・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

この手順の全体的な目標は、転写因子YAPの一過性の発現により、一次分化細胞を同じ系統の前駆細胞に変えることです。このリプログラミング手順により、内在性幹細胞がまれであったり、同定が困難な場合でも、分化した対応物から開始して、さまざまな組織のin vitro前駆細胞様細胞または幹様細胞を生成する可能性を提供します。ここで体細胞を生体外で拡大する可能性は、再生医療、がんにも関連する細胞可塑性のメカニズムの理解、細胞組織、生物学研究の発展に影響を及ぼします。

この手順は、胚性幹細胞の分化を通じて特殊な細胞を作ることを目指しているのではなく、分化した細胞から組織特異的な幹細胞を作ることを目指しているため、現在のリプログラミング分野のブラックボックスを埋めるものです。テキストプロトコルに従って10匹の雌マウスを犠牲にした後、腹部の皮膚に沿ってY字型の切開を行うことにより乳腺を解剖します。次に、デュモン鉗子を使用して、そっと引っ張ることにより、腺を腹膜から慎重に分離します。

解剖した腺を、10ミリリットルの氷冷HBSS + PSを入れた非細胞接着皿に入れます。組織培養フードの下で、10ミリリットルの新鮮なHBSS+PSを使用して各腺を1回洗浄し、空の非細胞接着皿に入れます。次に、2つの滅菌メスを使用して、腺を細かく刻んで1立方ミリメートルの断片にします。

効率的な細胞単離には、腺の適切なミンチ化が不可欠です。20個の腺を一緒に引っ張り、最適な細胞生存率を得るために3〜5分以内にこのステップを実行してみてください。25ミリリットルの血清ピペットと10ミリリットルの解離培地を使用して、各ディッシュからミンチ組織を回収し、懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブピペッティングで少なくとも5回移して、組織凝集体を解体します。

組織を摂氏37度で1時間インキュベートし、激しく振とう続けます。次に、消化した組織を室温で400倍gで5分間スピンダウンします。上清を捨てた後、3ミリリットルの溶血液を使用して組織を再懸濁し、氷上で3分間インキュベートします。

次に、10ミリリットルの洗浄培地番号1で、細胞を洗浄します。消化された組織を回転させ、上清を捨てた後、組織ペレットを10ミリリットルの洗浄培地番号2に再懸濁し、細胞を10cmの組織培養皿にプレートします。次に、皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。

細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに回収し、チューブをgの400倍で5分間回転させます。次に、10ミリリットルのカルシウムキレート溶液を使用して、ペレットを再懸濁します。遠心分離後、洗浄を繰り返した後、ペレットを5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAに再懸濁します。

サンプルをインキュベートした後、トリプシン溶液の上にDNase1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充した5ミリリットルのディスパーゼ溶液を加えます。塊を分解するには、1ミリリットルのピペットチップを使用して少なくとも5回上下にピペットを動かし、サンプルを摂氏37度で10分間インキュベートし、3分ごとに振とうします。10ミリリットルの洗浄媒体2番を加え、40マイクロメートルのセルストレーナーで溶液をろ過して、新しい50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。

次に、細胞懸濁液をスピンダウンします。FACSによる細胞精製を行うには、200マイクロリットルの洗浄剤1を使用して各ペレットを再懸濁します。次に、44.5マイクロリットルの抗体混合物を加え、完全にピペットでピペットでサンプルをインキュベートし、氷上で30分間暗所でサンプルをインキュベー

細胞懸濁液を10ミリリットルの洗浄剤1番で希釈し、サンプルをスピンダウンします。細胞ペレットを2ミリリットルの選別溶液に再懸濁し、キャップストレーナーFACSチューブでろ過してから、細胞集団のFACS分離に進みます。FACSから回収した細胞を洗浄するには、1番の洗浄液を使用してください。

上清を取り除いた後、乳腺の2D培養培地を使用して細胞ペレットを再懸濁し、コラーゲン処理プレート上にウェルあたり500マイクロリットルのプレートをプレートします。レンチウイルスに感染した初代LD細胞のドキシサイクリン誘導の7日後、05%トリプシン-EDTAのウェルあたり150マイクロリットルを細胞に加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。.細胞を洗浄してカウントしたら、ドキシサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムを補充したメモリーコロニー培地を使用して、細胞を再懸濁します。

次に、24ウェルの超低接着プレートにウェルあたり1, 000個の細胞を播種し、YAP発現マスクのようなコロニーを培養します。マスクを継代培養するには、各サンプルを収集し、10〜1容量の氷冷HBSSを加え、次にサンプルを氷上で1時間インキュベートして、基底膜マトリックスを可溶化します。コロニーをスピンダウンした後、氷冷したHBSSを使用して細胞を3回洗浄します。

次に、05%トリプシン-EDTAをコロニーに加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。コロニーをP1000ピペットチップに10回通して、単一細胞懸濁液を得ます。次に、ドキシサイクリンを含まない乳房コロニー培地の細胞を、ウェルあたり1, 000細胞の結腸形成密度で24ウェル超低接着プレートでカウントし、再播種します。

3回目の継代の前に、乳房コロニー培地からコロニーを回収することにより、オルガノイド培養条件でyマスクコロニーを移し、100%成長因子を減少させた基底膜マトリックスを使用してそれらを再懸濁します。インキュベーション後、基底膜マトリックスが固化したら、ゲルを500マイクロリットルの乳腺オルガノイド培地で覆います。各オルガノイドサンプルを採取し、氷上で過剰量のHBSSに1時間インキュベートして、培養物を継ぎます。

次に、氷冷したHBSSを使用してオルガノイドを3回洗います。このビデオで前述したようにオルガノイドをトリプシン処理し、100%成長因子減少基底膜マトリックスの滴で単一細胞懸濁液を再播種し、500マイクロリットルの乳腺オルガノイド培地を使用してゲルを重ね合わせます。テキストプロトコルに従って消化されたマウス膵臓組織を洗浄した後、6ミリリットルの腺房回復培地を使用して、消化された組織を慎重に再懸濁し、6ウェル組織培養プレートの2つのウェルに分割します。

実体顕微鏡下で、腺房分離物の品質を慎重に評価し、最終的に存在する大きな組織の塊を取り除きます。初代膵臓腺房を播種するには、細胞回収のためにクラスターを2時間インキュベートした後、腺房細胞懸濁液を円錐管に集め、サンプルを100倍g、摂氏18度で5分間遠心分離します。腺房培養培地で腺房を再懸濁した後、懸濁液を等量の中和ラットテールコラーゲン1溶液で希釈し、チューブを氷上に保ちます。

注意深く迅速に混合し、コラーゲンクッションの上の16ウェルに細胞懸濁液を播種します。膵臓腺房の最適な播種には、めっき前にすべてのチューブを氷の中に保ち、迅速に進めることが重要ですが、同時に、均一なコラーゲンマトリックスを作成するには、気泡の形成を防ぐための慎重なピペッティングが不可欠です。細胞を摂氏37度で1時間インキュベートし、ヒドロゲルが形成されます。

次に、膵臓オルガノイドを誘導するために、コラーゲンハイドロゲルにドキシサイクリンを添加した500マイクロリットルの腺房培養培地を重ねます。オルガノイドを継代培養するには、培地を廃棄し、ヒドロゲルを慎重に抽出し、4ミリリットルのコラゲナーゼI溶液Bを含む円錐形のチューブに移し、チューブを摂氏37度で30分間激しく振とうしながらインキュベートした後、細胞をスピンダウンして上清を除去します。細胞をトリプシン処理し、PBS上清を除去した後、氷冷基底膜マトリックスを使用して細胞ペレットを再懸濁し、超低付着プレートに懸濁液を播種します。

プレートを摂氏37度で40分間インキュベートして基底膜マトリックスハイドロゲルを固化させ、次に膵臓オルガノイド培地で重ねます。yDuctsは7〜10日でオルガノイドのような嚢胞として成長します。初代乳腺LD上皮細胞をここに示されている3つの亜集団に慎重にゲーティングすることは、乳腺コロニー形成条件に播種されたときに完全に分化し、完全に増殖が停止するLD細胞の純粋な調製物を単離するために不可欠です。

逆に、外因性YAPを発現するように誘導されると、LD細胞は増殖を開始し、5%基底膜マトリックス懸濁培養物で容易に認識できる高密度の上皮コロニーを形成します。基底膜マトリックスオルガノイド培養条件下では、再プログラムされた管腔細胞は、複数の内腔の周りに発達し、ドキシサイクリンがなくても自己再生する複雑なオルガノイドのような構造に自己組織化します。ドキシサイクリンの存在下で3DコラーゲンIベースのヒドロゲルで培養する5〜7日以内に、分化した汎性腺房は、拡大する中央空洞の周りで増殖する上皮細胞の薄い単層で構成されるクラスターまたはyDuctsのような管に容易に変わります。

再プログラミング効率は、播種された腺房の総数に対してダクトのようなクラスターの数をスコアリングすることで簡単に測定できます。その後、再プログラムされたyDuctsは、単一細胞レベルでマトリゲルベースのオルガノイド培養条件に継代することができ、内因性YAP発現がない場合でも顕著な自己再生能力を示します。2つの手順を詳しく説明します。

1つはレンチウイルスベクターによるFACS精製細胞のリプログラミングを可能にし、もう1つはウイルス感染を回避し、トランスジェニックYAP発現を利用するものでした。乳腺細胞のリプログラミングを試みる際には、過剰なウイルス力価の使用を避けることが重要です。これは、リプログラミングの効率に悪影響を与える可能性があるためです。完全トランスジェニック戦略は、レンチウイルス感染にほとんど適していないため、原発性膵臓腺房に適しています。

また、ドキシサイクリン依存性レンチウイルスベクターと同じ利点を遺伝子発現のタイプ制御にもたらします。ここで示した例に加えて、このYAPリプログラミングプロトコルは、分化したニューロンを増殖するニューロン自体に変換することに成功したことが証明されています。このビデオを見れば、異なる成体組織から分化した細胞タイプを対応する組織特異的幹細胞に変換するためのYAP依存性リプログラミングの実行方法について十分に理解できるはずです。

この手順は、再生医療、体細胞幹細胞の研究、および体細胞のin vitroでの増殖に関連する可能性のある体細胞幹細胞を生成する手段を提供することにより、現在のリプログラミング戦略を拡大します。レンチウイルス製剤の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、安全レベルから常に2つの対策を採用する必要があると考えてください。