Name: CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶ ChIP-SeqとCARIP-Seqを用いた胚性幹細胞におけるエピゲノム解析とクロマチン結合RNAの同定法。タンパク質-DNA相互作用を網羅的に評価し、幹細胞生物学やがん研究への応用が可能です。

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この仕事は、ウェイン州立大学、バーバラアンカルマノスがん研究所、国立心臓、肺、血液研究所 (1K22HL126842 01A1) B.L.K. に与えられるからの助成金によって支えられました。この作品はウェイン州立大学高パフォーマンス コンピューティング グリッド計算資源の活用 (< https://www.grid.wayne.edu/>)。CARIP Seq データ分析支援ありがとうジジ ロッグマン。
著者の貢献:
B.L.K. は、CARIP Seq 法の考案し設計チップ Seq と CARIP Seq 実験を実施し、シーケンス データを分析した原稿を起草しました。すべての著者を読むし、この原稿の最終バージョンを承認しました。

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

チップ Seq はグローバル蛋白質 DNA の相互作用の場所を評価するための有用な方法 (e.g、トランスクリプション要因/ヒストン/ヒストン修飾酵素と DNA の変更) ES 細胞、新開発の CARIP Seq プロトコルは便利で。クロマチンの成分と Rna のゲノム広い連合を尋問します。チップ Seq は ES 細胞のエピジェネティックな風景や他の細胞型を評価するために使用する基本的なツールです。チップ Seq と CARIP Seq ライブラリの品質、チップ グレード抗体に大きく依存します。チップ PCR、空いている地域を基準にして正のコントロール領域で割増濃縮 ≥ 3 が高品質チップ Seq データ25を生成するための十分なする必要がありますを実行することによって、チップ Seq の抗体の適合性は経験的に決まります。同様に、抗体テストできますその適合性について CARIP Seq の同様の方法でマイナーな修正とチップ Seq のとおり。上記の方法で説明したよう、CARIP プロトコルの RNA IP の手順を次逆転写 PCR は cDNA は、Q RT-PCR 法...

胚性幹 (ES) 細胞の運命決定は、細胞外のシグナルと転写制御因子、ヒストン修飾子、およびヒストンの尾の翻訳後修飾を含むホスト間の通信によって規制されています。これらの相互作用を容易にして 2 つの状態のいずれかにクロマチンの包装: オープンと転写活性状態にあるユークロマチンと異質染色質、コンパクトで一般に transcriptionally であります。トランスクリプション要因 DNA シーケンス固有結合親和性と遺伝子発現の制御に参加するユークロマチン領域のエピジェネティックな修飾子准。チップ Seq1, を含む次世代シーケンシング方法は ES 細胞の自己複製と多能性2,3,4 の基礎ゲノムの転写ネットワークのマッピングに尽力されています。 ,5,6。さらに、RNA immunopreciation RNA 蛋白質の相互作用の次世代シーケンス (Seq-RIP)7評価が続く中 DNA 結合タンパク質が Rna 転写イベント7,を規制すると対話することを示唆します。8,9,10,11,12、いくつかの研究は、クロマチン12、または RNA およびヒストンの修正の世界的な相互作用に関連付けられている Rna のゲノムの局在を検討しました。長い非コード Rna (lncRNAs) は、クロマチン蛋白13,14,15の活動を規制する発見されている Rna の 1 つのクラスです。たとえば、Xist は、女性哺乳類細胞におけるエピジェネティックなリプレッサー16,17の募集を通じて、1 つの X 染色体の不活性化を調節する lncRNA です。しかし、クロマチンに関連付けられている Rna の完全なスペクトルはほとんど知られてないです。ここでは、新しいプロトコル、クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) の次世代シーケンサー (CARIP-Seq)、ライブラリの準備も含めて、ES 細胞のゲノムにクロマチン結合 Rna を識別するために続いてについて述べる次世代シーケンシング、およびヒストンの修正、転写因子やエピジェネティックな修飾子のグローバル占有をマップするチップ Seq。その他 RIP Seq 方法7とは異なり CARIP Seq には、クロマチンに関連付けられている Rna の直接同定架橋と超音波処理の手順が含まれます。一緒に、チップ Seq はゲノム蛋白質 DNA の相互作用を識別するために強力なツールをクロマチンのコンポーネントに関連付けられている Rna CARIP Seq は調査する強力な方法です。

<table><tbody><tr><td>マウス白血病阻害因子(ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 または107 ユニット</td></tr><tr><td>GSK3&β;阻害剤CHIR99021(GSK3i)</td><td>ステムジェント</td><td></td><td>溶媒:DMSO 10mM</td></tr><tr><td>MEK阻害剤PD0325901(MEKi)</td><td>ステムジェント</td><td></td><td>溶媒:DMSO 10mM</td></tr><tr><td>ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、高グルコース</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% ゼラチン溶液</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1.25 M 水溶液</td></tr>溶液中 <tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA))pH 8.0 1X</td><td>品質の生物学的</td><td>351-011-131</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)溶液</td><td>シグマ</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmpleteプロテアーゼ阻害剤</td>カクテル<td>ロシュ</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム溶液(20%)</td><td>高品質の生物学的</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125ソニファイア</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 溶液</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 免疫沈降用</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A 免疫沈降用</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A/Protein G およびマグネットスターターパック</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesisキット</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr;5' exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX アガロースゲル、2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高忠実度 2X マスターミックス、HF バッファー</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ トリメチル-ヒストン H3 (Lys4) - ChIP 検証済み抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒストン H3 (ジメチル K4) 抗体 [Y47] - ChIP グレード (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 平底細胞培養プレート (6 ウェル)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIPグレード(ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquakeローテーター</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeqプラットフォーム</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip seq とチップ seq: クロマチン結合 rna および胚性幹細胞における蛋白質 dna 相互作用を識別する方法

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

胚性幹 (ES) 細胞の自己複製と分化は細胞外シグナルと転写因子やエピジェネティックなレギュレータ叙述遺伝子に影響を及ぼすヒストンの翻訳後修飾の組み込みネットワークによって支配されます。近くの遺伝子の発現状態。RNA は、クロマチン動態と遺伝子発現を調節する様々 な蛋白質と相互作用を示されています。クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) を次世代シーケンサー (CARIP-Seq) 続いて、次世代シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降中のクロマチン蛋白質に関連付けられている Rna を調査する手法ChIP-Seq) ES 細胞におけるグローバル規模でのエピジェネティックな修飾子、転写因子、ヒストン翻訳後修飾の場所をマップする強力なゲノミクス手法です。ここでは、我々 は CARIP Seq とチップ Seq、次世代シーケンス、図書館建設を含む ES 細胞におけるグローバル クロマチン関連 RNA とエピゲノムのマップを生成するを実行する方法を説明します。

私たちは正常にこのチップ Seq プロトコル6を用いた ES 細胞で KDM5B、H3K4me2、H3K4me3 ゲノムワイドなバインディングを尋問しました。ES 細胞はフィーダー無料条件 (図 1) で培養し、前述のように架橋します。超音波処理後チップ Seq プロトコルの 3.2 で説明した実行され 2% の agarose のゲル (図 2) の DNA を実行することによって評価されます。次に、手順 4 で説明したようにチップが行ったし、手順 6 で説明したライブラリの準備を行った。チップ Seq ライブラリは、次世代シーケンシングのプラットフォームで配列されました。代表的なカスタム UCSC ブラウザー ビューでは、濃縮 H3K4me3、H3K4me2、および KDM5B のコア多能性遺伝子POU5F1 (図 3 a)、...

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA を生成するマップします。

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

CARIP-Seqの全体的な目標は、ゲノムワイドなクロマチン関連RNAを調査することです。ChIP-Seqの目標は、胚性幹細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を全球規模で評価することです。これらの方法は、エピジェネティクスおよび幹細胞分野における重要な疑問に答え、胚性幹細胞におけるゲノム位置転写因子またはエピジェネティックな調節因子結合またはヒストン修飾占有率またはクロマチン関連RNAを特定するのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、クロマチン成分に関連するRNAのゲノムワイドな偏りのない調査と、タンパク質DNA相互作用のグローバルな同定を可能にすることです。これらの方法は、胚性幹細胞の生物学に関する洞察を得ることができますが、他の哺乳類細胞タイプにも適用して、がんの生物学や他のヒトの疾患を研究することができます。胚性幹細胞を採取するには、まずリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。次に、37°Cに予熱した0.25%トリプシンで細胞を剥離します。トリプシン処理後、10%ウシ胎児血清を添加した予熱したMEF培地に細胞を再懸濁します。次に、円錐管内の細胞に37%ホルムアルデヒドを最終濃度1%まで加え、摂氏37度で8分間インキュベートして細胞を架橋します。固定反応を停止するには、摂氏4度で予冷した1.25モルのグリシンを最終濃度0.125モルまで追加します。次に、チューブをローテーターに置き、室温で毎分8回転で5分間反転させます。5分後、サンプルを室温で300gで5分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、上清を捨てます。次に、ペレットを事前に冷却したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、サンプルを再度遠心分離します。次に、リン酸緩衝生理食塩水を取り除き、細胞を液体窒素で1分間凍結します。胚性幹細胞を氷上で解凍したら、ペレットを2.5ミリリットルの超音波処理緩衝液に再懸濁します。転写因子またはエピジェネティック因子を研究するには、細胞ペレットをドデシル硫酸ナトリウムを含まない超音波処理緩衝液に再懸濁します。ヒストン修飾のために、ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液に細胞ペレットを再懸濁します。次に、クロマチン免疫沈降のために、クロマチンを40%振幅で14〜18サイクル超音波処理し、30秒オンモードと30秒の休止モードにします。タンパク質因子ChIPのクロマチンを可溶化するために、超音波処理緩衝液に28マイクロリットルの10%ドデシル硫酸ナトリウムを補給します。ヒストン修飾のタンパク質因子については、28マイクロリットルのデオキシコール酸ナトリウムと0.28ミリリットルの10%Triton X-100を加えてよく混ぜます。次に、サンプルを10, 000gで摂氏4度で10分間遠心分離し、クロマチンを事前に透明にします。1.5ミリリットルの低結合チューブに、40マイクロリットルのAまたはG磁気ビーズを追加します。次に、ビーズを600マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ビーズと一緒にチューブを磁石の入ったラックに移し、室温で1分間インキュベートします。次に、リン酸緩衝生理食塩水を除去し、ビーズを100マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。チューブに2〜4マイクログラムの抗体を加え、ローテーターに40分間、毎分8回転させてインキュベートし、抗体のビーズへの結合を促進します。次に、200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を加えてビーズを洗浄します。洗浄後、超音波処理したクロマチン抽出物をローテーター上で摂氏4度で一晩インキュベートし、クロマチン結合タンパク質を免疫沈降させます。翌日、ビーズを洗浄し、RIPA緩衝液、RIPA緩衝液と塩、塩化リチウム緩衝液、Tris-EDTA緩衝液とTriton X-100、およびTris-EDTA緩衝液とそれぞれ10分間ローテーター上でインキュベートします。ChIPの架橋を解除するには、ビーズを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに再懸濁します。次に、10%ドデシル硫酸ナトリウムを3マイクロリットル、プロテイナーゼKの1ミリリットルあたり20ミリグラムを5マイクロリットル加え、ビーズを摂氏65度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、翌日、チューブを数回反転させ、磁気ラックに置いたままにし、上清を新しいチューブに移します。次に、0.5モルの塩化ナトリウムを含む100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを追加して磁気ビーズを洗浄し、2つの上清を組み合わせます。CARRIPの架橋を解除するには、ビーズを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに再懸濁します。次に、10%ドデシル硫酸ナトリウムを3マイクロリットル、プロテイナーゼKを1ミリリットルあたり20ミリグラムの5マイクロリットルを加え、ビーズを摂氏65度で4〜12時間インキュベートします。再度、チューブを数回反転させ、磁気ラックに置いて、上清を新しいチューブに移します。次に、0.5モルの塩化ナトリウムを含む100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを追加して磁気ビーズを洗浄し、2つの上清を混合します。最後に、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールを使用して、25〜24:1体積比でRNAサンプルを単離します。次に、DNaseを使用して、クロマチン関連免疫沈降RNAサンプルからDNAを除去します。次に、10X DNaseバッファーをCARIPサンプルに添加し、最終容量を1X濃度に調整します。次に、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、10.5マイクロリットルのRNAとランダムヘキサマープライマー1ミリリットルあたり3マイクログラムの1マイクロリットルを添加してPCR反応を設定することにより、相補的DNAの最初の鎖を合成します。二次構造を変性させるには、まずチューブを摂氏65度で5分間インキュベートし、次に氷上で2分間インキュベートします。次に、マスターミックスをPCRチューブに加え、摂氏25度で2分間インキュベートします。次に、上付き文字2のマイクロリットルごとに200ユニットの1マイクロリットルを追加し、サーモサイクラープログラムを実行します。相補的DNAの2本目の鎖を合成するには、試薬、バッファー、および酵素を添加して氷上で反応を設定します。その後、ボルテックスで試薬を穏やかに混合し、摂氏16度で2時間インキュベートします。DNAが合成された後、PCR精製キットを使用して相補型DNAを精製します。次に、二本鎖DNAをデフラグし、ウォーターバスソニファイアと1.5ミリリットルチューブを使用して、DNAを250〜500塩基対のサイズに10分×3回または10分×4回共有します。次に、ライブラリを調製し、次世代シーケンシングを実行します。ここでは、胚性幹細胞の位相コントラスト画像を撮影し、幹細胞のコロニーを可視化しました。このプロトコルでは、細胞の分化を防ぐために、細胞を、有糸分裂的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞の存在下または非存在下で培養しました。次いで、架橋胚性幹細胞クロマチンの超音波処理の効率を可視化するために、超音波処理した二本鎖DNAを2%アガロースゲルにロードした。ゲル画像は、200〜500塩基対の範囲のせん断クロマチンを示しています。次に、次世代シーケンシングプラットフォームを用いてChIP-Seqライブラリーを作製し、シーケンシングを行い、胚性幹細胞におけるヒストン修飾酵素とヒストン修飾のゲノムワイド占有率を評価しました。カスタムUCSCブラウザビューから、濃縮されたH3K4トリメチル化、H3K4ジメチル化、およびKDM5Bがコア多能性調節遺伝子であるPOU5F1およびHOXCクラスターに表示されます。CARIP-Seq解析は、胚性幹細胞のクロマチン関連RNAを評価するためにも行われました。カスタムUCSCブラウザビューは、胚性幹細胞におけるH4K20トリメチル化関連RNAおよびH4K20トリメチル化占有率を示しています。CARIP-Seqの結果から、RNAはH4K20トリメチル化と関連しているものの、特定の遺伝子座と相互作用していない可能性があると解釈できます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば4日で習得できます。このビデオを見れば、CARIP-Seqを使用してクロマチン関連RNAをサーベイする方法や、胚性幹細胞における全球規模でのタンパク質DNA相互作用の同定方法について十分に理解できるはずです。

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。...

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq)...

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

このプロトコルは、初期のエンハンサー転写産物を定量化するための合理化された計算パイプラインを提供します。クロマチンアクセシビリティ、クロマチン特徴、転写データを統合することで、複雑な遺伝子内領域におけるエンハンサー活性の正確な検出と鎖特異的分析を可能にし、広範なバイオインフォマティクスのトレーニングを受けなくても研究者がアクセスできるようにします。...

マウス胚性幹細胞における遺伝子間/遺伝子内エンハンサーRNA定量のための計算パイプライン

ここでは、RNA関連のクロマチンDNA-DNA相互作用をキャプチャし、RNA関連の三次元ゲノム組織をマッピングするプロトコルを提示します。...

RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法

LNNa-タンパク質の直接的な相互作用を特定するためのUVベースのChIRP法。...

LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

学ぶ ChIP-SeqとCARIP-Seqを用いた胚性幹細胞におけるエピゲノム解析とクロマチン結合RNAの同定法。タンパク質-DNA相互作用を網羅的に評価し、幹細胞生物学やがん研究への応用が可能です。

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

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