Name: ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶFFPE組織からのマイクロRNAシーケンス用cDNAライブラリ調製法。35年保存された試料からRNAを抽出し、18検体まで同時解析可能なプロトコルでバイオマーカー発見に貢献します。

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博士トーマスされた、RNA の分子生物学の実験室の頭部だけでなく、彼らのサポートのため、彼の実験室および RNAworld パイプラインにアクセスを提供する技術を共有するため彼の研究室のメンバーに感謝いたします。我々 はまた、彼のプロトコルを共有し、彼の最初の手順で使用されているすべての生化学的および酵素の手順に関する詳細な説明を提供するため博士マーカス ・ ハフナーを感謝します。

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

著者らはこの原稿で提示されたデータの一部を含むパブリケーションが Loudigらによって分子科学の国際ジャーナルに掲載されたを開示を希望します。21。

・ ハフナーらによって記述されたプロシージャの変更および最適化されたバージョンは、このプロトコルの FFPE RNA 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS の高再現性と堅牢な cDNA ライブラリの準備のプロトコルを表示します。22
このプロトコルのすべてのステップは、古いアーカイブと侵害された総 RNA FFPE の標本から回復を使用するため最適化されています。FFPE RNA の少量を処理するため、このプロトコルの重要なステップは、18 のユニークな 3' バーコード アダプター個々 を後すべての RNA のサンプル (すなわち, 18 各 100 ng FFPE RNA サンプル) のプールに存在します。この重要なステップは、18 FFPE RNA サンプルを均一に受ける以降すべて生化学的および酵素の手順小さな RNA の cDNA ライブラリーの作製に必要なすることができます。さらに、この手順を最大限に降水を受ける RNA の量とゲル精製小さな RNA 分子のキャリア効果を高める...

Mirna がホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 標本1,2,3非常によく保存されています。前作はこれら短い規制非コード鎖 RNA 分子の式 FFPE サンプルからの総 RNA を使用して正常に評価することができ、元の新鮮なと比較した場合の関連する遺伝子発現データを示しています。組織4,5,6,7,8。大型メッセンジャー RNAs は、批判的に FFPE ティッシュの処理 (ホルムアルデヒド、熱、乾燥、等)、内因性 RNases、miRNAs (~ 18-24 の小型試験片の年齢によって影響を受けることが示されていると比較した場合ヌクレオチド) の低下に耐性とアーカイブされた標本9の高スループット mRNA 研究をアウトパ フォームする miRNA 発現研究により実証するも、長期的なストレージに弾力性のあるようにするが表示されます。各種マイクロ アレイ技術と最も最近 NGS、大抵小規模解析で行われている、アーカイブの臨床検体を用いた miRNA 発現研究がその 1 つを示したまたは定量的 PCR の試金を多重化これらの試金の10、11,12,13,14の最適化後保存 Mirna の発現を評価するために使用します。
MiRNA 発現の調節不全は、さまざまなひと悪性腫瘍の開発に関連付けられている、アーカイブされた標本に注釈を付けることがある潜在的の巨大な供給臨床的に、明らかになるが、これらの小さな RNA分子は、潜在的な癌バイオ マーカー15,16,17,18の有望なソースを表します。NGS などの高速遺伝子発現技術の使用すべての miRNA 議事 PCR および/またはマイクロ アレイ19など対象のテクノロジと比較したときのグローバルな評価を提供することの利点があります。このため、NGS の古いアーカイブされた標本からの Rna の cDNA ライブラリの準備のために最適化された、手頃な価格で、簡単に該当するプロトコル20大規模な回顧的な研究を可能にする最適化を行った。
以前、現代的な商業キット21をアウトパ フォームすることがわかった古いのアーカイブされた標本からの RNA と DNA の別個の回復の同時 RNA/DNA の抽出のプロトコルを設立しました。この抽出のプロトコルを使用すると、時間の延長期間にアーカイブ FFPE 組織からの総 RNA を取得、miRNAs の 35 年間の臨床検体の保存の NGS の cDNA ライブラリの準備を最適化されています。さらに、最近発行された研究はどこ我々 は cDNA ライブラリからその場で臨床的に分類された乳管癌 (DCIS) 標本を作製、示される定量的 PCR によって検証された発現の Mirna がわかりました特定のマイクロ Rna 発現が変化することは、DCIS 乳癌乳癌を発症しない患者から浸潤病変と比較して発症した患者から病変の検出可能性があります。
最適化できない特許/著作権保護されている試薬の使用と同様、商業キット小さな RNA の cDNA ライブラリの準備のため、その中止の可能性のコストを考慮して以前に発行された適応することにしました実験室ベースし、キット無料 3' バーコード cDNA ライブラリ FFPE 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS のプロトコル準備、22のサンプル 18 の同時解析を許可します。このプロトコルは FFPE RNA 試料への適応のために重大だった、外観および技術的な評価のチェックポイントと理想的なステップバイ ステップの手順を提供し、妥協の困難な他の情報源への適用の強い可能性があります。RNA の材料を使用します。元の議定書の適用性 (例えばSYBR 金) 蛍光放射能標識サイズ マーカーを置き換えることによって改善された大きいポリアクリルアミドゲルに結紮図書館の選択時に使用される RNA サイズ マーカーを検出します。最適化されたプロトコルはこの 3' が 18 個々 FFPE RNA 標本にバーコードのアダプターの ligation 依存し、5' アダプター結紮術を受けることに一緒にプール、逆転写とパイロットの PCR 解析合わせた最終的な cDNA の拡大高速シーケンサーの大規模な PCR 増幅、浄化、NGS の前にライブラリ。

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion AM8110G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt はしご</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml ウシ血清アルブミン</td><td></td><td>ΣB8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X チタン Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL 垂直ゲル電気泳動システム ガラス板と櫛</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>シグマ</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ微量遠心分離機 5424R</td><td>米国科学</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>エプンドルフ サーモミキサー</td><td>米国科学</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&trade;シリコン処理された低保持マイクロ遠心チューブ 1.5ml</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>ゲルブレーカーチューブ 0.5ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ゲル電気泳動装置 7cm x10cm- ゲルトレイと櫛付きミニサブセルGT</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge デュアルローター パーソナル遠心分離機</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>モデル V16 ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置、ガラス、櫛、スペーサー</td><td>Ciore ライフサイエンス</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td>IDT</td><td>定義注文</td><td></td>中</tr><tr><td>フクロウ EasyCast B2 ミニ電気泳動システム-ゲルトレイと櫛付き</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素 PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリー水</td><td>アンビオン</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>セーフイメージャー 2.0</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 青色光トランスイルミネーター</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE アガロース</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III reverse transcription kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2切り捨てられた K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>加熱蓋付き</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel システムの濃縮物、希釈剤、および緩衝液</td><td>National診断</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

ホルマリン固定パラフィン包埋 rna 試料を用いた回顧マイクロ rna シーケンス: 相補的な dna ライブラリの準備のプロトコル

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

-アーカイブ、ホルマリン固定を臨床的に分類 (FFPE) 組織のパラフィン包埋は癌の開発の回顧的な分子研究の核酸を提供できます。後で侵襲性疾患を発症した患者から非侵襲や前癌性病変を使用して、遺伝子発現解析は、癌リスクにし向ける初期の分子変化を識別を助けるかもしれない。FFPE 組織から回復した核酸が深刻な物理的な損傷及びその分析が難しく、一般的に適応アッセイ化学修正を受けているも記載されています。マイクロ Rna (Mirna) ただし、少人数のクラスを表す長期保存に耐えるし、FFPE サンプルの解析に成功するまでのみ 〜 18-24 をまたがる RNA 分子のヌクレオチドが示されています。ここで提案する、3' バーコード相補的 DNA (cDNA) ライブラリの準備のプロトコル堅牢かつ再現性の高いアーカイブを使用する場合に示された最近アーカイブされた組織から抽出した低分子 Rna の解析用に最適化されました。35 年間の臨床標本。このライブラリの準備 (18) までの RNA のサンプルを個別 3' バーコード アダプターで結紮、後続の生化学的酵素の準備のため一緒にプールし、侵害された劣化材料の多重解析に適しています分析する前に。すべての浄化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) サイズ固有選択とバーコード小さな RNA 種の濃縮が可能で行われます。この cDNA ライブラリの準備は、次世代シーケンサー (NGS) のための材料の最適な量を生成する特定の増幅サイクルの決定により、パイロットのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 分の RNA 入力によく合わせられる。このアプローチは、最大 35 年間のアーカイブの標本から劣化した FFPE RNA の使用のために最適化された、NGS の再現性の高いデータを提供します。

18 の個々 の FFPE RNA サンプルの合計方法ここで説明したよう (100 各 ng) 3' adenylated バーコード T4 のオリゴヌクレオチド ligation 一晩を受ける個別のチューブでセットアップされました。次の日、酵素反応熱非アクティブ化、結合し、単管に析出します。RNA の餌を再停止し、変性ポリアクリルアミドゲル (ページ) ページのゲルの隣接する井戸で移行 RNA オリゴヌクレオチド サイズ マーカーを使用して、適切なサイズ 3' バーコードを選択する、15% の結紮の RNA 分子を分離低分子 Rna (図 2)。摘出したゲルの部分は結紮の RNA 分子を溶出する NaCl 水溶液を一晩で孵化します。次の日は溶離された RNA の沈殿し、5' アダプター結紮を行います。5' アダプター結紮小さな RNA 分子が、移行し、もう一度移行した RNA サイズ マーカー オリゴヌクレオチドを許可する小さい Rna のサイズ切除 3' バーコード オリゴヌクレオチドと 5' アダプター (...

ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35 歳までをご紹介します。

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

このCDNAライブラリー調製の全体的な目標は、パラフィン包埋組織および固定組織に保存された低分子RNAのシーケンシングを成功させることです。この方法は、パラフィンを正式および固定的に包埋した標本の分析に非常に役立ちます。最大 18 個の検体から RNA を抽出し、これらすべての含有量を分析し、すべての検体についてすべての microRNase のプロファイルを取得します。プロトコールを開始するには、個別に分注した18個のFFPERNAサンプルのそれぞれに、事前に調製したライゲーションマスターミックスの8.5マイクロリットルを追加します。チューブを静かにフリックし、2秒間遠心分離します。遠心分離後、チューブを氷上に保管します。3マイクロリットルのピペットを使用して、各アダプターの1マイクロリットルを、RNAとライゲーションマスターミックスを含む対応するFFPERNAサンプルに移します。ピペットで上下したり、FFPERNAサンプル間でチップを交換したりしないでください。各チューブを閉じ、フリックして混合し、2秒間遠心分離します。チューブを氷の上に置きます。チューブを摂氏90度のヒートブロックに1分間置いて反応を変性させ、すぐに氷の上に置きます。次に、3マイクロリットルのピペットを使用して、希釈したライゲーション酵素1マイクロリットルを18のRNAサンプルのそれぞれに移します。ライゲーションを氷の上に置き、摂氏4度の冷蔵室に置き、18時間の一晩インキュベーションします。チューブを90°Cで1分間ヒートブロックに置き、ライゲーション反応を非アクティブ化した後、少なくとも2分間氷に戻して冷却します。1.2マイクロリットルの沈殿マスターミックスを各チューブに移します。100%エタノールを63マイクロリットル加えます。各チューブを閉じ、チューブをフリックして混合し、2秒間遠心分離します。チューブを氷の上に置きます。18本のチューブすべての内容物を1.5ミリリットルのシリコン処理チューブ1本に混ぜ合わせ、3回反転させて混合します。チューブを2秒間遠心分離し、氷の上に60分間置いて沈殿させます。沈殿後、1.5ミリリットルのチューブをプールしたライゲーションで遠心分離します。次に、1ミリリットルのピペットチップで上澄みを取り除きますが、底に液体を残します。チューブを傾け、20マイクロリットルのピペットを使用して残りの上清を取り除きます。先端が10マイクロリットルのパスツールピペットで上清を真空吸引し、チューブをフリックしてRNAペレットを20マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。20マイクロリットルのPAAゲルローディング溶液を加えて、RNAを再懸濁します。チューブをフリックし、室温で2秒間遠心分離し、チューブを氷の上に置きます。以前に調製したゲル装置の0.5 XTBEを新しい0.5 XTBEと交換し、後者、サイズマーカー、およびライゲーションされたRNaseをゲルの中央にロードし、両側に2つの空のウェルを残します。次に、ゲルを実行します。ゲルを流した後、ガラスプレートの1つを取り外して15%ページのキャストを外します。ガラスプレートの上に置いたゲルに10マイクロリットルの蛍光色素溶液と25ミリリットルの0.5XTBEを軽くスプレーし、暗所で5分間平らに置きます。ゲルを塗布したガラスを青色光トランスイルミネーターに置き、19ヌクレオチドおよび24ヌクレオチドサイズマーカーの両方を定規で整列させて、ライゲーションされた低分子RNAの切除を指示します。次に、ゲルを切除します。切除したゲルを、ゲルスライスを断片化するように設計された0.5ミリリットルのチューブに入れ、1.5ミリリットルのシリコン処理された微量遠心チューブにしっかりと配置します。ゲルをGの16,000倍で室温で3分間遠心分離します。断片化したゲルを300マイクロリットルの400ミリモル塩化ナトリウム溶液で再懸濁します。.チューブを閉じ、パラフィンフィルムで密封します。サーモミキサーで内容物を摂氏4度の冷蔵室で1100RPMで攪拌し、一晩インキュベーションします。翌日、サーモミキサーからチューブを取り出し、1ミリリットルのピペットを使用して溶液を5マイクロメートルのフィルターチューブに移し、1.5ミリリットルのシリコン処理されたRNaseフリーの収集チューブに挿入します。室温でGの2300倍でチューブを3分間遠心分離します。フィルターチューブを廃棄し、ろ過された溶液を含む収集チューブに950マイクロリットルの100%エタノールを加え、チューブを反転させて混合します。チューブを2秒間遠心分離し、氷の上に60分間置きます。次に、RNAペレットを沈殿させます。次に、キャップを開けてRNAペレットを乾燥させ、底に液体を残しながら、1ミリリットルのピペットで上清を慎重に取り除きます。20マイクロリットルのピペットを使用して、ペレットに触れずに残りの上清をすべて取り除きます。チューブを傾けて、残りの溶液がペレットの反対側に移動するようにします。パスツールピペットを使用して上清を吸引し、真空でペレットを乾燥させます。RNAペレットを5.6マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。逆転写試薬を氷上で15分間解凍します。3マイクロリットルの5Xバッファー、4.2マイクロリットルの10Xジオキシヌクレオチド三リン酸(DNTP)、および1.5マイクロリットルのジチオスレイトール(DTT)を添加して、逆転写反応を設定します。チューブを静かにフリックして反応を混合し、2秒間遠心分離して溶液を収集します。反応が摂氏90度のヒートブロックで正確に30秒間行われた後、摂氏50度のサーモミキサーに直接2分間移して温度を均一にします。0.75マイクロリットルの逆転写酵素を溶液に直接加えます。軽くフリックして混合し、チューブを摂氏50度のサーモミキサーにすぐに30分間戻します。30分後、チューブを摂氏95度のヒートブロックに1分間移し、逆転写を停止します。95マイクロリットルのRNaseフリー水を直接逆転写に加えます。チューブをフリックして混ぜ合わせ、氷に直接2分間セットします。パイロットPCR反応を組み立て、サーモサイクラーで2つのPCRサイクルをセットアップします。サーモサイクラーでパイロットPCR反応を設定し、ファイル1を開始します。ファイル1の最後に、20マイクロリットルのピペットを使用して、パイロットPCR反応から得られた12マイクロリットルを、3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素を含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。ピペッティングで上下に動かして混合します。そして、10サイクルとラベルを付けます。パイロットPCRチューブを閉じ、サーモサイクラーでファイル2を開始します。ファイル2の最後に、20マイクロリットルのピペットを使用して、12マイクロリットルの溶液を3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素が入った1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、12サイクルでラベル付けします。上記の手順を繰り返して、PCRサイクル14、16、18、および20のパイロットPCR反応から12マイクロリットルのPCR産物を回収します。次に、12マイクロリットルのPCRアリコートのそれぞれに3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素を加え、3マイクロリットルのラダーと9マイクロリットルのRNaseフリー水を含む20ヌクレオチドラに添加します。0.5 XTBEのアガロースゲルでサンプルを泳動した後、UVボックス上でゲルを評価し、最適なPCRサイクルを特定します。次に、アガロースゲルライブラリー精製のための大規模PCR反応をセットアップします。PCR増幅後、各PCRチューブから9マイクロリットルを、3マイクロリットルの5Xゲルローディング色素を含む6本の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。20ヌクレオチドラを準備します。ラダー、PCRコントロール陰性、および6種類のPCR産物をアガロースゲルにロードし、ゲルを120Vで30分間泳動します。UVボックス上のレーン間のPCRインプリケーションの均一性を確認し、画像を撮影します。3つのPCR反応を2本の1.5ミリリットルのシリコン化マイクロ遠心チューブに組み合わせ、27マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムと950マイクロリットルの100%エタノールを加えます。チューブを反転させて混合し、一晩で摂氏20度に設定してPCR産物を沈殿させます。このプロトコルを使用して、2つの新鮮凍結腫瘍RNAとそれらに対応する特定のFFPERNA標本との間のマイクロRNA発現相関が確認されました。新鮮凍結マイクロRNAとFFPEマイクロRNAのプロットは、CDNAライブラリー調製物が良好な再現性を提供することを示しています。これは、異なる方法で処理された検体で検出されたマイクロRNAとの間に高い相関関係があるためです。最適化されたCNDAライブラリー調製プロトコルが、ますます古くなるFFPE検体に適用可能で再現性があるかどうかを判断するために、18年、20年、22年、27年、30年、および35年間アーカイブされたFFPE組織からのマイクロRNA発現プロファイルを取得しました。相関係数は、標本の年齢やライブラリ調製週に関係なく、0.96を超えるままでした。したがって、最適化されたCDNAライブラリー調製プロトコルは、アーカイブ時間に関係なく、FFPE試料の再現性のある分析のための堅牢なツールを提供します。したがって、このビデオを見た後、small RNAライブラリーを調製する方法と、貴重なパラフィン包埋標本および固定パラフィン包埋標本の完全な微小発現プロファイルを取得する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

この修​​正された抽出プロトコルは、組織病理学的組織ブロックへの関心をより正確に対象地域からのRNAとDNA収量を向上させます。...

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このプロトコルは、大型動物の同定と家畜、野生動物、アプローチをサンプリングからリンパ節の切除の手順を含むリンパ節組織のトランスクリプトームのプロファイルの RNA の隔離のための手順の概要を提供します回収後保存と RNA...

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。...

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

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RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。...

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。...

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

初期マウス胚におけるマイクロRNAのプロファイリング手法について述べます。このプロトコルは、低細胞入力と小さなRNA濃縮の課題を克服します。このアッセイは、初期マウス胚の異なる細胞系統におけるmiRNA発現の経時変化を分析するために使用することができる。...

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

学ぶFFPE組織からのマイクロRNAシーケンス用cDNAライブラリ調製法。35年保存された試料からRNAを抽出し、18検体まで同時解析可能なプロトコルでバイオマーカー発見に貢献します。

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

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