ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

このCDNAライブラリー調製の全体的な目標は、パラフィン包埋組織および固定組織に保存された低分子RNAのシーケンシングを成功させることです。この方法は、パラフィンを正式および固定的に包埋した標本の分析に非常に役立ちます。最大 18 個の検体から RNA を抽出し、これらすべての含有量を分析し、すべての検体についてすべての microRNase のプロファイルを取得します。

プロトコールを開始するには、個別に分注した18個のFFPERNAサンプルのそれぞれに、事前に調製したライゲーションマスターミックスの8.5マイクロリットルを追加します。チューブを静かにフリックし、2秒間遠心分離します。遠心分離後、チューブを氷上に保管します。

3マイクロリットルのピペットを使用して、各アダプターの1マイクロリットルを、RNAとライゲーションマスターミックスを含む対応するFFPERNAサンプルに移します。ピペットで上下したり、FFPERNAサンプル間でチップを交換したりしないでください。各チューブを閉じ、フリックして混合し、2秒間遠心分離します。

チューブを氷の上に置きます。チューブを摂氏90度のヒートブロックに1分間置いて反応を変性させ、すぐに氷の上に置きます。次に、3マイクロリットルのピペットを使用して、希釈したライゲーション酵素1マイクロリットルを18のRNAサンプルのそれぞれに移します。

ライゲーションを氷の上に置き、摂氏4度の冷蔵室に置き、18時間の一晩インキュベーションします。チューブを90°Cで1分間ヒートブロックに置き、ライゲーション反応を非アクティブ化した後、少なくとも2分間氷に戻して冷却します。1.2マイクロリットルの沈殿マスターミックスを各チューブに移します。

100%エタノールを63マイクロリットル加えます。各チューブを閉じ、チューブをフリックして混合し、2秒間遠心分離します。チューブを氷の上に置きます。

18本のチューブすべての内容物を1.5ミリリットルのシリコン処理チューブ1本に混ぜ合わせ、3回反転させて混合します。チューブを2秒間遠心分離し、氷の上に60分間置いて沈殿させます。沈殿後、1.5ミリリットルのチューブをプールしたライゲーションで遠心分離します。

次に、1ミリリットルのピペットチップで上澄みを取り除きますが、底に液体を残します。チューブを傾け、20マイクロリットルのピペットを使用して残りの上清を取り除きます。先端が10マイクロリットルのパスツールピペットで上清を真空吸引し、チューブをフリックしてRNAペレットを20マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。

20マイクロリットルのPAAゲルローディング溶液を加えて、RNAを再懸濁します。チューブをフリックし、室温で2秒間遠心分離し、チューブを氷の上に置きます。以前に調製したゲル装置の0.5 XTBEを新しい0.5 XTBEと交換し、後者、サイズマーカー、およびライゲーションされたRNaseをゲルの中央にロードし、両側に2つの空のウェルを残します。

次に、ゲルを実行します。ゲルを流した後、ガラスプレートの1つを取り外して15%ページのキャストを外します。ガラスプレートの上に置いたゲルに10マイクロリットルの蛍光色素溶液と25ミリリットルの0.5XTBEを軽くスプレーし、暗所で5分間平らに置きます。

ゲルを塗布したガラスを青色光トランスイルミネーターに置き、19ヌクレオチドおよび24ヌクレオチドサイズマーカーの両方を定規で整列させて、ライゲーションされた低分子RNAの切除を指示します。次に、ゲルを切除します。切除したゲルを、ゲルスライスを断片化するように設計された0.5ミリリットルのチューブに入れ、1.5ミリリットルのシリコン処理された微量遠心チューブにしっかりと配置します。

ゲルをGの16,000倍で室温で3分間遠心分離します。断片化したゲルを300マイクロリットルの400ミリモル塩化ナトリウム溶液で再懸濁します。.チューブを閉じ、パラフィンフィルムで密封します。

モミキサーで内容物を摂氏4度の冷蔵室で1100RPMで攪拌し、一晩インキュベーションします。翌日、サーモミキサーからチューブを取り出し、1ミリリットルのピペットを使用して溶液を5マイクロメートルのフィルターチューブに移し、1.5ミリリットルのシリコン処理されたRNaseフリーの収集チューブに挿入します。室温でGの2300倍でチューブを3分間遠心分離します。

フィルターチューブを廃棄し、ろ過された溶液を含む収集チューブに950マイクロリットルの100%エタノールを加え、チューブを反転させて混合します。チューブを2秒間遠心分離し、氷の上に60分間置きます。次に、RNAペレットを沈殿させます。

次に、キャップを開けてRNAペレットを乾燥させ、底に液体を残しながら、1ミリリットルのピペットで上清を慎重に取り除きます。20マイクロリットルのピペットを使用して、ペレットに触れずに残りの上清をすべて取り除きます。チューブを傾けて、残りの溶液がペレットの反対側に移動するようにします。

パスツールピペットを使用して上清を吸引し、真空でペレットを乾燥させます。RNAペレットを5.6マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。逆転写試薬を氷上で15分間解凍します。

3マイクロリットルの5Xバッファー、4.2マイクロリットルの10Xジオキシヌクレオチド三リン酸(DNTP)、および1.5マイクロリットルのジチオスレイトール(DTT)を添加して、逆転写反応を設定します。チューブを静かにフリックして反応を混合し、2秒間遠心分離して溶液を収集します。反応が摂氏90度のヒートブロックで正確に30秒間行われた後、摂氏50度のサーモミキサーに直接2分間移して温度を均一にします。

0.75マイクロリットルの逆転写酵素を溶液に直接加えます。軽くフリックして混合し、チューブを摂氏50度のサーモミキサーにすぐに30分間戻します。30分後、チューブを摂氏95度のヒートブロックに1分間移し、逆転写を停止します。

95マイクロリットルのRNaseフリー水を直接逆転写に加えます。チューブをフリックして混ぜ合わせ、氷に直接2分間セットします。パイロットPCR反応を組み立て、サーモサイクラーで2つのPCRサイクルをセットアップします。

サーモサイクラーでパイロットPCR反応を設定し、ファイル1を開始します。ファイル1の最後に、20マイクロリットルのピペットを使用して、パイロットPCR反応から得られた12マイクロリットルを、3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素を含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。ピペッティングで上下に動かして混合します。

そして、10サイクルとラベルを付けます。パイロットPCRチューブを閉じ、サーモサイクラーでファイル2を開始します。ファイル2の最後に、20マイクロリットルのピペットを使用して、12マイクロリットルの溶液を3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素が入った1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、12サイクルでラベル付けします。

上記の手順を繰り返して、PCRサイクル14、16、18、および20のパイロットPCR反応から12マイクロリットルのPCR産物を回収します。次に、12マイクロリットルのPCRアリコートのそれぞれに3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素を加え、3マイクロリットルのラダーと9マイクロリットルのRNaseフリー水を含む20ヌクレオチドラに添加します。0.5 XTBEのアガロースゲルでサンプルを泳動した後、UVボックス上でゲルを評価し、最適なPCRサイクルを特定します。

次に、アガロースゲルライブラリー精製のための大規模PCR反応をセットアップします。PCR増幅後、各PCRチューブから9マイクロリットルを、3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素を含む6本の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。20ヌクレオチドラを準備します。

ラダー、PCRコントロール陰性、および6種類のPCR産物をアガロースゲルにロードし、ゲルを120Vで30分間泳動します。UVボックス上のレーン間のPCRインプリケーションの均一性を確認し、画像を撮影します。3つのPCR反応を2本の1.5ミリリットルのシリコン化マイクロ遠心チューブに組み合わせ、27マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムと950マイクロリットルの100%エタノールを加えます。

チューブを反転させて混合し、一晩で摂氏20度に設定してPCR産物を沈殿させます。このプロトコルを使用して、2つの新鮮凍結腫瘍RNAとそれらに対応する特定のFFPERNA標本との間のマイクロRNA発現相関が確認されました。新鮮凍結マイクロRNAとFFPEマイクロRNAのプロットは、CDNAライブラリー調製物が良好な再現性を提供することを示しています。これは、異なる方法で処理された検体で検出されたマイクロRNAとの間に高い相関関係があるためです。

最適化されたCNDAライブラリー調製プロトコルが、ますます古くなるFFPE検体に適用可能で再現性があるかどうかを判断するために、18年、20年、22年、27年、30年、および35年間アーカイブされたFFPE組織からのマイクロRNA発現プロファイルを取得しました。相関係数は、標本の年齢やライブラリ調製週に関係なく、0.96を超えるままでした。したがって、最適化されたCDNAライブラリー調製プロトコルは、アーカイブ時間に関係なく、FFPE試料の再現性のある分析のための堅牢なツールを提供します。

したがって、このビデオを見た後、small RNAライブラリーを調製する方法と、貴重なパラフィン包埋標本および固定パラフィン包埋標本の完全な微小発現プロファイルを取得する方法についてよく理解できるはずです。