MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

この実験の全体的な目標は、複数の粗抽出物中のプロテアーゼ特異性を決定することです。この方法は、プロテアーゼ特異性を決定するための重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、パーレイ中の複数のサンプルのプロテアーゼ特異性を同定できることです。

氷中で雄のICRマウスから得られた冷却肺組織サンプル。ブレンダーで30秒間、20, 000 RMPでサンプルを均質化します。サンプルが完全に均質になるまで、この手順を繰り返します。

温度の上昇を避けるために、1分以上連続して均質化しないでください。ホモジネートの1, 000マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度でGの10, 000倍で5分間遠心分離します。500マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルのプラスチックチューブに移します。

10マイクロリットルのサンプルを使用して、タンパク質濃度を測定します。ビシンコニン酸アッセイやブラッドフォードアッセイなどの方法を使用します。凍結を防ぐため、サンプルに80%グリセロールを添加し、最終濃度を50%グリセロールにします。

pHによるプロテアーゼ特異性の違いを明らかにするには、pH 3、5、7、および9に調整された消化バッファーを使用してください。消化緩衝液の890マイクロリットルに、マイクロリットルあたり0.1マイクログラムまたはTPCKトリプシンの10マイクロリットル、黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼのマイクロリットルあたり0.1マイクログラム、または組織抽出物のマイクロリットルあたり10マイクログラムのいずれかを追加します。組織抽出物中のプロテアーゼをインキュベーションし、10分間沸騰水で不活性化することにより、ネガティブコントロールを調製します。

次に、10マイクロリットルのMNOビオチン標識基質をサンプルに加え、摂氏37度で3時間インキュベートして消化します。インキュベーション後、沸騰水による基質の消化を10分間停止します。消化した基質を摂氏4度でGの10, 000倍で5分間遠心分離します。

上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。0.1%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む1つのモルトリスバッファーに50ミリリットルの50%ストレプトアビジンセファロースビーズを加えます。pH試験紙を使用して、溶液がpH9前後であることを確認します。

適切なpHを9以上に調整することが重要です。アミノビオチンは、pH9以上でないとビーズを噛むことができません。溶液のpHが低い場合は、バッファーを追加して約pH9に調整します。

さらに、必要に応じて1モルトリス緩衝液を添加してpHを上げることができます。懸濁液を摂氏4度で一晩インキュベートし、ローテーターホイールで連続的に穏やかに混合して、MNOビオチン標識基質をストレプトアビジンに結合させます。ビーズはインキュベーション中ずっと懸濁したままにする必要があります。

翌日、サンプルを摂氏4度でGの10, 000倍で1分間遠心分離します。上清を取り除いた後、1, 000マイクロリットルの洗浄緩衝液を加えてビーズを洗浄します。次に、ローテーター上で連続的に穏やかに混合しながら、摂氏4度で10分間インキュベートします。

ビーズを摂氏4度でGの10, 000倍で1分間遠心分離します。上清を取り除き、この洗浄を4回繰り返します。次に、100マイクロリットルの0.2%トリフルオロ酢酸をビーズに加えます。

pH試験紙を使用して、溶液がpH 2未満であることを確認します。溶液のpHが高い場合は、1%トリフルオロ酢酸を添加してpHを2以下に調整します。懸濁液を室温で30分間インキュベートし、ローテーターホイール上で連続的に穏やかに混合します。

前と同じようにビーズを遠心分離した後、上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。20マイクロリットルのアセトニトリルをC18樹脂にピペットで移し、活性化します。使用済みのアセトニトリルを取り出し、この活性化手順を3回繰り返します。

次に、C18樹脂を20マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸と平衡化します。溶離液を取り出し、この平衡化ステップを3回繰り返します。サンプルをロードするには、ピペットを使用してサンプルをレジンに結合します。

20マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で樹脂を洗浄します。この手順を 5 回繰り返します。0.1%トリフルオロ酢酸中の3マイクロリットルの60%アセトニトリルでサンプルを溶出します。

MALDI-TOF質量分析用のターゲットプレートに溶離液をピペットで移します。0.1%トリフルオロ酢酸中の50%アセトニトリルで飽和したCHCA溶液を直ちに加えます。風乾により混合物を結晶化します。

装置メーカーのプロトコルに従って、ビオチン標識基質の切断形態の700〜900ダルトンの質量スペクトルに細心の注意を払いながら、サンプルの質量スペクトルを取得します。合成基質の質量スペクトルを以下に示します。前駆体の分子量に対応するピークは、850〜1,050の間で検出されました。

切断されたフラグメントは、700〜850の範囲で検出されます。ここに示されているのは、TPCKトリプシンで処理されたMNOビオチン標識基質のスペクトルです。839.81ダルトンと796.76ダルトンのピークは、それぞれリジンとアルギニンのC末端から切断されたフラグメントに対応しています。

ここに示されているのは、V8プロテアーゼで消化された合成基質の質量スペクトルです。769.78ダルトンと755.62ダルトンのピークは、それぞれグルタミン酸とアスパラギン酸のC末端から切断されたフラグメントに対応します。ここでは、さまざまなpH条件で肺組織抽出物で処理したMNOビオチン標識基質のスペクトルを示します。

酸性条件では、pH 5で、切断されたフラグメントの分子量は770.13ダルトンと826.66ダルトンであり、グルタミン酸とトリプトファンのC末端での切断を示しています。pH 7および9の中性および塩基性条件では、切断された断片の分子量は767ダルトンおよび840ダルトンのピークで増加し、アルギニンおよびリジンのC末端で切断されたことを示している。逆に、グルタミン酸とトリプトファンのピークは減少しました。

さらに、この方法では、不活化抽出物で切断されたフラグメントは検出できません。一度習得すると、この技術は、基質の合成を除いて、適切に実行されれば2日で行うことができます。さらに、基板が合成されると、いくつかのサンプルで測定できます。なぜでしょうか。

この手順を試みるときは、緩衝液のpH約9で操作することを覚えておくことが重要です。一般的に、アビジンアミノビオチン複合体の反応。この手順に従うと、CMSを行うことで酵素活性を定量することができます。

この方法により、プロテオン分野の研究者は、いくつかの条件下でのプロテアーゼ発現を探索する道を切り開くことができます。