Name: オーリスの挙筋哺乳類の神経筋伝達電圧クランプ条件下での試験のための準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶマウスのオーリス長挙筋（LAL）の分離法と神経筋接合部でのシナプス電流記録法。電圧クランプ条件下での微小終板電位と終板電流の測定により、神経伝達機構と筋興奮性の関係を詳細に解析できます。

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著者が明らかに何もありません。

準備および神経筋伝達電流または電圧クランプ条件下での測定のためマウス ラル筋肉の使用は、ここで説明。ラルを解剖するために考慮すべきいくつかの重要なポイントがあります。電極と電極串刺しの刑で筋肉エイズから過剰な結合組織のクリーニングは結合組織串刺しの刑にそれらを配置する場合ことができます暗礁。しかし、離れて撮影することができます結合組織を削除簡単に筋肉の損傷の可能性を制限します。神経の分離を実行して、それは非常にデリケートなので注意してください。神経の損傷を避けるためには、皿に神経を確保するため、ピンを配置できる神経の端に接続されている周囲の組織の一部を残すことをお勧めします。また、神経刺激装置を配置するときに、神経を粉砕しないように注意してください。最後に、電極が光ファイバーに刺し、順序は重要です。鈍電極は、自由に動けなく容易ではないと、まず刺しする必要があります。鋭い電極が最初に留められていた場合、鈍の電極は、ファイバーから出てくる鋭い電極をおそれ、膜を貫くそれ前に筋線維を押し下げる可能性が。これは繊維に不要な膜の損傷を原因となる鋭い電極と 2 回目を突き刺す必要なります。また、こと使用されているアンプを同時に計測電流と電圧電流通過電...

シナプス機能を検査するためのエクセレント モデルの動的神経や骨格筋のシステム関係に洞察力を提供するいますと、神経筋接合部のシナプス伝達を勉強します。オーリスの挙筋(ラル) は薄い筋肉、神経筋接合簡単に可視化することを可能にします。以前のレポートは、シナプスの薬物や毒素を調べるとラル1,2の骨格筋線維型の特性を特徴とした、ラルを使用しての利便性を説明しています。数多くの研究は、神経筋生理学3,4,5,6,7、8を調べる、ラルを使用しています。電気生理学、簡単にラルの神経筋接合部を観察する能力を運動終板に電極を正確に配置可能し、シナプス伝達を記録容量クランプの問題が大幅に減少します。電流クランプ記録膜時定数 (τm) 入力抵抗 (Rで) などの筋膜特性が容易に得られます。さらに、これらのプロパティは、同じの筋線維が筋膜特性にシナプス機能の直接比較を可能にする、神経筋伝達を記録するために使用から測定できます。これらのデータ分析は、多くの神経筋疾患と変更されたアクティビティの状態の物理的なメカニズムに重要な洞察を提供できます。
ここで説明する手法の重要な側面は、クランプ電圧の非線形電流クランプで検出された対象ではない、筋膜特性の独立してシナプスの録音用です。神経筋伝達を調べる現在のクランプではなく電圧クランプを使用する利点は、1950 年代の9での努力を開拓によって設立されました。電流クランプの下で 10-15 mV の振幅を超えるエップスは mEPP 振幅9の線形製品ではありません。たとえば、平均 mEPP は 1 mV、5 の EPP mV 5 mEPPs (5 の QC); の製品といえます一方、40 の EPP mV 以上 40 mEPPs の製品になります。この非直線性大きいエップスでは、膜電位と平衡電位のアセチルコリン受容体の違いは、EPP の原動力 (~-10 mV)、大きいエップスの間に大幅に減少します。電圧クランプ実験中に筋膜電位が変化しないために、この問題は電圧クランプ実験で避けます。欠点は、電圧クランプ実験電流クランプ記録よりも完了までに技術的により困難なことです。これを念頭において、マクラクランとマーティンは、エップス10電流クランプ記録の非線形性の簡単な数学的な補正を開発しました。修正は11,12,13をうまくが、重要なは、筋膜特性が乱れていないと仮定します。
筋膜特性、特に条件または筋肉を混乱させる病気の状態を勉強して場合を考慮する重要です。たとえば、ハンチントン病の R6/2 トランスジェニック モデルからの骨格筋は、安静時塩化カリウム電流14,15で進歩的な減少による脱です。結果として、mEPPs、エップスは R6/2 骨格筋で増幅されます。確かに、付加的な要因は、mEPPs とエップスを変更できます。変更は SNARE タンパク質8に関連しているように見えたエップス、ハンチントン病マウス (R6/1) の別のモデルで動作します。変更された神経筋伝達を引き起こすメカニズムを評価するためには、電圧クランプを使用して変更された筋膜特性の影響を除去するために有益となります。最近の研究では、ここで説明する手法を使用して両方の電流と電圧クランプ条件下で R6/2 神経筋伝達を調べた。モーターの常数全体だった電圧クランプと少ない 1% 誤差より終板16の長さの定数内で 2 つの電極を配置することによってそれはその電圧クランプと R6/2 筋の神経筋伝達の対照的な測定値が得られた電流クランプ レコードを修正.これは筋膜プロパティが変更された場合、非線形性のエップスを修正することができないことを強調表示し、筋膜特性の独立した電圧クランプ記録を得ることの利点を示しています。ここに提示されたプロトコルは、条件またはシナプスとシナプス後膜の特性に影響を与える病気の状態を調べることに最適です。

<table><tbody><tr><td>オリンパスの複合顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10倍対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40倍対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>シャッター機器</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>サンタバーバラインスツルメンツグループ</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9パルス発電機</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイソフレックス 刺激アイソレーター</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 データ収集・解析ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>同心円バイポーラ電極</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>ボールジョイントマニピュレーター</td><td>成茂&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非金属シリンジ 34ゲージ</td><td>ワールド精密機器</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>ニコン実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>5号鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>2号機 鉗子</td><td>ロボズ</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>マイクロダイセクションはさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 刺激装置</td><td>グラスメディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モデル P-1000 マイクロピペット プーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 低ノイズデータ分析システム</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローパスベッセルフィルター</td><td>ワーナーインストゥルメントコーポレーション</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>左利き用マイクロマニピュレーター</td><td>シスキユー</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>右利き用マイクロマニピュレーター</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>シングルモーション</td><td>コントローラーSiskiyou株式会社</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>クロスローラーマイクロマニピュレーター</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>これは、左利き用と右利き用のマイクロマニピュレータのZ軸に追加され、z軸を電動化できるようになりました。このカスタムセットアップは、4軸電動マイクロマニピュレーターを購入するよりも安価でかさばりません。また、1つのコントローラーで両方のマイクロマニピュレーターを制御することができます</td></tr><tr><td>すべての化学物質はフィッシャーから注文されましたが、</td>BTS Toronto Research Chemicals B315190 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes Molecular Probes</td><td></td>は<td>もはや会社ではありません。現在、フィッシャーを通じて注文</td></tr></tbody></table>されています

オーリスの挙筋哺乳類の神経筋伝達電圧クランプ条件下での試験のための準備

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

このプロトコルは、電流クランプとクランプ電圧条件下で神経筋接合部からレコードのシナプス伝達に手法を説明します。オーリスの挙筋(ラル) の前のヴィヴォ準備は、薄い筋肉の運動神経終板に電極を串刺し神経筋接合部の簡単な可視化を提供するために使用されます。このメソッドは、運動終板の膜特性と同様に自発ミニチュア終板電位と電流 (mEPPs と mEPCs)、神経誘発神経終板電位と電流 (エップスおよび Epc) の録音できます。このメソッドから得られた結果を含める素量 (QC)、小胞リリース サイト (n) の数、小胞の放出 (prel)、シナプス促通、うつ病と筋膜時定数 (τ の確率m) 入力抵抗とします。このテクニックの人間の病気のマウス ・ モデルへの適用は、病気の状態でキーの病態を強調表示し、新規治療戦略の特定できます。完全に電圧遮断単一シナプス、によってこのメソッドは、シナプス伝達の現在利用可能な最も詳細な分析の 1 つを提供します。

図 8は、12 週齢野生型 R6/2 マウスから電流パルス (図 8 a) と電流クランプの下の 1 つのラール繊維から電圧応答 (図 8 b) の例を示します。MEPPs の存在は、これらのレコードに運動終板から撮影されたことを示します。レコードは、通常の生理食塩液で得られました。これらの電流クランプのレコードは、その繊維16,19,20Rでτmを決定する分析できます。
EPC とクランプ電圧条件下で得られた 2 つの mEPCs の代表的な録音...

本稿で説明されたプロトコルは、神経筋接合部で自然を記録するマウス挙オーリス長(ラル) 筋とシナプス後電位の神経誘発 (電流クランプ) と電流 (電圧クランプ) を使用します。この手法の使用は、正常と病気の条件の下でのシナプス伝達のメカニズムに重要な洞察を提供できます。

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

この手順の全体的な目標は、神経筋接合部でのシナプス電流を記録するために、長耳挙筋とその神経を分離することです。この方法は、エンドプレートの電流サイズ、量的含有量、放出の確率、神経伝達と筋肉興奮性との関係など、シナプス生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一のシナプスからの詳細な電気生理学的記録を生細胞の光学実験と容易に組み合わせることができることです。この方法は、シナプス機能と神経と筋肉の間のフィードバックコミュニケーションに関する洞察を提供しますが、ショウジョウバエから哺乳類まで、他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、哺乳類の神経筋の準備、特に神経が壊れやすいため、苦労します。その後の電圧クランプ・データを慎重に取得し、解釈することも困難な場合があります。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了します。手順を実演するのは、私の研究室のSteve Burkeです。この手順を開始するには、実体解剖顕微鏡の下で、肩甲骨のレベルでマウスの背面の皮膚に小さな切開を行います。マイクロダイセクションハサミを使用してください。頭と背中の上の皮膚を切ります。次に、肩甲骨近くの切開部に沿って皮膚を引き上げます。LALより劣っている筋肉を右肩甲骨から切ります。次に、切断した組織を正中線のすぐ右側にそっと持ち上げます。ハサミの刃を頭蓋骨に押し付けて左耳に向かって切り込みを入れ、左LALより劣っている筋肉のいくつかの層を取り除きます。外耳道を包み込むLALを神経支配する神経を切断し、耳の内側の筋肉に入ることは避けてください。できるだけ多くの神経を付着させたまま、外耳道を切断し続けます。次に、耳の腹側部分に沿って外耳道の後ろの脂肪組織を切断します。右側で行われる手順と同様に左肩甲骨に沿って切断し、マウスから筋肉を完全に取り除きます。次に、耳の軟骨部分をLALに付着させたまま、付け根に沿って耳の耳介を切り取ります。下側が上を向くように筋肉を反転させます。LAL筋を分離するには、LALと周囲の組織をシリコンエラストマーの底部を備えたシャーレに入れ、解剖した組織を下部に固定します。生理食塩水で組織を頻繁に洗浄します。次に、外耳道に昆虫ピンを通して、プレップを所定の位置に保持します。小さなピンを使用して、LALの正中線の反対側に残りの組織を固定します。鉗子のペアを使用してください。耳の外側部分の皮膚をそっと引き上げて筋肉を伸ばし、皮膚に小さなピンを通します。ティッシュが皿にしっかりと固定されるまで、この手順を繰り返します。LALを覆っている筋肉と、結合組織を介してLALに結合している筋肉を取り除き、正中線近くで特に緊張している筋肉を取り除きます。続いて、上にある筋肉層を引き上げ、ブレードを引っ張られる筋肉層に向

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。...

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します...

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

ザリガニの脚のオープナーの筋肉は、筋肉の表現型、シナプス生理学と可塑性におけるその歴史的重要性と実験的な汎用性のために提示されます。...

ザリガニ開閉筋肉のNMJにおいて歴史的なビューと生理学のデモンストレーション

我々は、挙筋オーリス筋（LAL）若い成体マウスの筋肉にムスカリン性シグナル伝達の阻害剤の反復投与のためとwholemountsにおける神経筋接合部のその後の免疫染色（NMJs）するための手順を説明します。...

皮下ムスカリン拮抗薬の管理およびマウスにおける挙筋オーリスの筋筋のトリプル免疫染色

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。...

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ...

神経筋接合部機能を測定

軸索興奮性のテクニックは、病態と不可逆的な変性イベントの前に生体の変化を調べるための強力なツールを提供します。この原稿は、麻酔下ラットの尺骨神経のこれらのテクニックの使用方法を示します。...

生体内で軸索興奮性のテストでラットの尺骨神経の電気生理学的測定

プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。...

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

ここでは、頭蓋長耳挙筋 (LAL) の in vivo...

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

動的クランプ電気生理学は、ニューロンの発火障害とイオンチャネル機能障害との間の因果関係を確立できます。マウス小脳プルキンエニューロンにおける動的クランプ法とプロトコルについて説明し、有用なリソースと技術的考慮事項に注目します。代表的な研究では、モデル化されたナトリウムコンダクタンスを Tsc1-/-...

自閉症に関連するニューロンの興奮性障害を調査するための動的クランプ法

学ぶマウスのオーリス長挙筋（LAL）の分離法と神経筋接合部でのシナプス電流記録法。電圧クランプ条件下での微小終板電位と終板電流の測定により、神経伝達機構と筋興奮性の関係を詳細に解析できます。

オーリスの挙筋哺乳類の神経筋伝達電圧クランプ条件下での試験のための準備

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