することによって概念を検証しました。
広範な評価ySCs のリプログラミング ヤップによる通常体 SCs1として私を生成することを示しています) トランスクリプトーム レベルで ySCs 表示ネイティブ SCs; 大規模な重複ii) ySCs の分化の能力を表示し、いつもの原点の自分の組織の id に制限長子孫を生成できます。iii) ySCs は非変形し、非発癌性と生体内移植します。
ここを維持し、文化を展開する手順を述べる yMaSCs と yDucts organoids として 100% 基底膜マトリックス ヒドロゲルに埋め込まれています。これらの条件は、自己組織化の未分化性文化の長期的なメンテナンスを確保する三次元 organoids に ySCs、下流解析のアプリケーションで集団を幹これらを展開するを有効にします。未知の理由のため、我々 は yMaSC を取得に失敗しましたを置くことによってオルガノイド感染における培養条件で直接 LD 細胞プラスチック培養プレートのドキシサイクリン治療後 7 日つまり、乳腺のコロニーの条件の中間の成長ステップが不可欠です。私たちの手でさらにネイティブ MaSCs 培養継前に乳腺のコロニーの条件が必要です。さらに、単一のセルにプライマリのコロニーを分離を避けるため organoid 培養条件にそのままコロニーを転送ではなく我々 が最も効率的な organoid 副産物が得られます。
における培養条件はまた、organoids 窒素風呂で凍結する前に細胞解離を避けること彼らの行列から回復される ySCs、凍結保存する可能性を与えることの利点を耐えます。
発表手順を再プログラミング ヤップの対応する組織幹細胞 (テストしましたが乳腺、膵、神経細胞を用いた) に異なる成体組織から派生した分化細胞型に変換できます1。Ips または他のリプログラミングの努力からの違いでヤップ/誘導 SCs に起源のティッシュの思い出を維持できます。注記のうち、体細胞の幹のような特性に恵まれている細胞分化解消、細胞運命の可塑性の唯一の形態、組織の損傷後など、創傷治癒の5,17をサポートする生体内で観察されたリプログラミング,18,19,20. ヤップと TAZ が主通常恒常性に不可欠であることは注目に値するが、複数組織11,21の組織の修復のために重要です。一貫してここでプログラムし直す手順の生理的な機能を持つヤップ/タズ示されている最近に成人の腸内細胞の転換を引き起こすことによって潰瘍性大腸炎患者のマウス ・ モデルにおける腸管再生に必要とされます。19胎児の腸の機能が表示されます修復上皮。ヤップ リプログラミングところ体外をキャプチャするために挑戦している状態の体性幹細胞を生成する手段を提供することによって現在の誘導細胞可塑性戦略が広がります。このアプローチでは、ひと由来細胞にも拡張が体細胞の未分化状態の研究への再生医療応用から広範な関連性があるし、体細胞の拡張のための in vitro細胞幹します。

組織固有の体性幹細胞 (SCs) は、損傷後組織更新と修理のため重要です。簡単に分離し、限りなくの展開ex vivo体細胞 SCs 表す基礎研究と疾患モデルの SC 用だけでなく、潜在的な再生療法のための重要な問題する可能性。ただし、この方向の進歩は様々 な上皮臓器体外の SC 状態のキャプチャの難しさによって制限されており。確かに、いくつかの成体は、常駐 SCs が存在しない、または容易に利用できない可能性があります。 または、番号と再生の可能性は、老化や病気の条件によって侵食される可能性があります。単一の転写コアクチベーターの式を報告することによって、このギャップを埋める開始、2016 年にヤップ (はい関連タンパク質) やその密接に関連蛋白質 TAZ (PDZ モチーフと転写活性化)、終末分化した細胞に効率的な運用および分子に対応する組織特異 SCs1から見分けがつかない機能、拡張可能な非発癌性、自家細胞集団を作成します。パルス持続ヤップまたは数日間 TAZ 活動体 SCs の自己更新の外観を誘導するために十分です。これは、さらに異所性のヤップ/タズ1の表現なし携帯世代を通じて送信することができますもはや連続的な発現に依存する安定した状態です。プロトコルは乳腺とこれらの組織の分化した細胞から膵臓のde novo上皮幹細胞/前駆細胞を生成するために使用プロシージャの詳細をここで紹介します。この手順は、現在のリプログラミング/分化転換アリーナでブラック ボックスを塗りつぶします。これらの方向の主な取り組みは細胞へ誘導多能性幹細胞 (iPSC) 状態に、これらの胚の変換を中心としたところ確かとに多能性 SCs より分化した細胞。ただし、Ips、発癌性一度成体の完全かつ効率的な分化2プロトコルの開発の必要性を高める導入します。しかし、この分化ステップ可能な場合でもは長期的な拡張性、自己組織化と器官再作成電位の価格で来る。これらは、内因性の組織固有の SCs のみと現在記述されていたヤップ誘起 SCs (ySCs) の代表的な事実に、臓器再生のための必須の属性です。同様に、様々 な転写因子を生成もカクテルを使用して別に 1 つのセル型の直接分化転換は不可欠の潜在的な3増殖と幹細胞性を欠いているセルを区別されます。
ここで説明する手順はまた内因性 SCs が拡大することができ、分化前のヴィヴォ4最近導入された organoid 技術を活用します。ヤップ誘起 SCs は、内因性の SCs が存在しない実験、生物や病気の条件でも organoid 形成 SCs を生成するかもしれません。他の初期化の手順の違いでヤップによって与えられる細胞の可塑性の種類が生体組織に発生する SC のような状態に復帰の唯一の形式に対応していること、したいと思います。SC のような気質の買い戻しは組織の修復や発癌活性化5と関連付けられています。いくつかの成体組織の恒常性に不可欠なヤップや TAZ が再生、腫瘍の増殖培養1,6,7,8 体 SCs の拡大に必要不可欠、9,10、11,12

<table><tbody><tr><td>10 mL滅菌シリンジ</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp; セルストレーナー</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 滅菌コニカルチューブ</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル超低アタッチメントプレート</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm セルストレーナー</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルマルチウェルプレート</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 滅菌コニカルチューブ</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルマルチウェルプレート</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、I 型</td><td>Σ</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Σ</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ギブコ</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>スワン・モートン</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ギブコ</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>11284932001</td><td></td><td>ド</td></tr><tr><td>キシサイクリン ヒクレート</td><td>シグマ</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FACS チューブ (ストレーナーキャップ付き)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr>ネガティブ<td>コントロールとして</td><td>使用したFUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;ネガティブコントロールとして使用した#84008</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td>を<td>ネガティブコントロールとして使用 (転写死YAP変異体)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>ΣH3149&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES緩衝液 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>human R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase from usvine testes</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14抗体</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K-8抗体</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>&nbsp;</td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin(アロフィコシアニン[APC]マウス系統抗体カクテル)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg;成長因子低減基底膜マトリックス、フェノールレッドフリー</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Σ</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Σ</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>非細胞接着性10cm皿(滅菌ポリスチロールペトリ皿&oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PEハムスター抗マウスCD61</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5ラット反ヒトCD49f</td><td>BDバイオサイエンス551129</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗マウス/ラット CD29 抗体</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン I (コーティング)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン I 3D 培養用</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスFGF 基本 (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 中程度</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (トリプシン阻害剤Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbspから;</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth中型</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

ここでプライマリの分化した細胞とターン ヤップ転写因子の発現による同じ系統の幹細胞/前駆細胞 (SCs) にそれらを分離するためのプロトコルを提案する.この方法では、マウス乳腺の管腔の分化 (LD) 細胞はターン完全に差別化された膵外分泌細胞膵臓にダクトのようなまたヤップは、乳腺 SCs の分子・機能特性を表わす細胞に変換されます。前駆細胞。同様に、内因性、自然の scs ヤップ誘起幹様細胞 (「ySCs」) 最終的にとして展開できること organoid 文化長期in vitro における異所性ヤップ/タズ、のさらなる必要性なし ySCs、遺伝性自己更新 SC のような状態に恵まれています。
ここに示すプログラムし直す手順を生成し、分化細胞から始まって様々 な組織の源の前駆細胞の in vitroを展開する可能性を提供しています。Ex vivo体細胞の単純な拡張は、細胞・発生生物学研究一般、腫瘍発生のメカニズムの理解より多くの再生医療のための含意を持ってください。

YMaSCs の生成 ヤップの発現による主な乳腺 LD 細胞を再プログラムする実験的戦略の概要については、図 1 aにされます。一次乳腺 LD の上皮細胞は13を並べ替え蛍光活性化細胞によって精製しました。図 1 bは、3 つの異なる集団を取得する典型的な並べ替えプロシージャを表します: 基底細胞 (EpCAM低CD49f高CD61-)、Luminal 前駆 (LP) のセル (EpCAM高CD49f低CD61+) と LD セル (EpCAM高CD49f低CD61-)。それが完全に区別される LD セルの純粋な調製を分離するために不可欠な 3 つの subpopulations のゲートは注意してくださいと成形条件 (参照図 1、左右パネル) 乳腺コロニーでシードするとき完全に成長が逮捕されました。逆に、外因性ヤップを表現する誘導、LD セルは 5% 基底膜マトリックス培養 (図 1) で簡単に認識できる密な上皮コロニーを形成する増殖を開始します。リプログラミング、効率は、約 3% の一般的な実験、単一細胞基底膜マトリックス培養 (図 1) でもともとシード数コロニー数をカウントすることによって獲得することができますを証明しました。プログラムし直された管腔細胞 (yMaSCs) 100% 基底膜マトリックスにおける培養条件 (図 1 aのスキームを参照してください)、複数ルーメン周辺開発複雑な器官毛細状構造に自己組織化への通路をすることができますし、ドキシサイクリン (すなわち遺伝子組換えヤップ発現の不在で) の不在でも驚くべき自己複製能力を表示 (図 1E)。病理 yMaSC 派生 organoids 表示基底層 (K14 正)、ECM と organoid (図 1 階) 内ルーメンのような空洞を直面している腔層 (K8 の肯定的な)、再構成した基底膜マトリックスに直面しています。このアーキテクチャは、ネイティブ MaSCs (図 1 f) によって形成されたオルガノイドの区別ではありません。
YDucts の生成 図 2 aで、ヤップの発現による主膵腺を再プログラムする実験的戦略を説明はします。全体の腺房のクラスターは、軽度の解離とろ過によりサイズ排除の組み合わせによる膵組織の大部分から分離されます。一般的な準備は、図 2 bに提示されます。分離、内分泌膵や膵管ツリーと単一のセルに最小限の解離フラグメントによって汚染なしとの均一なサイズの外分泌腺の腺房単位の懸濁液として腺房細胞のクラスターが表示されます。膵や膵管の破片による汚染は欠乏フィルタ (ステップ 2.1.10) 過酷な取り扱いのための徴候単一のセルに腺房のクラスターの不要な解離過度コラゲナーゼ処理またはバッファリングされていないアクティビティ追加 SBTI 治療によって抑制することができます組織が発表したタンパク質分解酵素の可能性があります。
図 2; の典型的な腺房リプログラミング実験を提示します。3 D コラーゲンの文化の 5-7 日以内-私はドキシサイクリンの存在下でゲルに基づく、容易にR26 rtTAM2/重音テト ヤップS127Aマウス由来膵腺管のようなクラスターに薄い撰 (我々 というyDucts)、拡大中央キャビティ中で増殖する上皮細胞の単層。典型的な実験のための 70% 程度である、リプログラミング効率は、シード房 (図 2 D) の合計数以上のダクトのようなクラスター数の得点を簡単に測定できます。陰性対照細胞、つまりR26 rtTAM2/+細胞またはR26 rtTAM2/重音テト ヤップS127Aセル左ドキシサイクリン、なし常として残っているされませんこれら文化の条件で以前に報告される1 ポスト mitotic の腺房クラスター ,14,15。プログラムし直された yDucts、マトリゲル ベース organoid 文化条件16に単一セルのレベルで継代するにすることができます (図 2 aのスキームを参照)、(すなわちドキシサイクリンの不在でも驚くべき自己複製能力を表示します。遺伝子組換えのヤップ発現の不在) で (図 2 e)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> 図 1:主な乳腺 LD の単離細胞や乳腺の誘導は幹細胞です。(A)実験手順の概略を採用し、主な乳腺 LD セルをプログラムし直します。(B)代表 FACS プロット典型的な並べ替えプロシージャを示す LD セルを浄化します。i) 解離細胞は生きているセル (P1; 青) の前方および側面の散布によるとゲートします。ii) 人口 P1 は、さらにその林のプロフィールによるとゲート、: リネージュ陰性細胞 (P2; 灰色) の個体を選択すると、系列陽性造血細胞を除くiii) 人口 P2 と分かれています、EpCAM高(P3; 黄色 + 緑) EpCAM、低(P6; 赤) の集団。iv) P3 と P6 は、さらにゲート、CD61/CD49f のプロフィールによると 3 つの集団に: EpCAM低CD49f高CD61-基底細胞 (P7; 赤)、EpCAM高CD49f低CD61+ LP 細胞 (P8; 黄色)EpCAM高CD49f低CD61 と- LD セル (P9; 緑)。(C)画像が乳腺のコロニー中播種後 15 日乳腺のコロニーを形成する示された構造感染 LD 細胞の能力の説明されます。コロニー形成にヤップを表現する細胞ターン細胞、陰性対照細胞 (EGFP 感染) に対しのまま成長阻止された単一のセル。スケールバー = 50 μ m。(D) (C) のように、示された細胞の能力を形作っているコロニーの定量化。データ平均 + 標準偏差で、それぞれ六つの技術的な複製を持つ 5 つの独立した実験の代表であります。(E)ヤップ書き換え乳腺幹細胞様の細胞 (yMaSCs) ドキシサイクリンの不在での三次元 100% 基底膜マトリックス ハイドロゲルは新鮮な内における培養条件に 12 日後の代表的なイメージ。スケールバー = 100 μ m。(F)代表的な蛍光 K14 (緑) の基底のマーカーと K8 の内腔のマーカー (赤) オルガノイドから派生するイメージ示された細胞における培養条件に 12 日後。スケール バー = 10 μ m。この図は予想et al., 20161から再現します。<a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> 図 2: プライマリ膵腺房細胞, 膵前駆細胞の誘導の分離。(A)実験手順の概略を採用し、主な膵外分泌細胞をプログラムし直します。(B)分離手順 (ステップ 2.1.14) 直後後主膵腺の代表的なイメージ。腺房の準備は、単一のセルの最小の存在と腺房のクラスターの均一な懸濁液として表示されます。スケール バー = 400 μ m。(C)主膵腺管構造の代表的なイメージはR26 rtTAM2 (上部パネル) から派生したまたは R26 rtTAM2; 重音テト ヤップS127A (下方のパネル) マウス 3 D コラーゲン培養私と -ハイドロゲルを用いた 5 日間の有無ドキシサイクリン (愛人)、示される。のみプライマリ腺のヤップ表現はドキシサイクリン添加後嚢胞のような器官毛細として育つセルに変換します。スケール バー = 70 μ m。(D) (C) のように遺伝子組み換えのヤップ発現時に管オルガノイドを形成する膵臓腺の能力の定量化。データ平均 + 標準偏差で、4 つの技術的なレプリケートを実行、5 つの独立した実験の代表であります。(E)ドキシサイクリンの不在での三次元 100% 基底膜マトリックス ハイドロゲルは新鮮な 3 通路後ヤップ reprogramed 管のような細胞 (yDucts) の代表的なイメージ。スケール バー = 130 μ m。<a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">主な乳腺細胞の分離</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +キレート ソリューション</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.02 w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コラーゲン コート液私</td>
		</tr>
<tr>
<td>酢酸 0.02N、pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ラット尾コラーゲン (コーティング)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>当期のソリューション</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>解離中</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ原液</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶血性ソリューション</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl ソリューション</td>
			<td>1 パーツ</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 グラム/L の</td>
			<td>9 パーツ</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.2 pH を調整します。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ原液</td>
			<td>0.2 μ m のフィルターは、4 ° C で保存</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ ウシ精巣 (粉末)</td>
			<td>2,000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナトリウム リン酸バッファー 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl ソリューション</td>
			<td>T. amb を格納します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.65 に pH を合わせなさい</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>並べ替えのソリューション</td>
			<td>0.2 μ m のフィルターは、4 ° C で保存</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>洗浄媒体 #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>洗浄中 #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>乳腺の 2次元培養培地</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘパリン</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">誘導と yMaSCs の継</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">乳腺のコロニー中</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘパリン</td>
			<td>4 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>マトリゲル (播種する前にすぐに追加)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">乳腺における媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>高度な DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘパリン</td>
			<td>4 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間の頭</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R Spondin 1</td>
			<td>1 μ G/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: yMaSCs の生成します。すべての異なる文化メディアと一次乳腺 LD 細胞の分離と yMaSCs (セクション 1) の誘導に必要なソリューションの構成
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">主な膵腺管構造の分離</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">腺房の培</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>デキサメタゾン</td>
			<td>1 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>その X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth の媒体</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">腺房洗浄中</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI 培地</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">腺房のリカバリ媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>腺房の培</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コラゲナーゼ私溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>腺房洗浄中</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>-20 ° C でストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼ、型私 (粉末)</td>
			<td>6,000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">膵オルガノイドの継</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コラゲナーゼ私ソリューション B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">膵臓における媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>高度な DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガストリン</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間 FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間の頭</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-アセチルシステイン</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ニコチン酸アミド</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: yDucts の生成します。すべての異なる文化メディアとプライマリ腺房細胞の誘導分離および yDucts (セクション 2) の通過に必要なソリューションの構成

体 SCs の可用性は再生医療の重要な疾患モデル作製と SC プロパティへの洞察力を得るために。再プログラムする実験的戦略の紹介、体外が単一の転写コアクチベーター ヤップの一過性の発現によって彼らの対応する拡張幹/前駆細胞の細胞に成体細胞を区別します。

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

この手順の全体的な目標は、転写因子YAPの一過性の発現により、一次分化細胞を同じ系統の前駆細胞に変えることです。このリプログラミング手順により、内在性幹細胞がまれであったり、同定が困難な場合でも、分化した対応物から開始して、さまざまな組織のin vitro前駆細胞様細胞または幹様細胞を生成する可能性を提供します。ここで体細胞を生体外で拡大する可能性は、再生医療、がんにも関連する細胞可塑性のメカニズムの理解、細胞組織、生物学研究の発展に影響を及ぼします。この手順は、胚性幹細胞の分化を通じて特殊な細胞を作ることを目指しているのではなく、分化した細胞から組織特異的な幹細胞を作ることを目指しているため、現在のリプログラミング分野のブラックボックスを埋めるものです。テキストプロトコルに従って10匹の雌マウスを犠牲にした後、腹部の皮膚に沿ってY字型の切開を行うことにより乳腺を解剖します。次に、デュモン鉗子を使用して、そっと引っ張ることにより、腺を腹膜から慎重に分離します。解剖した腺を、10ミリリットルの氷冷HBSS + PSを入れた非細胞接着皿に入れます。組織培養フードの下で、10ミリリットルの新鮮なHBSS+PSを使用して各腺を1回洗浄し、空の非細胞接着皿に入れます。次に、2つの滅菌メスを使用して、腺を細かく刻んで1立方ミリメートルの断片にします。効率的な細胞単離には、腺の適切なミンチ化が不可欠です。20個の腺を一緒に引っ張り、最適な細胞生存率を得るために3〜5分以内にこのステップを実行してみてください。25ミリリットルの血清ピペットと10ミリリットルの解離培地を使用して、各ディッシュからミンチ組織を回収し、懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブピペッティングで少なくとも5回移して、組織凝集体を解体します。組織を摂氏37度で1時間インキュベートし、激しく振とう続けます。次に、消化した組織を室温で400倍gで5分間スピンダウンします。上清を捨てた後、3ミリリットルの溶血液を使用して組織を再懸濁し、氷上で3分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの洗浄培地番号1で、細胞を洗浄します。消化された組織を回転させ、上清を捨てた後、組織ペレットを10ミリリットルの洗浄培地番号2に再懸濁し、細胞を10cmの組織培養皿にプレートします。次に、皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに回収し、チューブをgの400倍で5分間回転させます。次に、10ミリリットルのカルシウムキレート溶液を使用して、ペレットを再懸濁します。遠心分離後、洗浄を繰り返した後、ペレットを5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAに再懸濁します。サンプルをインキュベートした後、トリプシン溶液の上にDNase1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充した5ミリリットルのディスパーゼ溶液を加えます。塊を分解するには、1ミリリットルのピペットチップを使用して少なくとも5回上下にピペットを動かし、サンプルを摂氏37度で10分間インキュベートし、3分ごとに振とうします。10ミリリットルの洗浄媒体2番を加え、40マイクロメートルのセルストレーナーで溶液をろ過して、新しい50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。次に、細胞懸濁液をスピンダウンします。FACSによる細胞精製を行うには、200マイクロリットルの洗浄剤1を使用して各ペレットを再懸濁します。次に、44.5マイクロリットルの抗体混合物を加え、完全にピペットでピペットでサンプルをインキュベートし、氷上で30分間暗所でサンプルをインキュベートします。細胞懸濁液を10ミリリットルの洗浄剤1番で希釈し、サンプルをスピンダウンします。細胞ペレットを2ミリリットルの選別溶液に再懸濁し、キャップストレーナーFACSチューブでろ過してから、細胞集団のFACS分離に進みます。FACSから回収した細胞を洗浄するには、1番の洗浄液を使用してください。上清を取り除いた後、乳腺の2D培養培地を使用して細胞ペレットを再懸濁し、コラーゲン処理プレート上にウェルあたり500マイクロリットルのプレートをプレートします。レンチウイルスに感染した初代LD細胞のドキシサイクリン誘導の7日後、05%トリプシン-EDTAのウェルあたり150マイクロリットルを細胞に加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。.細胞を洗浄してカウントしたら、ドキシサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムを補充したメモリーコロニー培地を使用して、細胞を再懸濁します。次に、24ウェルの超低接着プレートにウェルあたり1, 000個の細胞を播種し、YAP発現マスクのようなコロニーを培養します。マスクを継代培養するには、各サンプルを収集し、10〜1容量の氷冷HBSSを加え、次にサンプルを氷上で1時間インキュベートして、基底膜マトリックスを可溶化します。コロニーをスピンダウンした後、氷冷したHBSSを使用して細胞を3回洗浄します。次に、05%トリプシン-EDTAをコロニーに加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。コロニーをP1000ピペットチップに10回通して、単一細胞懸濁液を得ます。次に、ドキシサイクリンを含まない乳房コロニー培地の細胞を、ウェルあたり1, 000細胞の結腸形成密度で24ウェル超低接着プレートでカウントし、再播種します。3回目の継代の前に、乳房コロニー培地からコロニーを回収することにより、オルガノイド培養条件でyマスクコロニーを移し、100%成長因子を減少させた基底膜マトリックスを使用してそれらを再懸濁します。インキュベーション後、基底膜マトリックスが固化したら、ゲルを500マイクロリットルの乳腺オルガノイド培地で覆います。各オルガノイドサンプルを採取し、氷上で過剰量のHBSSに1時間インキュベートして、培養物を継ぎます。次に、氷冷したHBSSを使用してオルガノイドを3回洗います。このビデオで前述したようにオルガノイドをトリプシン処理し、100%成長因子減少基底膜マトリックスの滴で単一細胞懸濁液を再播種し、500マイクロリットルの乳腺オルガノイド培地を使用してゲルを重ね合わせます。テキストプロトコルに従って消化されたマウス膵臓組織を洗浄した後、6ミリリットルの腺房回復培地を使用して、消化された組織を慎重に再懸濁し、6ウェル組織培養プレートの2つのウェルに分割します。実体顕微鏡下で、腺房分離物の品質を慎重に評価し、最終的に存在する大きな組織の塊を取り除きます。初代膵臓腺房を播種するには、細胞回収のためにクラスターを2時間インキュベートした後、腺房細胞懸濁液を円錐管に集め、サンプルを100倍g、摂氏18度で5分間遠心分離します。腺房培養培地で腺房を再懸濁した後、懸濁液を等量の中和ラットテールコラーゲン1溶液で希釈し、チューブを氷上に保ちます。注意深く迅速に混合し、コラーゲンクッションの上の16ウェルに細胞懸濁液を播種します。膵臓腺房の最適な播種には、めっき前にすべてのチューブを氷の中に保ち、迅速に進めることが重要ですが、同時に、均一なコラーゲンマトリックスを作成するには、気泡の形成を防ぐための慎重なピペッティングが不可欠です。細胞を摂氏37度で1時間インキュベートし、ヒドロゲルが形成されます。次に、膵臓オルガノイドを誘導するために、コラーゲンハイドロゲルにドキシサイクリンを添加した500マイクロリットルの腺房培養培地を重ねます。オルガノイドを継代培養するには、培地を廃棄し、ヒドロゲルを慎重に抽出し、4ミリリットルのコラゲナーゼI溶液Bを含む円錐形のチューブに移し、チューブを摂氏37度で30分間激しく振とうしながらインキュベートした後、細胞をスピンダウンして上清を除去します。細胞をトリプシン処理し、PBS上清を除去した後、氷冷基底膜マトリックスを使用して細胞ペレットを再懸濁し、超低付着プレートに懸濁液を播種します。プレートを摂氏37度で40分間インキュベートして基底膜マトリックスハイドロゲルを固化させ、次に膵臓オルガノイド培地で重ねます。yDuctsは7〜10日でオルガノイドのような嚢胞として成長します。初代乳腺LD上皮細胞をここに示されている3つの亜集団に慎重にゲーティングすることは、乳腺コロニー形成条件に播種されたときに完全に分化し、完全に増殖が停止するLD細胞の純粋な調製物を単離するために不可欠です。逆に、外因性YAPを発現するように誘導されると、LD細胞は増殖を開始し、5%基底膜マトリックス懸濁培養物で容易に認識できる高密度の上皮コロニーを形成します。基底膜マトリックスオルガノイド培養条件下では、再プログラムされた管腔細胞は、複数の内腔の周りに発達し、ドキシサイクリンがなくても自己再生する複雑なオルガノイドのような構造に自己組織化します。ドキシサイクリンの存在下で3DコラーゲンIベースのヒドロゲルで培養する5〜7日以内に、分化した汎性腺房は、拡大する中央空洞の周りで増殖する上皮細胞の薄い単層で構成されるクラスターまたはyDuctsのような管に容易に変わります。再プログラミング効率は、播種された腺房の総数に対してダクトのようなクラスターの数をスコアリングすることで簡単に測定できます。その後、再プログラムされたyDuctsは、単一細胞レベルでマトリゲルベースのオルガノイド培養条件に継代することができ、内因性YAP発現がない場合でも顕著な自己再生能力を示します。2つの手順を詳しく説明します。1つはレンチウイルスベクターによるFACS精製細胞のリプログラミングを可能にし、もう1つはウイルス感染を回避し、トランスジェニックYAP発現を利用するものでした。乳腺細胞のリプログラミングを試みる際には、過剰なウイルス力価の使用を避けることが重要です。これは、リプログラミングの効率に悪影響を与える可能性があるためです。完全トランスジェニック戦略は、レンチウイルス感染にほとんど適していないため、原発性膵臓腺房に適しています。また、ドキシサイクリン依存性レンチウイルスベクターと同じ利点を遺伝子発現のタイプ制御にもたらします。ここで示した例に加えて、このYAPリプログラミングプロトコルは、分化したニューロンを増殖するニューロン自体に変換することに成功したことが証明されています。このビデオを見れば、異なる成体組織から分化した細胞タイプを対応する組織特異的幹細胞に変換するためのYAP依存性リプログラミングの実行方法について十分に理解できるはずです。この手順は、再生医療、体細胞幹細胞の研究、および体細胞のin vitroでの増殖に関連する可能性のある体細胞幹細胞を生成する手段を提供することにより、現在のリプログラミング戦略を拡大します。レンチウイルス製剤の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、安全レベルから常に2つの対策を採用する必要があると考えてください。

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、誘導レンチウイルスを用いて誘導多能性幹細胞を生成するための手順を示して発現するOct4は、レトロウイルスベクター、c -...

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。...

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

この研究は、奇形腫を生成せずに、生体内での体細胞の多能性に向けた再プログラミングを示しています。ヤマンカ因子をコードするプラスミドDNAの流体力学的尾静脈注入を使用して、成体肝細胞の多能性が強化された細胞へのin...

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

始原生殖細胞 (PGCs) 精子と卵の両方の共通の前駆体であります。人間の胚の始原生殖は、サイトカインとの相互作用を通じて多能性胚盤葉上層の細胞から指定されます。ここでは、プライミング多能性誘導多能性幹細胞からの胚様体の表面で孵卵に似たひと細胞 transcriptomally を誘導する 13...

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。...

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

本稿では、レンチウイルスベクターを用いた強膜の過剰発現と2Dバイオリアクター による...

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

学ぶYAPを用いた体細胞の幹細胞再プログラミング法。分化細胞を組織特異的な前駆細胞へ変換し、再生医療や細胞可塑性の研究に応用可能です。マウス乳腺組織を用いた詳細なプロトコルを解説します。

・デ・ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

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