Name: 設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セル ベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ、凍結保存したヒト卵巣組織と設計内皮細胞の共同移植法。フィブリノゲンとトロンビンを用いたフィブリンクロット作成により、血液灌流を加速し、卵胞活性化を促進する細胞ベースの戦略を確立します。

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イラストのオマール ・ アレクサンダーの男。 L.M. は、コーネル大学臨床からパイロット賞によって支えられた、臨床科学センターと、ASRM 研究助成。 著者は、論文の批判的な読みのジェームズ ・ ラボのメンバーに感謝したいと思います。

動物を対象とするすべての手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイル ・ コーネル医科大学によって承認されています。関連するガイドラインは法令に従い卵巣のティッシュを使用してすべての異種移植実験を行った。ひと卵巣組織は、化学療法や放射線治療がん治療や前骨髄移植予定の患者から採取しました。制度上の審査委員会 (IRB) 委員会のワイル ・ コーネル医科大学組織の潜在的な自己使用と彼らの卵巣組織研究用の 10% までの寄付を行った患者のインフォームド コンセントのコレクションを承認しました。
1. ひと卵巣組織のコレクション
注: リモート施設交通から卵巣組織が運ばれるとき時間を超えない 5 h18,19。
<ol><li>卵巣の組織を収集し、溶液を滅菌生理食塩水ですすいでください。</li>
	<li>滅菌コンテナーに卵巣を配置します。</li>
	<li>媒体に完全に没頭して、卵巣までリーボビッツの L-15 媒体を注ぐ。</li>
	<li>閉じ、容器を密封します。</li>
	<li>氷の上のコンテナーを輸送します。</li>
</ol>2. 適応シュミットらから調達した卵巣組織の処理18
<ol><li>
卵巣の処理および凍結のための準備
	<ol>
<li>処理のための媒体の 100 mL の準備: リーボビッツの L-15 中 99 mL + 1 mL 抗生物質抗真菌薬ソリューション。0.2 μ m フィルターを使用してメディアをフィルターします。冷蔵中を保ちます。</li>
		<li>低温保護剤として DMSO を使用して凍結溶液 100 mL を準備します。69.64 mL リーボビッツの L-15 中、17.66 mL ウシ胎児血清 (FBS)、ショ糖 (最終濃度 0.1 mol/L を作成)、3.42 g 10.65 mL (1.5 モル/L の最終濃度を作成する) には、DMSO を追加し、1 mL 抗生物質抗真菌薬ソリューション。150 mL フィルター ユニット、0.2 μ m ストア 4 ° C で媒体を使用してメディアをフィルターします。</li>
		<li>ラップされた固形物の滅菌サイクルのためにプログラム、オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組織の到着
	<ol>
<li>キャビネット、バイオ セーフティにおける滅菌の手術器具を設定: シャープ罰金湾曲ブレード数 21、メスのハサミ、鉗子で様々 なサイズ: ロング (約 150 mm) と中型 2 (約 110 mm)。</li>
		<li>滅菌手袋を着用する、バイオ セーフティ キャビネット内のコンテナーを開きます。卵巣を取ると 150 mm ペトリ皿にそれを置くし、卵巣組織の脱水を防ぐために卵巣の上に 2.1.1 手順で調製した冷たい培地を注ぐ。</li>
		<li>任意の残留組織から卵巣の分離、組織や血液を欠いてまで寒い中それをすすいでください。</li>
		<li>きれいな 150 mm のペトリ皿に卵巣を配置して、風邪を追加中、2.1.1 卵巣が半分で水没するまでのステップで準備されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
卵巣組織の郭清
	<ol>
<li>卵巣を二等分して曲線の良いはさみを使用して、シャープな郭清によって最初に髄質を削除します。滅菌メスを用いたブレード数 21 で延髄をこすり。大脳皮質組織は厚さが 1 〜 1.5 ミリメートルまでの前に。</li>
		<li>幅 2-3 mm の千切りに大脳皮質組織をカット、ストリップの長さは処理された卵巣部分の全体の長さになります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 卵巣組織遅い凍結、ニュートンらから適用しました。オクタイら6,20
<ol><li>
凍結のための準備
	<ol>
<li>クリオバイアル (1.8 mL) のラベルを付けます。</li>
		<li>2.1.2 各バイアルの手順で準備凍結溶液 1.5 mL を追加します。</li>
		<li>凍結溶液極低温バイアルあたり 1 つの皮質ストリップを転送します。</li>
		<li>回転プレート上で 20 分間皮質のストリップを平衡させ、4 ° C で穏やかな攪拌を適用</li>
	</ol>
</li>
	<li>
遅い卵巣組織の凍結
	<ol>
<li>0 ° C から始まるプログラム可能な平面の冷凍庫に、クリオバイアルを読み込む</li>
		<li>-7 ° C に 2 ° C/分でクールな</li>
		<li>10 分のこの一定した温度で組織を維持します。</li>
		<li>綿棒を液体窒素 (LN2) 中に浸漬と各クリオバイアルに触れることにより、氷結晶核形成誘導の手動シードを実行します。</li>
		<li>サンプル温度が-40 ° c. に達するまで 0.3 ° C/分で冷却し続ける</li>
		<li>-140 ° C まで 10 ° C/分の速度で冷却します。</li>
		<li>LN2 のストレージのデュワーにクリオバイアルを転送 (-196 ° C)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 手術 (両側の卵巣と共同移植) のための準備
<ol><li>
プレートの準備
	<ol>
<li>移植卵巣組織を融解前日<ol>
<li>50 mm のペトリ皿の下部にプラスチック パラフィン膜の部分を置き、70% スプレー エタノールそれの完全に覆われているまで。</li>
			<li>一晩を残す、ペトリ皿、バイオ セーフティにおけるキャビネット。マウスあたり 2 枚のペトリ皿を準備します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>手術の日<ol>
<li>シャーレ バイオ セーフティ キャビネット内プラスチック パラフィン フィルムを含むからエタノールを吸引します。</li>
			<li>エタノールが完全に蒸発するまで、ペトリ皿リードは半分開いたままにしておきます。</li>
			<li>プラスチック パラフィン フィルムが完全に乾燥するとき、シャーレの蓋を閉じます。キャビネット、バイオ セーフティ内でそれを保ちます。</li>
			<li>6 ラベル井戸ウェル プレート、0.1 mol/L スクロース + 1 mol/L DMSO、0.1 mol/L スクロース + 0.5 mol/L DMSO、0.1 mol/L 基本的な解凍ソリューション (BTS)、ショ糖培地。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶液の調製
	<ol>
<li>BTS の 100 mL を準備: リーボビッツの L-15 中 79 mL + FBS 20 mL + 抗生物質抗真菌薬液 1 mL。0.22 μ m のフィルター システムをフィルター処理します。</li>
		<li>0.1 mol/L ショ糖と BTS の 10 mL を準備します。ショ糖の 0.342 g をスケールし、BTS ステップ 4.2.1、サッカロースは完全になるまでそっと撹拌機で準備の 10 mL を追加します。シリンジ フィルター 0.22 μ m を使用して、ソリューションをフィルター処理します。</li>
		<li>表 1に従ってソリューションを準備します。アルミ箔で DMSO を含むチューブをカバーします。使用するまで冷蔵しておきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 卵巣組織の急速な融解
<ol><li>LN2の取るデュワー卵巣組織の凍結バイアル含む 30 の部屋の温度でそれを維持と s。</li>
	<li>バイアルをティッシュ ペーパーを使ってきれいに拭いてください。</li>
	<li>まで 1-2 分の 30 ° C の水浴のバイアルを浸しその ' コンテンツを解凍します。</li>
	<li>バイアルを開き、最初の溶液 (0.1 mol/L スクロース + 1 mol/L 4.2.3 準備した DMSO) 3 ml を含む最初の井戸で皮質のストリップを配置します。 注: 層流の下でプレートの蓋を開けるに関連するすべての手順を行います。</li>
	<li>このステップのアルミ箔で 5 分維持プレート カバー 4 ° C で回転皿の上 6 ウェル プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>(0.1 mol/L スクロース + 0.5 mol/L DMSO、4.2.3 準備した) の 2 番目のソリューションの 2 番目も含む 3 mL に皮質のストリップを転送します。</li>
	<li>このステップのアルミ箔を 5 分保持プレート カバーの 4 ° C で穏やかな撹拌のため回転板 6 ウェル プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>4 mL の溶液 (0.1 mol/l ショ糖、4.2.2 準備した BTS) を含む 3 番目の井戸に皮質のストリップを転送します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間の穏やかな撹拌のため回転板上の孵化させなさい。</li>
	<li>ソリューション (BTS、4.2.1 の手順で準備) の 4 番目も含む 4 mL に皮質のストリップを転送します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間の穏やかな撹拌のため回転板上の孵化させなさい。</li>
	<li>最後も含む (2.1.1 の手順で調製した) 冷たい培地 4 mL に皮質のストリップを転送します。氷の融解の卵巣組織を移植を実行するまでしてください。</li>
</ol>6. 卵巣組織のカプセル化
<ol><li>
次の解決策を準備します。
	<ol>
<li>20 ミリ モル/L HEPES 緩衝液 0.9% 生理食塩水中での 25 mL を準備します。フィルターし、4 ° C で保存</li>
		<li>CaCl2 1 mol/L フィルターの濃度での 1 mL を準備し、4 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フィブリノゲン 50 mg/mL のストック溶液を調製します。
	<ol>
<li>37 ° C で数時間にわたって 20 ミリ モル/L HEPES 緩衝液、HEPES にフィブリノゲンをゆっくりと混合することによって 0.9% 生理食塩水 20 mL にフィブリノゲン 1 g 緩衝生理食塩水を追加します。</li>
		<li>1.7 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます。</li>
		<li>0.45 μ m のシリンジ フィルターを通してし、0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。</li>
		<li>200 μ L マイクロ遠心チューブに-20 ° C でストアにソリューションの約数</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トロンビン 100 U/mL の原液を準備します。 注: ガラス、分注にトロンビン ソリューション吸着プラスチック チューブ/バイアルのソリューション。<ol>
<li>トロンビンの 250 U に 0.9% 生理食塩水 2.5 mL を追加します。</li>
		<li>完全に解消するソリューションまで穏やかな揺れ。</li>
		<li>1.7 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます。</li>
		<li>0.2 μ m のシリンジ フィルター、マイクロ遠心チューブ、-80 ° C の店に 50 μ L 分注をフィルター処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
70 μ L、10 mg/mL フィブリノゲンと 5 U/mL トロンビンの最終的な集中を取得のフィブリン血栓を作る 注: 高速に動作することを確認、ソリューションが数秒で凝固します。また、泡の混合物に添加を避けます。<ol>
<li>1.7 mL マイクロ遠心管中のフィブリノーゲン ソリューションを準備します。<ol>
<li>360 を追加 20 ミリ モル/L の μ L HEPES バッファー フィブリノゲン株式の検体 200 μ L に 0.9% 食塩水内 6.2.4 の手順で準備します。</li>
			<li>穏やかなピペッティングで混ぜます。</li>
			<li>氷の上におきます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>番目のマイクロ遠心チューブにトロンビン溶液を準備します。<ol>
<li>トロンビン株式の検体の 50 μ L を DMEM の 148.7 μ L を追加 6.3.4 の手順で準備します。</li>
			<li>穏やかなピペッティングで混ぜます。</li>
			<li>1 mol/l CaCl21.3 μ L を追加します。</li>
			<li>穏やかなピペッティングで混ぜます。</li>
			<li>氷の上におきます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 番目のマイクロ遠心チューブに、単一細胞懸濁液を準備します。<ol>
<li>酵素細胞剥離培地を用いた平板から設計された血管内皮細胞をデタッチします。</li>
			<li>スピン ・ ダウン、カバーガラスと診断を使用してセルをカウントします。</li>
			<li>卵巣組織ごとに 1 mm2あたり 20,000 セルを使用します。Mm2の卵巣組織の 20,000 x 領域を計算します。</li>
			<li>スピン ・ ダウン設計の内皮細胞と再基本培地 (DMEM) 16.8 μ L の容量に到達するために中断します。</li>
			<li>氷の上におきます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>数秒間乾燥滅菌ガーゼ スポンジの卵巣組織片を配置します。</li>
		<li>50 mm のペトリ皿内プラスチック パラフィン フィルム上に卵巣の組織片を配置します。</li>
		<li>6.4.3.4、穏やかなピペッティングによるミックスの手順で作製した細胞懸濁液に 6.4.1.2 の手順で用意して、フィブリノゲン ソリューションの 39.2 μ L を追加します。氷の上におきます。</li>
		<li>6.4.2.4 の手順で、トロンビン溶液の 14 μ L を追加します。一度ピペットで穏やかに混合します。高速に動作します。</li>
		<li>卵巣組織の上に混合物を配置ピペット細長い液滴の形で。</li>
		<li>37 ° C でインキュベーターで血栓にペトリ皿を置く</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 両側の卵巣と NSG マウスに設計された内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植
注: 10 14 週齢女性 NSG マウス21が使用された (ジャクソン研究所)。
<ol><li>2.1.3 の手順で詳しく述べられているのすべての手術器具を準備、縫合糸、パッド、サージカル テープ ハンディがあるかどうかを確認します。</li>
	<li>
イソフルレンで麻酔システムを使用してマウスを麻酔します。
	<ol>
<li>誘導チャンバーにマウスを置き、ふたを閉じ、適切なバルブを開きます。</li>
		<li>オープン流量計、気化器をオンに 1,000 mL/分にし 2-3.5% を提供するように設定します。</li>
		<li>麻酔の効果を確認します。意識、遅いと通常呼吸の損失。</li>
		<li>麻酔を維持するために鼻の円錐形に転送します。バイタル サインによっての 1-3% を提供する気化器をオンにします。</li>
		<li>ペダルまたはテールの反射の有無を確認します。反射が存在する場合は、それは存在しないまで、イソフルランを増やします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気髪トリマーを使用して鎖骨ラインまで尾からマウスの後ろの髪をトリミングします。</li>
	<li>腹臥位手術のプラットフォーム上にマウスを配置します。</li>
	<li>サージカル テープを使用して手術のプラットフォームに鼻の円錐形を修正します。</li>
	<li>1.25 cm wide 手術紙テープを用いた手術のプラットフォームに優しくマウスの手足をテープします。</li>
	<li>無菌潤滑ゼリーを使用し、1.25 cm の穴あきプラスチック サージカル テープを使用して手術のプラットフォームにテーピングで広報修正温度計温度計を挿入します。</li>
	<li>テープ 2.5 cm の広範囲の外科的紙テープを用いた手術のプラットフォームに尻尾。</li>
	<li>熱、赤外線または加熱パッド、お湯を使用し、プロシージャ全体でマウスの体温を監視します。35-37 ° c. の範囲の内で体温を保つ</li>
	<li>滅菌ポビドン ヨード液綿棒スティックとトリム エリアをきれいにし無菌アルコール準備を使用して拭いてください。</li>
	<li>6.9 倍の手順を繰り返します。</li>
	<li>脱水から保護し、角膜にダメージを与えるマウスの目の各滅菌眼潤滑獣医軟膏のドロップを配置します。</li>
	<li>滅菌手術用ドレープを使用してマウスをカバーします。</li>
	<li>ブプレノルフィン (1 mg/Kg 皮下 (S ・ C) を挿入します。</li>
	<li>メス (刃物 #21) を使用して縦内側背側切開を実行します。</li>
	<li>
両側卵巣摘出例を実行、背側アプローチを使用します。
	<ol>
<li>はさみを使って切開して皮下の結合組織を解放します。</li>
		<li>正中を切開して横方向に筋膜をピンチし、鋭いはさみを使用して腹腔内に達する。</li>
		<li>卵巣の脂肪パッドと卵巣をピンセットでそっとつかむ、腹腔内から引き出します。</li>
		<li>血管クランプと卵巣と脂肪パッドを把握します。</li>
		<li>卵巣と卵巣、卵管の遠位の基地で 4/0 のモノフィラメントの吸収性の縫合糸を使用して脂肪パッドを縛る。</li>
		<li>ネクタイの遠位の卵巣をクリップします。切り株の根元から出血がないかどうかを確認します。</li>
		<li>組織を腹腔内に戻し、6/0 の編みこみ吸収性縫合糸を用いた筋膜を縫合します。</li>
		<li>ステージ側で 7.15.1-7.15.7 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共同卵巣組織を移植します。
	<ol>
<li>血栓の大きさに合った長さで大殿の上筋膜の横切開を実行します。筋膜の下にはさみを開くことによってこの仮想空間内でポケットを作成します。</li>
		<li>6.4.8 の手順で準備としてカプセル化された皮質組織の 1 つの作品をピックアップし、このポケットにそれを置きます。</li>
		<li>6/0 を使用した筋膜縫合糸は吸収性縫合糸を編組。</li>
	</ol>
</li>
	<li>側同様に段階 7.16.1-7.16.3 を繰り返します。</li>
	<li>背壁 4/0 のモノフィラメントの吸収性縫合糸で簡単な中断されたステッチを使用してを閉じます。</li>
	<li>リドカインを注入する 0.5% (1.2 mL/Kg) 切開部位で S ・ C。</li>
	<li>滅菌アルコール準備を使用して、皮膚をきれいにします。</li>
	<li>マウスの温度を監視しながら、イソフルランをオフにします。</li>
	<li>O2、イソフルランなしの 1-2 分を提供します。それを開始する移動し、意識に戻るまでマウスを温暖化維持に。</li>
	<li>きれいに回復ケージの中にマウスを置くし、後で手術の傷の完全な治癒まで別々 のケージでマウスの家します。</li>
	<li>術後 24 時間ごとの 8-12 h を必要に応じて、ブプレノルフィン (1 mg/Kg) S/C を挿入します。</li>
	<li>実験の終了点まですべての食料、水、寝具、ケージ、オートクレーブときに、別ケージでマウスを飼うため。加圧換気の部屋にケージをしてください。個人用保護具を使用して、マウスを処理するたびに。</li>
</ol>

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</ol>

マイケル ・ ギンズバーグは、サンディエゴ, CA, 92130、アメリカ合衆国、分離、E4 ORF 1 の標識を用いて内皮細胞サイエンス株式会社医学の従業員です。

ここに示す幹部の共同移植卵巣組織の生存率および機能のマウス異種移植に大きな利点があります。妊孕性温存の卵巣組織自動移植の臨床応用のための標準セットと最適なパラメーター (サイズ、移植サイト、移植等の期間) されていません。32,33,34卵胞のプールの強化された回復の未定義のまま。自動移植を実行すると、解凍の皮質卵巣組織の無血管である移植が残っている卵巣、卵巣窩または広間35,36など骨盤のサイトを中心に実行されます。端々 吻合が行われるしない、ために、この移植法は虚血性の組織の損失の波と人工血管内に存在する卵胞の早期活性化の結果します。したがって、幹部と共同の移植は、臨床応用には検討されてする前に多くのさらなる精査が必要な増殖性の内皮細胞の配信を伴います、このアプローチ復旧される組織血行を促進することができ、移植卵巣...

がんは、先進国の死の主要な原因の中ではまだ数十年の研究のほとんどの種類のがん、およびいくつかの場合 2 倍近く生存率1に向けて大きな進展が得られています。残念ながら、化学療法薬が gonadotoxic、多くの場合卵巣内の原始卵胞のリザーブを破壊し、出生率2を削減です。この人口の増加は卵子や胚の凍結保存を含む妊孕性温存のさまざまな方法の恩恵を受けることができます、ただし、がん治療、思春期前の患者の発生を必要とする患者はこれらのオプションの対象ではありません。代わりに、何人かの患者は彼らの治療を着手する前に、回復と赦し、不妊3を復元する自動移植組織に卵巣組織の凍結保存する選択しました。まだ、日には、着と卵胞出力自動移植まま組織虚血と低酸素5,6、7のために主に、比較的低い4。卵巣皮質移植の生存率を改善するために多くの努力にもかかわらず抗酸化物質8,9, プロ新生サイトカイン10、11,12,1 を使用してください。移植後 5 に 7 日ウィンドウで3、または機械的操作14グラフトの虚血を損なう生存率および移植の7サバイバル。この問題を解決、ホストとグラフト血管の吻合を容易にし、このように卵巣組織の再灌流を早めるために細胞に基づく戦略を開発しました。
移植後ウィンドウ内移植卵巣組織に虚に加えて間卵胞シグナル伝達の混乱プール15,16の枯渇に貢献するかもしれない。外因性血管内皮細胞 (幹部) は、移植片の周囲血管の安定と機能に貢献するため、移植された組織に定義された分子入力を伝えるためにユニークな機会を提示します。原則の証拠として幹部は抗ミュラー管ホルモン (AMH) 卵胞17を制限する示されている変形の成長因子ベータ (TGFβ) スーパーファミリーのメンバーのエクスプレス超生理学的レベルに設計されました。共同管理と AMH 発現細胞移植移植で卵胞の分布の比較生物学的活性および設計された幹部の効力を検証します。
要約すると、卵胞のプールのグラフト生存し、抑制する早期動員の向上このアプローチ増やすことが患者の妊孕性温存の自動移植卵巣組織の生産性。また、ExEC ベースのプラットフォームは、卵胞の発育に関与している分子の調節物質の実験的尋問をできます。

<table><tbody><tr><td>リーボヴィッツ's L-15 中</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Anti-Anti X100</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma</td><td>S 1888</td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン</td><td></td><td>Sigma F 8630</td><td>ウシ血漿</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T 1063</td><td>ヒト血漿</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ΣD</td><td>2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Cell Detachment Medium</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>プラスチックパラフィンフィルム</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm M</td></tr><tr><td>サージカルペーパーテープ 2.5 cm</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>マイクロポア</td></tr><tr><td>サージカルペーパーテープ 1.25 cm</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td>ミクロポア</td></tr><tr><td>穴あきプラスチック サージカルテープ 1.25 cm</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td>トランスポア</td></tr><tr><td>モノフィラメント吸収性縫合</td>糸 <td>Covidien</td><td>UM-203</td><td>Biosyn</td></tr><tr><td>編組吸収性縫合</td>糸 <td>Covidien</td><td>GL-889</td><td>ポリソルブ</td></tr><tr><td>ポビドンヨード 溶液 USP 10%</td><td>Purdue 製品</td><td>67618-153-01</td><td>ベタジン溶液 スワブ スティック</td></tr><tr><td>Cryoviales</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td>CryoTube</td></tr><tr><td>滅菌眼球潤滑剤</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Puralube</td></tr><tr><td>1.7 ml マイクロ遠心チューブ</td><td>デンビル</td><td>C-2172</td><td>エッペンドルフ</td></tr><tr><td>アナストサイアシステム</td><td>VetEquip</td><td>V-1 テーブルトップシステム</td><td></td></tr> 清掃 <tr><td>内皮細胞</td><td>Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td>E4-ORF-1 とトランスフェクトされ、内皮細胞</td></tr><tr><td>を標識 トリクローム染色</td><td>Sigma</td><td>HT15-1kt</td><td>Trichrome Stain (Masson) Kit</td></tr><tr><td>Isolectin</td><td>Invitrogen</td><td>I32450</td><td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&trade; 647 コンジュゲート</td></tr></tbody></table>

設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セル ベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

不妊症は化学療法および/または放射線療法の何人かの患者のための頻繁な副作用、卵子や胚の凍結保存は、オプションではありません。自家の卵巣組織の凍結保存する代わりに、これらの患者数の増加の選択次の回復と赦し。凍結保存した卵巣組織の自動移植を受ける患者の転帰の改善にもかかわらず移植組織の効率的な血行再建術の主要な障害のままです。虚血を軽減し自動移植を受ける患者の転帰を向上させる、卵巣組織の灌流を加速するための血管細胞ベースの戦略を開発しました。マウス異種移植モデルにおける卵巣組織の凍結保存と外因性血管内皮細胞 (幹部) の共同移植法について述べる。私たちは持続的なパラクリン シグナル移植卵巣への入力ができ恒常抗ミュラー管ホルモン (AMH) を表現するために設計されている幹部を採用するこのアプローチを拡張します。幹部と共同移植増加卵胞ボリュームと改良された幽門発育卵胞、AMH を表現する幹部昇格静止原始卵胞の保持。この複合戦略虚血を軽減し、妊孕性温存や大規模で不妊のコンテキストで卵胞活性化を調節することのための便利なツールがあります。

幹部の共同移植が患者の組織にメリットを提供するかどうかを決定するには、解凍卵巣皮質ストリップ サイズの等しい部分に分けられ、免疫妥協された NOD scid ガンマ (NSG) マウスに両側にしみ込んでいます。フィブリン血栓だけで (ない ECs) と含まれている幹部 (図 1 a) に埋め込まれている 1 つの側面で各マウスは独自のコントロールとして提供しています。幹部は、ひと臍帯前述の22,23としてアデノ ウイルス遺伝子のフラグメント、E4 ORF1 とその後の治療からの主な内皮細胞の分離によって得られました。2-5、ひと臍帯静脈 ECs (新生活) の通路内でエンコードの cDNA 発現アデノ ウイルス遺伝子フラグメント E4 ORF1 レンチ ウイルス粒子と扱われました。この治療は生存を強化し、血管内皮細胞の血管新生可能性が22,...

何人かの患者の妊孕性温存のための唯一のオプションは卵巣組織の凍結保存です。残念ながら、遅延の血行再建術は、濾胞性を損ないます。ここでは、共同生物活性分子の直接パラクリン配信と加速を組み合わせたセル ベースの戦略として利用循環内皮細胞とひと卵巣組織を移植するためのプロトコルを提案する.

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

このプロトコルの全体的な目標は、再灌流を促進し、移植片内の卵胞活性化を調節するパラクリン刺激を提供する人工内皮細胞と組み合わせて、凍結保存されたヒト卵巣組織を異種移植することです。この方法は、凍結保存された卵巣組織の移植後の生存率を改善する細胞ベースの手段を提供し、より広くは、ヒトの卵胞形成の分子調節を調べるための堅牢なモデルシステムを確立します。この技術の主な利点は、虚血を軽減し、組織を生着させるための分泌因子の持続的な供給源を提供するために、内皮細胞の単一のビヒクルを使用することです。したがって、この方法は組織の生存率に世界的な利益をもたらします。また、卵胞の発達に関与している分子調節因子についての洞察も提供できます。フィブリンの塊を作るには、迅速に作業し、200マイクロリットルのフィブリノーゲンストック溶液に360マイクロリットルのHEPESバッファーを追加します。チューブを静かにピペットで混ぜて氷の上に保ちます。2番目のマイクロチューブで、148.7マイクロリットルのDMEMを50マイクロリットルのトロンビンストック溶液に加えて、トロンビンワーキング溶液を調製します。やさしくピペットで混ぜます。次に、塩化カルシウム1リットルあたり1.3マイクロリットルの1モルを追加します。ピペットで軽くピペットで混ぜて、サンプルを氷の上に保ちます。酵素細胞剥離培地Accutaseを使用して、事前に調製した人工内皮細胞をプレートから分離し、それらを3本目のマイクロチューブに移します。次に、細胞をスピンダウンします。次に、血球計算盤と蓋付きのガラスを使用して、細胞をカウントします。生着に必要な細胞数を計算するには、定規を使用して寸法を測定することにより、卵巣組織の20, 000倍の面積をミリメートルの二乗に変換します。面積に20, 000を掛けて、生着に必要な細胞の数を決定します。必要なセルをスピンダウンします。また、DMEMを使用してペレットを再懸濁し、総容量16.8マイクロリットルにします。細胞懸濁液を氷上に保ちます。次に、卵巣組織片を滅菌ガーゼスポンジに数秒間置き、乾燥させます。次に、50mmのペトリ皿で事前に調製したプラスチックパラフィンフィルムに組織を移します。調製した細胞懸濁液に39.2マイクロリットルのフィブリノーゲン溶液を加えます。穏やかなピペッティングで混合し、懸濁液を氷の上に保ちます。その後、迅速に作業し、チューブに14マイクロリットルのトロンビン溶液を追加し、一度静かにピペットで混合します。細長い液滴の形に卵巣組織の上に混合物をピペットで移します。ペトリ皿を血栓で摂氏37度でインキュベートします。トロンビン溶液をフィブリノーゲン細胞懸濁液に添加したら、すぐに作業を進めます。手術における将来の準備を同期させることは課題であり、貴重な人体組織を費やす前に練習走行を行うことが賢明かもしれません。10〜14週齢の雌NSGマウスに麻酔をかけ、テキストプロトコルに従って手術の準備をした後、動物を加熱し、手順全体を通して体温を監視します。ポビドンヨウ素スワブスティックで、トリミングされた領域を清掃し、滅菌アルコールを使用して拭き取ります。次に、マウスの各目に滅菌眼潤滑剤獣医軟膏を一滴垂らして、マウスの脱水症状や角膜の損傷から保護します。テキスト プロトコルに従って両側卵巣摘出術を行った後、ブプレノルフィンを皮下に注射します。次に、大殿筋の上の筋膜に、血栓の寸法に適合する長さで水平に切開します。この仮想空間内にポケットを作成するには、鼻隠しの下にあるハサミを開きます。事前に準備したカプセル化された皮質組織を1枚手に取り、ポケットに入れます。次に、6 O編組吸収性縫合糸を使用して筋膜を縫合してから、反対側で共移植を繰り返します。背側壁を4つのOモノフィラメント吸収性縫合糸で閉じます。切開部位にリドカインを皮下注射します。.次に、滅菌アルコール製剤を使用して皮膚を洗浄し、テキストプロトコルに従って術後ケアを実施します。ここで見られるように、E4-ORF1処理したヒト臍帯静脈内皮細胞をNSG雌マウスに両側生着させてから2週間後、GFPから形成された機能灌流血管は、宿主組織と移植片の界面で外因性ECまたはExECを標識しました。ExECは、マウスまたはヒトのExECと共移植された皮質片に卵巣組織と同時移植すると機能的な血管を形成し、対照移植片に比べて生存する卵胞の数を増加させます。この卵胞の発達の増加は、ExEC支援移植片の線維化領域の減少と関連していました。最終的な線維化面積の値は、分析された3つのセクションの平均として、各移植片について計算されました。重要なことに、ヒト包皮線維芽細胞と同時移植された移植片は、組織の生存率が低く、卵胞が比較的少ないことを示しました。生着の14週間後、マウスにメノトロピンを投与した。また、卵胞の成長の進行はMRIでモニタリングしました。発達中の卵胞は、コントロールとExEC支援移植片の両方で認められました。しかし、ExEC支援移植片では、ますます大きなサイズの卵胞が注目されました。同じ患者の組織に由来する胞状卵胞と比較して、より進行した卵胞の顆粒膜細胞層は、排卵マーカーCD44およびHABP1の発現が増加し、細胞死が増加し、増殖が減少しました。このビデオを見れば、凍結保存された卵巣組織とフィブリン血栓の内皮細胞との共移植を行う方法がわかります。そして、一度マスターすれば、このプロトコルを1時間以内に完了することができるはずです。このアプローチに基づいて、内皮細胞は分泌された因子の任意の組み合わせを発現するように操作できるため、生殖能力の保存、卵胞形成、および/または組織移植に関連する可能性のあるシグナル伝達経路の調査が可能になります。

co-transplantation-human-ovarian-tissue-with-engineered-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

自己細胞とテスト生体適合性とチタンの血液接触生体材料をシードする方法について説明する。このメソッドは、ブタ静脈cavaeに外科的に移植後数分以内に接種した内皮前駆細胞およびチタンチューブを、使用しています。この手法は、他の多くの埋め込み型医用機器に適応可能です。...

大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

ここでは、二重播種部分的人工多能性幹細胞がマウスにグラフトするための機能的な組織工学血管移植片を生成するためのプロトコルを提示する（PiPSC）は - 脱細胞化血管足場バイオリアクターに由来内皮細胞 - 平滑筋細胞およびPiPSC由来。...

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

このプロトコルは、少量の成体末梢血からの血液増殖内皮細胞(BOEC)の信頼性の高い生成と特性評価を可能にします。BOECは、血管障害患者の内皮細胞の代用として、また人工多能性幹細胞を作製するための基質として使用することができます。...

ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

私たちは、女性の生殖器官の正常な形質転換上皮の研究に適した卵巣流行パッド移植アッセイを説明します。マウスの脂肪パッドは、大規模な組織片の移植を可能にする手術とイメージングのために簡単にアクセスでき、およびミュラー管由来の組織のための最も有利なネイティブ環境を提供します。...

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。...

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

卵巣がん幹細胞(OCSC)は、がんの開始、再発、治療抵抗性、および転移の原因です。OCSC血管ニッチは、OCSCの自己複製を促進し、化学療法抵抗性につながると考えられています。このプロトコルは、in...

3次元共培養システムNICO-1を用いた卵巣癌幹細胞様細胞の血管遺伝学的特性の評価

我々は、ブタ異所性心臓移植モデルにおける心臓同種移植片全体への治療薬の送達のために、正常温熱 エクスビボ...

心臓同種移植への治療薬の送達のためのブタヘテロトピック心臓移植プロトコル

ここでは、ヒト卵巣組織のニワトリ絨毛膜(CAM)異種移植モデルを開発するためのプロトコルについて説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織の生存率を示します。...

卵巣組織移植を研究するためのツールとしてのひよこ絨毛膜(CAM)モデル

このプロトコルは、初代ヒト卵巣表面上皮(hOSE)細胞からの三次元(3D)組織オルガノイドの確立を説明しています。このプロトコールには、新たに採取した卵巣からのhOSEの単離、hOSEの細胞増殖、凍結保存融解手順、およびオルガノイドの誘導が含まれます。免疫蛍光、定量分析、スクリーニングプラットフォームとしての有用性の紹介が含まれています。...

組織再生研究のプラットフォームとしてのヒト卵巣表面上皮オルガノイド

この論文では、脱細胞化および再細胞化法を使用してバイオエンジニアリングされたマウス肺を作成する方法を説明します。また、その後の同所性肺移植についても詳しく説明しています。...

脱細胞化マウス肺と初代ヒト内皮細胞を用いた生体工学的肺移植

ここでは、カフ技術を使用してマウス頸動脈に組織工学的血管移植片を移植するためのプロトコルが提示され、血管組織再生メカニズムを調査するための適切な動物モデルが提供されます。...

カフ法 による マウス頸動脈への組織改変血管移植片の移植

学ぶ、凍結保存したヒト卵巣組織と設計内皮細胞の共同移植法。フィブリノゲンとトロンビンを用いたフィブリンクロット作成により、血液灌流を加速し、卵胞活性化を促進する細胞ベースの戦略を確立します。

設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セルベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速

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設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セル ベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速

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