成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

私たちのプロトコールは、細胞を有益な特性に改善できるかどうか、関心のある部位に標的を絞ることができるかどうかなど、再生医療の分野における重要な質問に答えることができます。私たちのプロトコルの主な利点は、細胞を非ウイルストランスフェクション法を使用して一過性に遺伝子操作できるため、細胞の特性を保持できるという事実です。Sauterの方法は、間葉系幹細胞など、移植に使用される他の細胞タイプに適用できる造血幹細胞の改変に関する洞察を提供することができます。

プロトコールを開始するには、ヒトリンパ球を温め、中程度に室温で温め、コラゲナーゼBおよびDNaseを解凍します。骨髄(BM)を50ミリリットルの円錐管に集めます。既存の血栓はすべて廃棄します。

その後のフローサイトメトリー解析のために、200マイクロリットルのBMサンプルを採取します。必要になるまで、サンプルを摂氏4度で保存します。次に、10ミリリットルのBMを新しい50ミリリットルの円錐管に移し、6ミリリットルのPBS EDTA、20ミリリットルのヒトリンパ球培地、175マイクロリットルのコラゲナーゼB、および175マイクロリットルのDNaseを追加します。

溶液を穏やかに混合し、シェーカーで室温で30分間インキュベートします。50ミリリットルのチューブに15ミリリットルのヒトリンパ球分離培地を適用し、1, 000倍Gで30秒間遠心分離することにより、50ミリリットルの密度勾配遠心分離チューブをプライミングします。密度勾配遠心分離チューブフィルターの上に希釈したBM35ミリリットルを慎重に重ね、チューブをGの445倍で35分間遠心分離します。

チューブを振らずに遠心分離機からそっと取り外します。フィルターの上の曇った層に直接触れることなく、上部クリア溶液から最大20ミリリットルを慎重に廃棄します。単核細胞(MNC)を含む曇った層を新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移し、PBS EDTAで最終容量50ミリリットルまで充填します。

50ミリリットルの細胞懸濁液の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移すことにより、多国籍企業を数えます。メチレンブルーと3%酢酸を10マイクロリットル加えます。内容物を穏やかに混合し、計数室に10マイクロリットルを塗布します。

多国籍企業の数を計算し、MNC懸濁液をGの300倍で10分間遠心分離します。上清を捨てます。

1×10〜8番目の総セル数の磁気選択を準備するには、MNCを300マイクロリットルのMACSバッファーに慎重に再懸濁します。100マイクロリットルのFCRブロッキング試薬と100マイクロリットルのCD133抗体結合超常磁性鉄デキストラン粒子を添加します。次に、細胞懸濁液を穏やかに混合し、摂氏4度で30分間インキュベートします。

インキュベーション中に細胞懸濁液を2〜3回穏やかに振とうします。インキュベーション後、10細胞×1個あたり2ミリリットルのMACSバッファーを添加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、Gの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。

MACSマグネットホルダーをセットし、MACS永久磁石を取り付けます。MACSカラムを取り付け、その上にプレセパレーションフィルターを取り付けます。最初のMACSカラムとプレセパレーションフィルターをMACSバッファーで平衡化します。

上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液をプレセパレーションフィルターに塗布します。MACSカラムとプレセパレーションフィルターを3回洗浄し、プレセパレーションフィルターを廃棄します。

細胞画分を2番目のMACSカラムに直接溶出します。すぐに最初のMACSカラムを2番目のMACSカラムの上に移し、付属のプランジャーを使用してセル懸濁液をMACSカラムに押し込みます。MACSカラムをMACSバッファーで3回洗浄します。

2番目のMACSカラムにMACSバッファーを添加し、MACSカラムをMACS永久磁石から除去することにより、カラムからセル画分を溶出します。直ちに2本目のMACSカラムをチューブの上に移し、細胞溶液懸濁液をMACSカラムに押し込みます。チューブを遠心分離します。

上清を慎重に捨て、ペレットを100マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。その後のフローサイトメトリー解析のために、1×10〜4番目の細胞のサンプルを採取します。残りの細胞を培地に再懸濁し、トランスフェクションのために24ウェルプレートで4番目の細胞に10倍5回播種します。

細胞を摂氏37度、CO2 5%、O2 20%でインキュベートします。分析には、2つの10マイクロリットルサンプルBMアリコートと、新たに分離されたCD133陽性SCの1つのサンプルを使用します。細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。

10マイクロリットルのFcRブロッキング試薬を追加し、チューブにMACSバッファーを33マイクロリットルの容量まで満たします。抗体をチューブの内側に加えます。すべての抗体を添加したら、チューブの抗体側を振り落とします。

最終容量が50マイクロリットルの溶液を穏やかに混合し、摂氏4度で10分間インキュベートします。1ミリリットルのX赤血球またはRBC溶解バッファーを添加します。懸濁液を穏やかに混合し、溶液を氷上で10分間インキュベートします。

次に、懸濁液を遠心分離します。上清を捨て、得られたペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。フローサイトメトリー測定により、細胞の純度と生存率を評価します。

24ウェルプレートのウェルあたり20ピコモルのMIRを使用します。MIRを5%グルコース溶液で希釈し、最終濃度が0.25%ピコモルMIR/マイクロリットルになるようにします。PEIを等量の5%グルコース溶液で希釈します。

次に、希釈したPEIを希釈したMIRに加え、30秒間ボルテックスします。MIR PEI複合体を室温で30分間インキュベートしながら、磁性ナノ粒子またはMNPを室温の超音波処理水浴中で35キロヘルツで20分間超音波処理します。粒子が懸濁状態にあり、凝集していないことを確認します。

超音波処理したMNPをMIR PEI複合体に加え、溶液を30秒間ボルテックスします。MIR PEI MNP complexesを室温で30分間インキュベートします。MIRNA PEI MNP 複合体を、新たに分離した CD133 陽性 SC を培地中の適切なウェルに直接滴下します。

プレートを前後に揺らして優しく混ぜます。細胞をインキュベートします。トランスフェクションの18時間後、各ウェルの内容物を別々の1.5ミリリットルチューブに回収します。

各ウェルを500マイクロリットルのPBSで1回洗浄し、この細胞懸濁液を同じチューブに移します。次に、細胞をGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。スピン後、上清を捨て、ペレットを100マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。

0.5マイクロリットルのアミン反応性色素を添加して、生細胞と死細胞を区別します。懸濁液を穏やかに混合し、細胞を摂氏4度で10分間インキュベートします。PBSを1ミリリットル加え、細胞を再びGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。

上清を捨て、得られたペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、33マイクロリットルの4%PFAを加え、激しく混合します。フローサイトメトリー測定により、MIRの取り込み効率とトランスフェクションを介した細胞毒性を評価します。プロトコルで概説された方法に従って、フローサイトメトリーは、磁気的に濃縮されたCD133陽性細胞画分が80%より高い生存率および純度をもたらしたと判断しましたここに記載されているトランスフェクション方法は、これらの新たに単離されたヒトCD133陽性SCにおけるMIRの非常に効果的な導入を可能にします。

生細胞の約80%の取り込み効率を備えています。さらに、トランスフェクションの18時間後に明らかな有意な細胞傷害効果は、対照細胞と比較してありません。さらに、トランスフェクション複合体化合物の十分な送達と通常の分布は、構造化照明顕微鏡(SIM)を使用して細胞の細胞質内で観察できます。

この手順に続いて、改変幹細胞のin vivo適用などの他の方法を実行することができます。これにより、動的条件下での実際の生存率と影響を調査することができます。このビデオを見れば、ポリマーおよび磁性ナノ粒子ベースのトランスフェクションを適用して、新たに造血された幹細胞にマイクロRNAを効率的に導入する方法を十分に理解できるはずです。