Name: 成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶ成人骨髄由来CD133+造血幹細胞の非ウイルス磁気ナノ粒子ベース転染法。miRNA導入により細胞特性を保持し再生医療への応用可能性を示す安全な細胞修飾プロトコルです。

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この仕事は、連邦教育省とドイツ研究 (FKZ 0312138A、FKZ 316159)、EU 構造基金 (ESF/IVWM-B34-0030/10 と ESF/IVBM-B35-0010/12) と状態 Mecklenburg 西部の Pomerania、DFG (DA1296/2-1) に支えられ、ドイツ心臓財団 (F/01/12)、(VIP + 00240) BMBF と湿気がある財団。さらに、f. H. と午後は、FORUN プログラムのロストック大学医療センター (889001) でサポートされます。

著者は利益相反を宣言しません。

近年では、CD133+ SCs 有望な細胞集団として登場した SC 基づかせていた療法のいくつかによって証明されるようフェーズ I、II、および III の臨床43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,<sup class="xref"...

CD133+ SCs は再生医療の可能性を有望な異種幹・前駆細胞の人口を表します。CD133 を有効に、造血、血管内皮、筋分化ポテンシャル1,2,3 +の細胞、例えば、差別化による血管新生のプロセスに貢献するには新しく成形容器とプロ新生パラクライン機構4,5,6,7シグナル伝達の活性化。
以上 30 承認された臨床試験 (ClinicalTrails.gov) に示す彼らの高可能性にもかかわらずその治療成績は物議を醸す議論4中です。確かに、SCs の臨床応用は、関心と大規模な初期細胞死5,8,9器官の低保持によって妨げられています。CD133 のエンジニア リング追加+ SCs 事前移植は、これらの課題を克服を助けることができます。
効率的な細胞療法のための 1 つの前提条件を治療関連細胞10の生着を強化する大規模な初期細胞死の減少となります。現在研究が最初 1-2 h、移植細胞型の独立の間に高い脳や心臓など臓器の 90-99% の巨大なセル損失を実証またはアプリケーション ルート11,12,13 、14,15,16,17,18,19,20,21。関心22,23,24,25,26 のサイトに標的細胞に革新的な非侵襲的戦略により、SC は、磁性ナノ粒子 (MNPs) を使用したラベリングと同時に携帯の MRI27と磁性粒子 (MPI) をイメージングを使用して監視できます。生体内で最も効率的な静脈注射23,24,28 後セル指導に優先してローカル投与後に使用されるセルの保持を対象と適用の磁化細胞を研究します。.したがって、私たちのグループには、超常磁性酸化鉄ナノ粒子の29から成る配信システムが設計されています。この手法では、CD133 で+ SCs とひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) をターゲット効率的に、体外30,31の試みによって示されるように。
SC 療法のもう一つのハードルは、影響を受ける組織の敵対的な炎症性環境を初期細胞死32に貢献、移植後です。いくつかの前処理研究に加えて治療関連 miRs のアプリケーションはテスト33;抗アポトーシス miRs体外アポトーシスを阻害させ、体内細胞の生着33正常に実証されています。20-25 のヌクレオチドの構成これらの小さい分子はメッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として重要な役割を果たすし、幹細胞の運命や行動34影響を及ぼします。また、miRs の外因性の導入は望ましくない安定したホストのゲノム34統合を避けてください。
プライマリ SCs に核酸 (NAs) の効率的な導入のため現在試行は組換えウイルス8,35に大抵基づいています。にもかかわらず高いトランスフェクション効率組換えウイルス操作提示ベンチ-ベッドサイド翻訳、例えば、手に負えない遺伝子発現、病原性、免疫原性、および挿入変異35 の主要な障害 ,36。したがって、ポリマー ベースの構成などの非ウイルスの伝達システムの開発にとって重要です。中でもポリエチレンイミン (PEI) は、miRs 細胞取り込みの劣化から保護するために NA 結露などのメリットを提供する有効な配信手段を表し、エンドソームを介して細胞内放出脱出37,38。さらに、ミール PEI 錯体は、臨床試験第39高い生体親和性を示した。したがって、当社の配信システムから成って、ビオチン標識ストレプトアビジン コーティング MNP コア30,31,40行きの分岐 25 kDa プリンスエド ワード島。
本稿では, (i) CD133 の手動分離を記述する包括的なプロトコルを提案する+ SC SC 製品および (ii) の効率的かつ穏やかなトランスフェクション戦略の詳細な特性解析とひと骨髄 (BM) 寄付金から、CD133 の遺伝子工学のための磁気的非ウイルス性ポリマー ベース配信システム+ SCs miRs を使用します。CD133+ SCs 隔離され、人間胸骨 BM 吸引、表面抗体を用いた磁気活性化細胞選別 (MAC) システムを使用して磁気濃縮しました。その後、細胞と細胞の純度によっては、フローサイトメトリー分析されます。ミール/プリンスエド ワード島/MNP 錯体の調製後、CD133+ SCs が transfected。トランスフェクション後 18 h、吸収効率とトランスフェクション SC マーカーの発現と細胞の生存率に与える影響を分析します。また、トランスフェクションの複雑な化合物の細胞内の分布の評価は、4 色ラベルと構造化照明顕微鏡を用いて (SIM) を使用して実行されます。

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid with Methylene Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (クローン: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (クローン: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>560178ローダミン染料;Atto 565 色素をビオチンに結合</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva ソフトウェア 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 抗体結合超常磁性鉄デキストラン粒子;CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>計数室</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3 色素標識前駆体 miR;Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 5 色素 miR ラベリングキット;Cy5色素 ラベル IT miRNA ラベリングキット</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>明るい緑色のタンパク質ラベリングキット;Oregon Green 488 Protein Labeling Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤;Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配遠心分離チューブ;ロイコセップ遠心分離管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACSマグネットホルダー;MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS事前分離フィルター</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 & micro;m</td></tr><tr><td>MACS分離カラム(MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS永久磁石;MACSセパ</td><td>レーターMiltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDFフィルター</td>メル<td>ク</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu;m</td></tr><tr><td>マウスIgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>アミン反応性色素;Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>ヒトリンパ球分離培地;Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>密度: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>CaおよびMg なし</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>分岐; 25 kDa</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>非標識前駆体 miR;Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 除染液;RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ヒトリンパ球培地;ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアム</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトサイトカインサプリメント。StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>無血清造血細胞増殖培地。StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere 常磁性粒子</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0.5 M; pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH超音波水浴</td><td>バンデリン電子</td><td></td><td>超音波公称出力:80 W;超音波周波数:35 kHz</td></tr></tbody></table>

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ rna の転送のためのプロトコル

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

一方、CD133+造血幹細胞 (SCs) は、再生医療の分野で高い可能性を提供するために証明されている、負傷者の組織として観察された大規模な細胞の死亡率への注入後、低定着率が非常につながる制限された治療効果。これらの制限を克服するために我々 は、投与前に適切な細胞工学のための非ウイルス性ベースのプロトコルを確立しようと思う。人間の CD133 の変更+吸収効率と安全性、細胞のターゲットの可能性に関して対処されたマイクロ Rna (ミール) 読み込まれた磁気 polyplexes を利用した SCs を表現します。我々 のプロトコルに依存している、CD133 80-90% の高いミール取り込み率を達成できる+幹細胞特性に影響はありません。さらに、これらの変更されたセルは、磁気ターゲットのオプションを提供しています。我々 は CD133 の修正のため安全かつ非常に効率的な手順をここに記述する+ SCs。幹細胞の治療効果の最適化および磁気共鳴画像 (MRI) を介して投与細胞製品のモニターの標準技術を提供するためにこのアプローチを見込んでいます。

提案するプロトコルは、手動分離とひと骨髄由来 CD133 の磁気濃縮について説明します+ SCs エンジニア リング戦略、体外細胞操作とのための非侵襲的技術としてその後ウイルス独立セルvivo監視ツール。
この 3 つのステップの分離技術は、密度勾配遠心法による事前消化胸骨 BM から多国籍企業の分離を許可しません。その後、CD133+細胞画分は適切な分離技術を使用して磁気濃縮することができます。これにより、CD133 の濃縮+ SCs 生存率とフローサイトメトリー (図 1) によって決定することができます 80% 以上の高純度。以下、要件に一致する SC 製品のみは、さらに実験に使用されました。
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このプロトコルは、CD133 を変更する安全で効率的な手順を示しています+造血幹細胞。提示された非ウイルス性、磁気 polyplex ベースのアプローチ治療幹細胞効果だけでなく磁気共鳴イメージ投射を介して投与細胞製品を監視の最適化のための基礎があります。

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

私たちのプロトコールは、細胞を有益な特性に改善できるかどうか、関心のある部位に標的を絞ることができるかどうかなど、再生医療の分野における重要な質問に答えることができます。私たちのプロトコルの主な利点は、細胞を非ウイルストランスフェクション法を使用して一過性に遺伝子操作できるため、細胞の特性を保持できるという事実です。Sauterの方法は、間葉系幹細胞など、移植に使用される他の細胞タイプに適用できる造血幹細胞の改変に関する洞察を提供することができます。プロトコールを開始するには、ヒトリンパ球を温め、中程度に室温で温め、コラゲナーゼBおよびDNaseを解凍します。骨髄(BM)を50ミリリットルの円錐管に集めます。既存の血栓はすべて廃棄します。その後のフローサイトメトリー解析のために、200マイクロリットルのBMサンプルを採取します。必要になるまで、サンプルを摂氏4度で保存します。次に、10ミリリットルのBMを新しい50ミリリットルの円錐管に移し、6ミリリットルのPBS EDTA、20ミリリットルのヒトリンパ球培地、175マイクロリットルのコラゲナーゼB、および175マイクロリットルのDNaseを追加します。溶液を穏やかに混合し、シェーカーで室温で30分間インキュベートします。50ミリリットルのチューブに15ミリリットルのヒトリンパ球分離培地を適用し、1, 000倍Gで30秒間遠心分離することにより、50ミリリットルの密度勾配遠心分離チューブをプライミングします。密度勾配遠心分離チューブフィルターの上に希釈したBM35ミリリットルを慎重に重ね、チューブをGの445倍で35分間遠心分離します。チューブを振らずに遠心分離機からそっと取り外します。フィルターの上の曇った層に直接触れることなく、上部クリア溶液から最大20ミリリットルを慎重に廃棄します。単核細胞(MNC)を含む曇った層を新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移し、PBS EDTAで最終容量50ミリリットルまで充填します。50ミリリットルの細胞懸濁液の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移すことにより、多国籍企業を数えます。メチレンブルーと3%酢酸を10マイクロリットル加えます。内容物を穏やかに混合し、計数室に10マイクロリットルを塗布します。多国籍企業の数を計算し、MNC懸濁液をGの300倍で10分間遠心分離します。上清を捨てます。1×10〜8番目の総セル数の磁気選択を準備するには、MNCを300マイクロリットルのMACSバッファーに慎重に再懸濁します。100マイクロリットルのFCRブロッキング試薬と100マイクロリットルのCD133抗体結合超常磁性鉄デキストラン粒子を添加します。次に、細胞懸濁液を穏やかに混合し、摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション中に細胞懸濁液を2〜3回穏やかに振とうします。インキュベーション後、10細胞×1個あたり2ミリリットルのMACSバッファーを添加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、Gの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。MACSマグネットホルダーをセットし、MACS永久磁石を取り付けます。MACSカラムを取り付け、その上にプレセパレーションフィルターを取り付けます。最初のMACSカラムとプレセパレーションフィルターをMACSバッファーで平衡化します。上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液をプレセパレーションフィルターに塗布します。MACSカラムとプレセパレーションフィルターを3回洗浄し、プレセパレーションフィルターを廃棄します。細胞画分を2番目のMACSカラムに直接溶出します。すぐに最初のMACSカラムを2番目のMACSカラムの上に移し、付属のプランジャーを使用してセル懸濁液をMACSカラムに押し込みます。MACSカラムをMACSバッファーで3回洗浄します。2番目のMACSカラムにMACSバッファーを添加し、MACSカラムをMACS永久磁石から除去することにより、カラムからセル画分を溶出します。直ちに2本目のMACSカラムをチューブの上に移し、細胞溶液懸濁液をMACSカラムに押し込みます。チューブを遠心分離します。上清を慎重に捨て、ペレットを100マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。その後のフローサイトメトリー解析のために、1×10〜4番目の細胞のサンプルを採取します。残りの細胞を培地に再懸濁し、トランスフェクションのために24ウェルプレートで4番目の細胞に10倍5回播種します。細胞を摂氏37度、CO2 5%、O2 20%でインキュベートします。分析には、2つの10マイクロリットルサンプルBMアリコートと、新たに分離されたCD133陽性SCの1つのサンプルを使用します。細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。10マイクロリットルのFcRブロッキング試薬を追加し、チューブにMACSバッファーを33マイクロリットルの容量まで満たします。抗体をチューブの内側に加えます。すべての抗体を添加したら、チューブの抗体側を振り落とします。最終容量が50マイクロリットルの溶液を穏やかに混合し、摂氏4度で10分間インキュベートします。1ミリリットルのX赤血球またはRBC溶解バッファーを添加します。懸濁液を穏やかに混合し、溶液を氷上で10分間インキュベートします。次に、懸濁液を遠心分離します。上清を捨て、得られたペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。フローサイトメトリー測定により、細胞の純度と生存率を評価します。24ウェルプレートのウェルあたり20ピコモルのMIRを使用します。MIRを5%グルコース溶液で希釈し、最終濃度が0.25%ピコモルMIR/マイクロリットルになるようにします。PEIを等量の5%グルコース溶液で希釈します。次に、希釈したPEIを希釈したMIRに加え、30秒間ボルテックスします。MIR PEI複合体を室温で30分間インキュベートしながら、磁性ナノ粒子またはMNPを室温の超音波処理水浴中で35キロヘルツで20分間超音波処理します。粒子が懸濁状態にあり、凝集していないことを確認します。超音波処理したMNPをMIR PEI複合体に加え、溶液を30秒間ボルテックスします。MIR PEI MNP complexesを室温で30分間インキュベートします。MIRNA PEI MNP 複合体を、新たに分離した CD133 陽性 SC を培地中の適切なウェルに直接滴下します。プレートを前後に揺らして優しく混ぜます。細胞をインキュベートします。トランスフェクションの18時間後、各ウェルの内容物を別々の1.5ミリリットルチューブに回収します。各ウェルを500マイクロリットルのPBSで1回洗浄し、この細胞懸濁液を同じチューブに移します。次に、細胞をGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。スピン後、上清を捨て、ペレットを100マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。0.5マイクロリットルのアミン反応性色素を添加して、生細胞と死細胞を区別します。懸濁液を穏やかに混合し、細胞を摂氏4度で10分間インキュベートします。PBSを1ミリリットル加え、細胞を再びGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、得られたペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、33マイクロリットルの4%PFAを加え、激しく混合します。フローサイトメトリー測定により、MIRの取り込み効率とトランスフェクションを介した細胞毒性を評価します。プロトコルで概説された方法に従って、フローサイトメトリーは、磁気的に濃縮されたCD133陽性細胞画分が80%より高い生存率および純度をもたらしたと判断しましたここに記載されているトランスフェクション方法は、これらの新たに単離されたヒトCD133陽性SCにおけるMIRの非常に効果的な導入を可能にします。生細胞の約80%の取り込み効率を備えています。さらに、トランスフェクションの18時間後に明らかな有意な細胞傷害効果は、対照細胞と比較してありません。さらに、トランスフェクション複合体化合物の十分な送達と通常の分布は、構造化照明顕微鏡(SIM)を使用して細胞の細胞質内で観察できます。この手順に続いて、改変幹細胞のin vivo適用などの他の方法を実行することができます。これにより、動的条件下での実際の生存率と影響を調査することができます。このビデオを見れば、ポリマーおよび磁性ナノ粒子ベースのトランスフェクションを適用して、新たに造血された幹細胞にマイクロRNAを効率的に導入する方法を十分に理解できるはずです。

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学ぶ成人骨髄由来CD133+造血幹細胞の非ウイルス磁気ナノ粒子ベース転染法。miRNA導入により細胞特性を保持し再生医療への応用可能性を示す安全な細胞修飾プロトコルです。

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