インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

このプロトコルの全体的な目標は、蛍光顕微鏡法による単一細胞レベルでのインフラマソームの活性化を調べ、乳酸デヒドロゲナーゼによるピロトーシス中の溶解を測定すること、またはLDH放出アッセイを行うことです。この方法は、Caspase-1の活性化がどのように制御されているかなど、インフラマソーム分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、ユーザーがインフラマソーム活性化経路とピロトーシス経路の複数のステップを調べることができることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるAndreas den Hartighです。まず、ガラスカバースリップに播種したLPSプライミング骨髄由来マクロファージの培地を、ウェルあたり5マイクロモルのニゲリシンと5ミリモルのグリシンを添加した290マイクロリットルのDMEM 5培地に置き換えます。24ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに37°C、二酸化炭素5%で60分間戻し、最初の15分後に10μLの30X FAM-YVAD-FMKを加えます。

インキュベーションの最後に、ウェルあたり1ミリリットルの冷たいPBSで細胞を洗浄し、1回の洗浄につき5分間、ウェルあたり250マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドで細胞を30分間、光から保護された氷上で固定し、最後の5分間に適切な蛍光核色素で細胞を標識します。インキュベーションの終了時に、先ほど示したように細胞を冷PBSで3回洗浄し、各スライドに7マイクロリットルの退色防止封入剤をロードします。各スライドにカバースリップを置き、封入剤を一晩硬化させてから、マニキュアでカバースリップを密封します。

蛍光共焦点顕微鏡で細胞をイメージングするには、未処理のコントロールスライドを顕微鏡ステージに置き、手動で細胞に焦点を合わせます。顕微鏡ルックアップテーブルの設定を使用して、未処理の細胞に陽性のプローブ染色が観察されなくなるまでオフセットを調整します。次に、ニゲリシン処理サンプルを使用して、プローブ染色に対して陽性細胞と陰性細胞の両方を含むフィールドを特定し、プローブチャネルのイメージング面を、陽性染色の強度が最も高い面に調整します。

次に、凝縮した核を持つ細胞に病巣が見えるまでゲインを調整し、スライドごとにランダムに選択された5つのフィールドの画像を合計倍率100倍で取得します。ニゲリシン処理細胞の免疫フルオロ化学的分析では、示したようにプロップ標識細胞を洗浄し、ウェルあたり250マイクロリットルの固定および透過化溶液で細胞をインキュベートし、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。マクロファージを新鮮な洗浄バッファーでさらに3回洗浄し、C末端カスパーゼリクルートメントドメイン(ASC)を含む眼瞼下垂関連斑点様タンパク質に対する250マイクロリットルの一次抗体で細胞を標識し、氷上で1時間

インキュベーションの終了時に細胞を洗浄し、氷上でさらに1時間、適切な蛍光色素標識二次抗体250マイクロリットルでサンプルを標識し、最後の5分間に適切な蛍光核染色色素を4マイクロリットル加えます。細胞をコールドウォッシュバッファーで3回洗浄した後、示されているように、7マイクロリットルの退色防止封入剤でカバースリップをスライドにマウントし、蛍光共焦点顕微鏡でマクロファージをイメージングします。LDH放出アッセイを行うには、10マイクロモルのニゲリシンを添加した50マイクロリットルのDMEM 5培地を各実験ウェルに、50マイクロリットルのDMEM 5を自発的および100%溶解コントロールウェルに37°Cおよび5%二酸化炭素で60分間追加します。

30分後、100マイクロリットルの10X溶解バッファーを100%溶解コントロールウェルに加え、10マイクロリットルの培地を他のウェルに加えます。インキュベーションの終了時に、プレートを遠心分離し、各ウェルから50マイクロリットルの上清を透明な平底プレートに移します。次に、解凍して調製したばかりの50マイクロリットルの基質を各ウェルに加え、暗所で30分間インキュベーションし、15分後にプレートをチェックして、シグナルがプレートリーダーの検出限界を超えないことを確認します。

インキュベーションの終了時に、各ウェルに50マイクロリットルの停止溶液を追加し、適切なプレートリーダーでOD490を測定して、ウェルあたりの細胞溶解の割合を計算できるようにします。一方、ニゲリシンに曝露されたマクロファージは、活性型カスパーゼ-1を含む核周囲領域にASC焦点の形成を示しており、これらの細胞がピロトーシスを受けていることを示しています。Caspase-111欠損マウス由来のマクロファージもASCフォーカスを生成しますが、これらの細胞は、FAM-YVAD-FMK染色が存在しないことからわかるように、このフォーカスに関連する活性Caspase-1を持っていません。

また、これらの細胞の核は凝縮しておらず、ピロトーシス細胞死がないことを示しています。さらに、野生型マクロファージの大部分は、培養上清のLDH放出分析によって測定されるように、ニゲリシン曝露後に細胞死を起こしますが、カスパーゼ-1を欠損したマクロファージはLDHを上清に放出せず、細胞がまだ無傷であることを示しています。このビデオを見れば、蛍光顕微鏡によるインフラマソーム形成の可視化方法と、LDH放出の測定による細胞溶解レベルの決定方法について、十分に理解できるはずです。

この手順は、他のインフラマソーム刺激の使用や、インフラマソームの活性化またはピロトーシスを変化させる介入のために変更することができます。