CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法
2018年5月25日
ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA を生成するマップします。
CARIP-Seqの全体的な目標は、ゲノムワイドなクロマチン関連RNAを調査することです。ChIP-Seqの目標は、胚性幹細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を全球規模で評価することです。これらの方法は、エピジェネティクスおよび幹細胞分野における重要な疑問に答え、胚性幹細胞におけるゲノム位置転写因子またはエピジェネティックな調節因子結合またはヒストン修飾占有率またはクロマチン関連RNAを特定するのに役立ちます。
これらの技術の主な利点は、クロマチン成分に関連するRNAのゲノムワイドな偏りのない調査と、タンパク質DNA相互作用のグローバルな同定を可能にすることです。これらの方法は、胚性幹細胞の生物学に関する洞察を得ることができますが、他の哺乳類細胞タイプにも適用して、がんの生物学や他のヒトの疾患を研究することができます。胚性幹細胞を採取するには、まずリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。
次に、37°Cに予熱した0.25%トリプシンで細胞を剥離します。トリプシン処理後、10%ウシ胎児血清を添加した予熱したMEF培地に細胞を再懸濁します。次に、円錐管内の細胞に37%ホルムアルデヒドを最終濃度1%まで加え、摂氏37度で8分間インキュベートして細胞を架橋します。
固定反応を停止するには、摂氏4度で予冷した1.25モルのグリシンを最終濃度0.125モルまで追加します。次に、チューブをローテーターに置き、室温で毎分8回転で5分間反転させます。5分後、サンプルを室温で300gで5分間遠心分離します。
遠心分離が終了したら、上清を捨てます。次に、ペレットを事前に冷却したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、サンプルを再度遠心分離します。次に、リン酸緩衝生理食塩水を取り除き、細胞を液体窒素で1分間凍結します。
胚性幹細胞を氷上で解凍したら、ペレットを2.5ミリリットルの超音波処理緩衝液に再懸濁します。転写因子またはエピジェネティック因子を研究するには、細胞ペレットをドデシル硫酸ナトリウムを含まない超音波処理緩衝液に再懸濁します。ヒストン修飾のために、ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液に細胞ペレットを再懸濁します。
次に、クロマチン免疫沈降のために、クロマチンを40%振幅で14〜18サイクル超音波処理し、30秒オンモードと30秒の休止モードにします。タンパク質因子ChIPのクロマチンを可溶化するために、超音波処理緩衝液に28マイクロリットルの10%ドデシル硫酸ナトリウムを補給します。ヒストン修飾のタンパク質因子については、28マイクロリットルのデオキシコール酸ナトリウムと0.28ミリリットルの10%Triton X-100を加えてよく混ぜます。
次に、サンプルを10, 000gで摂氏4度で10分間遠心分離し、クロマチンを事前に透明にします。1.5ミリリットルの低結合チューブに、40マイクロリットルのAまたはG磁気ビーズを追加します。次に、ビーズを600マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ビーズと一緒にチューブを磁石の入ったラックに移し、室温で1分間インキュベートします。
次に、リン酸緩衝生理食塩水を除去し、ビーズを100マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。チューブに2〜4マイクログラムの抗体を加え、ローテーターに40分間、毎分8回転させてインキュベートし、抗体のビーズへの結合を促進します。次に、200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を加えてビーズを洗浄します。
洗浄後、超音波処理したクロマチン抽出物をローテーター上で摂氏4度で一晩インキュベートし、クロマチン結合タンパク質を免疫沈降させます。翌日、ビーズを洗浄し、RIPA緩衝液、RIPA緩衝液と塩、塩化リチウム緩衝液、Tris-EDTA緩衝液とTriton X-100、およびTris-EDTA緩衝液とそれぞれ10分間ローテーター上でインキュベートします。ChIPの架橋を解除するには、ビーズを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに再懸濁します。
次に、10%ドデシル硫酸ナトリウムを3マイクロリットル、プロテイナーゼKの1ミリリットルあたり20ミリグラムを5マイクロリットル加え、ビーズを摂氏65度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、翌日、チューブを数回反転させ、磁気ラックに置いたままにし、上清を新しいチューブに移します。次に、0.5モルの塩化ナトリウムを含む100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを追加して磁気ビーズを洗浄し、2つの上清を組み合わせます。
CARRIPの架橋を解除するには、ビーズを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに再懸濁します。次に、10%ドデシル硫酸ナトリウムを3マイクロリットル、プロテイナーゼKを1ミリリットルあたり20ミリグラムの5マイクロリットルを加え、ビーズを摂氏65度で4〜12時間インキュベートします。再度、チューブを数回反転させ、磁気ラックに置いて、上清を新しいチューブに移します。
次に、0.5モルの塩化ナトリウムを含む100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを追加して磁気ビーズを洗浄し、2つの上清を混合します。最後に、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールを使用して、25〜24:1体積比でRNAサンプルを単離します。次に、DNaseを使用して、クロマチン関連免疫沈降RNAサンプルからDNAを除去します。
次に、10X DNaseバッファーをCARIPサンプルに添加し、最終容量を1X濃度に調整します。次に、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、10.5マイクロリットルのRNAとランダムヘキサマープライマー1ミリリットルあたり3マイクログラムの1マイクロリットルを添加してPCR反応を設定することにより、相補的DNAの最初の鎖を合成します。
二次構造を変性させるには、まずチューブを摂氏65度で5分間インキュベートし、次に氷上で2分間インキュベートします。次に、マスターミックスをPCRチューブに加え、摂氏25度で2分間インキュベートします。次に、上付き文字2のマイクロリットルごとに200ユニットの1マイクロリットルを追加し、サーモサイクラープログラムを実行します。
相補的DNAの2本目の鎖を合成するには、試薬、バッファー、および酵素を添加して氷上で反応を設定します。その後、ボルテックスで試薬を穏やかに混合し、摂氏16度で2時間インキュベートします。DNAが合成された後、PCR精製キットを使用して相補型DNAを精製します。
次に、二本鎖DNAをデフラグし、ウォーターバスソニファイアと1.5ミリリットルチューブを使用して、DNAを250〜500塩基対のサイズに10分×3回または10分×4回共有します。次に、ライブラリを調製し、次世代シーケンシングを実行します。ここでは、胚性幹細胞の位相コントラスト画像を撮影し、幹細胞のコロニーを可視化しました。
このプロトコルでは、細胞の分化を防ぐために、細胞を、有糸分裂的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞の存在下または非存在下で培養しました。次いで、架橋胚性幹細胞クロマチンの超音波処理の効率を可視化するために、超音波処理した二本鎖DNAを2%アガロースゲルにロードした。ゲル画像は、200〜500塩基対の範囲のせん断クロマチンを示しています。
次に、次世代シーケンシングプラットフォームを用いてChIP-Seqライブラリーを作製し、シーケンシングを行い、胚性幹細胞におけるヒストン修飾酵素とヒストン修飾のゲノムワイド占有率を評価しました。カスタムUCSCブラウザビューから、濃縮されたH3K4トリメチル化、H3K4ジメチル化、およびKDM5Bがコア多能性調節遺伝子であるPOU5F1およびHOXCクラスターに表示されます。CARIP-Seq解析は、胚性幹細胞のクロマチン関連RNAを評価するためにも行われました。
カスタムUCSCブラウザビューは、胚性幹細胞におけるH4K20トリメチル化関連RNAおよびH4K20トリメチル化占有率を示しています。CARIP-Seqの結果から、RNAはH4K20トリメチル化と関連しているものの、特定の遺伝子座と相互作用していない可能性があると解釈できます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば4日で習得できます。
このビデオを見れば、CARIP-Seqを使用してクロマチン関連RNAをサーベイする方法や、胚性幹細胞における全球規模でのタンパク質DNA相互作用の同定方法について十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、胚性幹細胞においてグローバルなエピゲノムマップおよびクロマチン結合RNAマップを作成するための、ChIP-SeqおよびCARIP-Seqの実施方法について解説します。これらの手法により、タンパク質とDNAの相互作用の評価およびクロマチン結合RNAの同定が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- エピジェネティクス
- 幹細胞生物学
- ゲノミクス
背景
- ChIP-Seqは、タンパク質とDNAの相互作用をグローバルに評価します。
- CARIP-Seqは、ゲノムワイドにクロマチン結合RNAを調査します。
- これらの手法は、さまざまな哺乳類細胞種に適用可能です。
- これらは、がん生物学やその他のヒト疾患に関する知見を提供します。
研究目的
- 胚性幹細胞におけるグローバルなエピゲノムマップを作成すること。
- 転写因子の結合およびヒストン修飾の占有部位を特定すること。
- 幹細胞におけるクロマチン結合RNAを探索すること。
使用した手法
- タンパク質-DNA相互作用を評価するためのChIP-Seq。
- クロマチン結合RNAを調査するためのCARIP-Seq。
- 次世代シーケンシングのためのライブラリ調製。
- リン酸緩衝生理食塩水を用いた胚性幹細胞の回収。
主要な結果
- 転写因子のゲノム上の位置の特定。
- ヒストン修飾のグローバルマッピング。
- クロマチン結合RNAの役割に関する知見。
- さまざまな疾患研究への応用可能性。
結論
- ChIP-SeqおよびCARIP-Seqは、エピゲノム研究における強力な手法です。
- これらの手法は、胚性幹細胞生物学の理解を深めるのに役立ちます。
- これらの手法は、がんやその他の疾患の研究に応用することが可能です。
よくある質問
産業界への実用的関連性
クロマチン結合RNAおよびタンパク質-DNA相互作用を理解することは、幹細胞ベースの治療薬探索におけるターゲットバリデーションのリスクを低減するために極めて重要です。CARIP-SeqおよびChIP-Seqは、多能性と分化経路に影響を与えるエピジェネティック調節因子および非コードRNA相互作用のゲノムワイドかつ非バイアスなマッピングを可能にします。これらの知見は、疾患関連システムにおけるエピジェネティック状態と機能的な遺伝子発現を関連付けることで、初期探索における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：幹細胞の自己複製および分化を制御する転写およびエピジェネティックネットワークを解析する。
- 科学的価値：主要な遺伝子座におけるヒストン修飾および転写因子の結合を調節する可能性のある、クロマチン結合RNAを特定する。
- 運用的価値：POU5F1などの多能性調節因子におけるタンパク質-DNA相互作用をマッピングすることにより、仮説に基づいたターゲット選定を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：アッセイの標準化に向けた定量的なエピゲノムおよびクロマチン結合RNAマップを生成する。
- 運用上の価値：ハイスループットスクリーニングプラットフォームに適した、再現性のあるゲノムワイドなリードアウトを算出する。
- 運用上の価値：拡張可能なデータ生成に向け、次世代シーケンシングに対応したライブラリ調製ワークフローをサポートする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：細胞種を超えた適用可能性を通じて、クロマチン状態をがんや発達障害における疾患関連パスウェイに結びつける。
- 運用的価値：幹細胞モデルから原代細胞または疾患を持つ哺乳類細胞へのトランスレーショナルな連続性を促進する。
- 戦略的価値：表現型結果のエピジェネティックな駆動因子を明らかにすることで、リスク調整後の推進に関する意思決定に情報を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
CARIP-SeqおよびChIP-Seqは、幹細胞モデルにおける遺伝子発現の機序的な駆動因子を明らかにすることで、リード化合物の同定へとつなげる探索段階のツールとして機能します。
- 探索生物学：標的遺伝子座における転写因子の占有状況およびヒストン修飾パターンをマッピングすることで、メカニズムのリスク低減を支援します。
- スクリーニング：エピゲノムシグネチャーをバイオマーカーとして用いることで、化合物ライブラリーのクロマチン状態による層別化を可能にします。
- 分析：定量的なピークコールおよび濃縮スコアを提供し、リプリケート間での実験条件の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：胚性幹細胞以外の疾患に関連する細胞タイプへのエピゲノムプロファイリングの拡張を可能にします。
- エンタープライズでの再利用：複数の標的バリデーションプロジェクトに適用可能な、標準化されたクロマチンプロファイリングパイプラインを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 直接的なRNA-クロマチン結合マッピングにより、エピジェネティック調節因子の機能におけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値： 標準化された架橋、免疫沈降、およびシーケンシングのワークフローにより、研究室間での再現性を確保する。
- 戦略的価値： ターゲットへの結合を、下流のクロマチンおよび転写への影響に関連付けることで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 疾患モデルにおけるエピジェネティックな調節不全に基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- クロマチン生化学、抗体バリデーション、および次世代シーケンシングライブラリ調製に関する専門知識が必要です。
- ソニケーション装置、磁気ビーズシステム、および定量PCRまたはシーケンシングプラットフォームへのアクセスが必要です。
- 再現性のある免疫沈降を行うためには、固定、洗浄、および溶出条件のチーム間での標準化が不可欠です。
- クロマチンのアクセシビリティが異なる初代細胞や組織サンプルにプロトコルを適用する場合、条件の最適化を検討する必要があります。
- 抗体の特異性とクロマチン断片化効率によって制限され、これらがピーク検出におけるSN比に影響します。
バイオ製薬に関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Crosslinking of Embryonic Stem Cells for ChIP and CARIP
2:29
Chromatin Sonication for ChIP and CARIP
3:48
ChIP and CARIP Process
7:12
Double-stranded cDNA Synthesis for CARIP-Seq
8:53
Use of ChIP-Seq and CARIP-Seq to Study Global Protein-DNA Interactions and Chromatin-Associated RNAs in Embryonic Stem Cells
10:43
Conclusion
