二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

この実験の全体的な目標は、特定のニューロンのレーザーアブレーションが回路の活動と動作に及ぼす影響をテストすることです。この実験手法により、振る舞いの根底にある回路におけるニューロンの必要性を調べることができます。この方法は、獲物がどのように知覚され、獲物が捕らえられた行動が神経活動によってどのように生成されるかなど、行動科学および神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、これらのニューロンの遺伝的標識とレーザーの高い空間分解能により、ニューロンを特異的に切除できることです。幼虫を育て、テキストプロトコルに従って2%低融点アガロースにマウントした後、アガロースに埋め込まれた幼虫を2光子レーザー走査型顕微鏡の下に置き、顕微鏡システムを開始します。画像取得ソフトウェアを開き、[レーザー]タブの下にある[オン]ボタンをクリックしてレーザーをオンにします。

レーザーのステータスがビジーからロックモードに変わるのを待ちます。[チャンネル]タブで、レーザーの波長をEGFPアブレーションの場合は880ナノメートル、GCaMPアブレーションの場合は800ナノメートルに設定します。レンズリボルバーを手動で動かして、20X主観レンズを選択します。

次に、「ロケート」タブをクリックし、「GFP」をクリックして光路を変更し、蛍光を目で直接観察します。ゼブラフィッシュの幼生の脳を視野の中央に配置し、[取得]タブをクリックして2光子顕微鏡に戻り、レーザー出力とゲインを設定します。アブレーション前の状態の記録として、[Z スタック]をクリックして[Z スタック]オプションを選択します。

次に、幼虫の脳の腹側端に焦点を合わせた後、最初に設定ボタンをクリックして下限を設定し、脳の最も背側の表面に焦点を合わせた後、最後に設定ボタンをクリックして上限を設定します。最後に、実験の開始ボタンをクリックして、Zスタック画像取得を実行します。次に、レンズリボルバーを手動で動かして63X主観レンズを選択します。

次に、「locate」タブをクリックして落射蛍光顕微鏡に切り替えます。アブレーションする細胞を目視で中央に配置し、取得タブをクリックしてレーザー走査型顕微鏡に戻ります。取得モードタブで、フレームサイズを256 x 256に設定します。

「ライブ」をクリックして、目的のニューロンを観察します。次に、最も背側から始めて、アブレーションする細胞が焦点を合わせている焦点面を見つけます。regions 関数を使用すると、各ニューロンの直径の細胞サイズの約 1/3 の小さな円形領域を ROI としてマークします。

スキャン速度を 256 x 256 ピクセルあたり 13.9 秒に設定します。これは、レーザー滞留時間がピクセルあたり約 200 マイクロ秒/ピクセルまたはハーフ ミクロンあたり 200 マイクロ秒に相当します。また、反復サイクルを 4 回の繰り返しに設定します。[実験の開始] をクリックして、時系列関数と漂白関数を実行します。

アブレーション前の画像とアブレーション後の画像を時系列サイクルで比較し、標的細胞の蛍光が消えていることを確認します。次に、焦点面を少し深く動かし、アブレーションされていない細胞が現れる次の焦点面を選択します。先ほど示したように漂白機能を実行し、目的の神経構造内のすべての細胞がアブレーションされるまでこのプロセスを繰り返します。

アブレーション後、細胞が消失した蛍光を確認し、必要に応じてレーザー照射を繰り返します。照射後、幼虫を回収する必要があります。幼虫の周りのアガロースに小さな垂直な切り込みを慎重に作ります。

次に、麻酔薬が切れたときに魚が自然にアガロースから泳ぎ出すのを待ちます。ゾウリムシを培養し、テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュの幼生を麻酔した後、幼虫を2%低融点のアガロースに入れ、アガロースの表面がわずかに凸状に見えるように余分なアガロースをすぐに取り除きます。解剖針を使用して、幼虫を直立位置に素早く向けます。

次に、サージカルナイフを使用して、アガロースにいくつかの小さな切り込みを入れて、ゼブラフィッシュの頭の周りのアガロースを取り除き、ゾウリムシが泳ぐためのスペースを作ります。チャンバーにシステム水を静かに注いで、残留アガロースを慎重に取り除きます。次に、記録室にゾウリムシを1つ入れて、視覚刺激として働きます。

次に、科学用CMOSカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡の下に記録チャンバーを置き、2.5倍の対物レンズを選択します。搭載カメラの画像取得アプリケーションを起動します。[シーケンスペイン]をクリックし、ペインでハードディスクレコードを選択します。

スキャン設定セクションで、フレーム数を900またはその他の必要な合計フレーム数に設定します。キャプチャ ウィンドウで、露出時間を 30 ミリ秒に設定し、ビニングを 2 x 2 に設定します。キャプチャ ペインの [live] をクリックして、カメラ ビューとフォーカスで幼虫を特定し、[Stop live] をクリックして [start] ボタンをクリックします。

ムービーをcxd形式で保存し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。行動記録システムを設定し、テキストプロトコルに従って幼虫を記録チャンバーに入れた後、マイクロピペットを使用して50匹のゾウリムシを採取し、記録チャンバーに入れます。記録チャンバーの上にカバースリップを置くには、記録チャンバーの水面に置く前に、カバースリップに小さな水滴を置き、チャンバー内に空気が入らないようにします。

記録チャンバーを照明システムに配置します。次に、毎秒10フレームでタイムラプス録画を11分間開始します。最後に、テキストプロトコルに従って解析を実行します。

この実験では、前蓋領域の核と嗅球ニューロンの亜集団を標識するGal4ラインを使用しています。前蓋ニューロンは両側にレーザーアブレーションされました。嗅覚ニューロンをコントロールとしてアブレーションした。

結果は、2つの光子レーザーが、隣接する神経突起に影響を与えずに標的細胞を切除できることを示しています。この実験では、軸索をILH同側に投影する前置ニューロンの機能的結合性を調査しました。pretectumとILHの両方が、獲物の近位存在下でニューロン活動を示し、両方のニューロン活動が視覚的に駆動されていることを示唆しています。

カルシウムイメージングは、前蓋ニューロンアブレーション幼虫のpretectumおよびILHのニューロン活動を観察するためにも使用されました。レーザーアブレーションされた左プレテクタムは、ニューロン活動が残存しないか、まったくないことを示しました。さらに、同側ILHは劇的に変位したニューロン活動を示し、ILHへの主要な入力が同側前蓋から来ていることを示唆しています。

対照的に、レーザーアブレーションされたプレテクタムの反対側のILHは、同側のプレテクタムのニューロン活動に匹敵するニューロン活動を示し、これは右のILHが右プレテクタムから入力を受け取っていることを示唆しています。一度習得すると、ゼブラフィッシュの幼生1匹につき約1時間でレーザーアブレーションを行うことができます。この手順を試みるときは、レーザーによる熱損傷を避けるために、適切なレーザー照射で標的ニューロンのみをアブレーションすることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、前脳や後脳などの他の脳領域のニューロンのアブレーションを実行して、これらのニューロンが認知機能や運動機能にどのように関与しているかなどの追加の質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、行動神経科学の分野の研究者がゼブラフィッシュモデルの機能神経回路を探求する道を開きました。このビデオを見た後、ゼブラフィッシュの幼生の脳のニューロンを特異的にレーザーアブレーションする方法と、機能的および行動的影響を評価する方法について十分に理解できるはずです。

レーザーでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に製造元の指示に従っていることを忘れないでください。