Name: 二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ幼虫における二光子レーザーによるニューロンアブレーション法。遺伝的標識と高解像度イメージングを用いて、神経回路活動と捕食行動の関係を解析する技術を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

これらの研究は、文部科学省、日本学術振興会科研費助成番号 JP25290009、JP25650120、JP17K07494、および JP17H05984 から受け取った補助金によって賄われました。

<ol><li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+whole+picture%3A+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li>
<li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li>
<li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li>
<li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li>
<li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li>
<li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence%3A+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86(2013).</li>
<li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015(2016).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li>
<li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878(2014).</li>
<li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit%27s+Functional+Adaptations+for+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li>
<li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li>
<li>Ewert, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642675027">Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029(2017).</li>
<li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>National BioResource Project Paramecium. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en">http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-%2C+neuroD+%28nrd%29-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

著者はレポートに利害の対立があります。

2 光子レーザーには、具体的には個々 のニューロンをアブレーションする優れた空間分解能がありますが、偉大な用心は、暑さで脳組織上の任意の不要な損傷を避けるために取られるべき。アブレーションの実験で最も重要なステップは、レーザー照射の最適な量を決定することです。不十分な照射は、ニューロンを殺すために失敗します。あまりにも多くの照射、熱損傷周囲の組織は、望ましくない効果になります。レーザー照射 (ROIs、イテレーション、およびスキャン速度の数の領域) の最適の範囲が狭いようです。アブレーションの効率に影響を与えるいくつかの要因。
最初に、異なる蛍光レポーター蛋白質を使用することによりアブレーション条件は各記者の最適化が必要です。GCaMP 式は、核を欠いて細胞で観察されます。対照的に、GCaMP と比較して、標的細胞の効率的かつ特定のアブレーションのために有利かもしれない細胞内で蛍光が表示されます。GCaMP の使用は、レーザー蒸散 GCaMP を表現する細胞は減少蛍光強度 EGFP を用いてアブレーションのときとは対照的に、即時の大規模な Ca 流入により増加した蛍光強度を表わすこ...

動作が脳の神経細胞の活動から発生する方法を理解するには、行動の生成に関与している神経回路を識別するために必要です。幼虫の段階で、ゼブラフィッシュは、理想的な動物モデル小さく、透明な脳の広範な領域での携帯電話の解像度で神経細胞の活動を調査することが可能になるため、動作に関連付けられている脳機能を勉強して、1の動作を観察しながら脳。特定のニューロンの神経活動のイメージングは、GCaMP2など遺伝的コード化カルシウム (Ca) 指標 (GECIs) の発明によって可能にしました。GCaMP トランスジェニックゼブラフィッシュ行動動物3Ca イメージングを行うことにより、機能的な神経回路動作を関連付けるために有用であると証明しました。
Ca イメージングは、神経活動と行動間の相関関係を示すことが、一方の抑制神経細胞の活動と行動にその consequence(s) をテストは、因果関係を示す、重要な手順です。これを達成するためにさまざまな方法があります: 特定の神経回路4、特定のニューロン5,6ハロロドプシン7などの光遺伝学的ツールの使用で神経毒の発現を変化させる遺伝子の突然変異の使用と対象となるニューロン8,9のレーザーアブレーションします。レーザーアブレーションは比較的少数の特定のニューロンの活動を排除することに特に適しています。神経細胞を殺すことによって神経細胞の活動の不可逆的な除去を促進する行動の結果を評価します。
ゼブラフィッシュの幼虫の段階で観察することができます 1 つの興味深い現象は、獲物のキャプチャ (図 1A) です。この視覚誘導、目的指向行動視力10、視覚運動変換11,12,13視知覚と認識の研究のため有利な実験システムを提供します。オブジェクト14,15,16,17,18, および意思決定19。どのように獲物は神経行動学20の中心的な質問をされている行動をキャッチ捕食者と獲物の検出が獲物につながる方法によって認識されます。本稿で我々 は、pretectum の核の投射によって形成される pretecto 視床下部の回路の役割に焦点を当てる (核 pretectalis 浅パルス大、以下、単に、pretectum として有名)、または喘鳴症に。獲物捕獲活動を減らす visual 獲物知覚21に関連付けられているまたは喘鳴症で神経活動を廃止し、pretectum のレーザー ・ アブレーションを示した。ここでは、実行するプロトコル レーザー アブレーションと幼虫のとおりゼブラフィッシュの Ca2 +イメージングと行動記録を使用してその効果をテストします。

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG アガロース</td><td>ロンザ</td><td>Cat.#50080</td><td>低融点アガロース</td></tr><tr><td>6cmシャーレ</td><td>FALCON</td><td>製品#:351007</td><td></td></tr><tr><td>解剖針</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat.No. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>2光子レーザー走査型顕微鏡</td></tr><tr><td>W プランアポクロマート 63倍/1.0</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>63倍対物レンズ</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>落射蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>共焦点顕微鏡用画像取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>セキュアシールハイブリダイゼーションチャンバーガスケット、8チャンバー、直径9mm×深さ0.8mm</td><td>分子プローブカタログ</td><td># S-24732</td><td>Caイメージングの記録チャンバーとして使用</td></tr><tr><td>イメージングチャンバー</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell イメージングチャンバー PCI-A-2.5</td><td>行動記録チャンバーとして使用</td></tr><tr><td>外科用ナイフ</td><td>MANI</td><td>眼科用ナイフ MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>浜松ホトニクス</td><td>機種:C11440-22CU</td><td>科学用CMOSカメラ</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>浜松ホトニクス</td><td></td><td>画像音響ソフトウェア</td></tr><tr><td>ハードディスク録画モジュール</td><td>浜松ホトニクス</td><td></td><td>動画ファイルをハードディスクドライブに短時間で保存できるソフトウェアモジュール</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>オリンパス</td><td></td><td>ステレオスコープ</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>オリンパス</td><td></td><td>SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3</td>用対物レンズ Visio <td>FLIR Systems, Inc.</td><td>品番GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOSカメラ</td></tr><tr><td>XIMEA xiQカメラ</td><td>XIMEA</td><td>品番MQ042RG-CM</td><td>CMOSカメラ</td></tr><tr><td>リングLEDライト</td><td>CCS</td><td>モデル:LDR2-100SW2-LA</td><td>白色LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ32&micro;m</td><td>東京スクリーン</td><td>N-No.380T</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ ナイロンメッシュ13&micro;m</td><td>東京スクリーン</td><td>N-No.508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>メタルサーチ 150μm開口</td><td>東京スクリーン</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>メタルシーブ 75μm開口</td><td>東京スクリーン</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>エビオス</td><td>朝日食品ヘルスケア株式会社</td><td></td><td>ドライビール酵母</td></tr><tr><td></td><td>LabVIEW National Instruments</td><td></td><td>an integrated development development environment for programming</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>2光子レーザー&nbsp;</td></tr></tbody></table>

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

動作における神経細胞の亜集団の役割を識別するためには、生きている動物の活動をブロックの結果をテストするのには不可欠です。レーザーアブレーションのニューロンは、神経細胞が選択的に蛍光プローブ付けこの目的のための効果的な方法です。現在の研究では、2 光子励起顕微鏡を使用して、その機能と行動の結果のテストは神経細胞の亜集団をアブレーション レーザーのプロトコルを説明します。本研究ではゼブラフィッシュ幼虫で獲物のキャプチャ動作は研究モデルとして使用されます。Pretecto 視床下部の回路動作をキャッチこの視覚的に駆動される獲物の根底に知られています。ゼブラフィッシュ pretectum レーザー蒸散、視床下部 (または喘鳴症; pretectal 投影のターゲット) の下の葉の神経活動を調べた。Pretectal アブレーション後獲物キャプチャ動作もテストされました。

特定のニューロンは EGFP と式は Gal4 行で運転された GCaMP6s 遺伝子標識しました。Gal4 ライン gSAIzGFFM119B は、pretectal エリア (大浅 pretectal 核)、および嗅球神経細胞の亜集団の核をラベルに使用されました。別の Gal4 ライン、hspGFFDMC76A、だった、または喘鳴症に使用されます。私たちレーザーアブレーション pretectal ニューロン両側 (図 2左) もゼブラフィッシュ幼生 Gal4 ライン gSAIzGFFM119B のコントロール (図 2右パネル) として両側嗅球のニューロンをアブレーションとします。UAS:EGFP レポーター魚と交配されました。結果は、2 光子レーザーは、隣接する細胞や神経突起の影響 (図 2B</stron...

ここでは、ゼブラフィッシュ幼虫からの 2 光子レーザーによる神経細胞の遺伝的標識個体をアブレーションするプロトコルを提案する.

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

この実験の全体的な目標は、特定のニューロンのレーザーアブレーションが回路の活動と動作に及ぼす影響をテストすることです。この実験手法により、振る舞いの根底にある回路におけるニューロンの必要性を調べることができます。この方法は、獲物がどのように知覚され、獲物が捕らえられた行動が神経活動によってどのように生成されるかなど、行動科学および神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、これらのニューロンの遺伝的標識とレーザーの高い空間分解能により、ニューロンを特異的に切除できることです。幼虫を育て、テキストプロトコルに従って2%低融点アガロースにマウントした後、アガロースに埋め込まれた幼虫を2光子レーザー走査型顕微鏡の下に置き、顕微鏡システムを開始します。画像取得ソフトウェアを開き、[レーザー]タブの下にある[オン]ボタンをクリックしてレーザーをオンにします。レーザーのステータスがビジーからロックモードに変わるのを待ちます。[チャンネル]タブで、レーザーの波長をEGFPアブレーションの場合は880ナノメートル、GCaMPアブレーションの場合は800ナノメートルに設定します。レンズリボルバーを手動で動かして、20X主観レンズを選択します。次に、「ロケート」タブをクリックし、「GFP」をクリックして光路を変更し、蛍光を目で直接観察します。ゼブラフィッシュの幼生の脳を視野の中央に配置し、[取得]タブをクリックして2光子顕微鏡に戻り、レーザー出力とゲインを設定します。アブレーション前の状態の記録として、[Z スタック]をクリックして[Z スタック]オプションを選択します。次に、幼虫の脳の腹側端に焦点を合わせた後、最初に設定ボタンをクリックして下限を設定し、脳の最も背側の表面に焦点を合わせた後、最後に設定ボタンをクリックして上限を設定します。最後に、実験の開始ボタンをクリックして、Zスタック画像取得を実行します。次に、レンズリボルバーを手動で動かして63X主観レンズを選択します。次に、「locate」タブをクリックして落射蛍光顕微鏡に切り替えます。アブレーションする細胞を目視で中央に配置し、取得タブをクリックしてレーザー走査型顕微鏡に戻ります。取得モードタブで、フレームサイズを256 x 256に設定します。「ライブ」をクリックして、目的のニューロンを観察します。次に、最も背側から始めて、アブレーションする細胞が焦点を合わせている焦点面を見つけます。regions 関数を使用すると、各ニューロンの直径の細胞サイズの約 1/3 の小さな円形領域を ROI としてマークします。スキャン速度を 256 x 256 ピクセルあたり 13.9 秒に設定します。これは、レーザー滞留時間がピクセルあたり約 200 マイクロ秒/ピクセルまたはハーフ ミクロンあたり 200 マイクロ秒に相当します。また、反復サイクルを 4 回の繰り返しに設定します。[実験の開始] をクリックして、時系列関数と漂白関数を実行します。アブレーション前の画像とアブレーション後の画像を時系列サイクルで比較し、標的細胞の蛍光が消えていることを確認します。次に、焦点面を少し深く動かし、アブレーションされていない細胞が現れる次の焦点面を選択します。先ほど示したように漂白機能を実行し、目的の神経構造内のすべての細胞がアブレーションされるまでこのプロセスを繰り返します。アブレーション後、細胞が消失した蛍光を確認し、必要に応じてレーザー照射を繰り返します。照射後、幼虫を回収する必要があります。幼虫の周りのアガロースに小さな垂直な切り込みを慎重に作ります。次に、麻酔薬が切れたときに魚が自然にアガロースから泳ぎ出すのを待ちます。ゾウリムシを培養し、テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュの幼生を麻酔した後、幼虫を2%低融点のアガロースに入れ、アガロースの表面がわずかに凸状に見えるように余分なアガロースをすぐに取り除きます。解剖針を使用して、幼虫を直立位置に素早く向けます。次に、サージカルナイフを使用して、アガロースにいくつかの小さな切り込みを入れて、ゼブラフィッシュの頭の周りのアガロースを取り除き、ゾウリムシが泳ぐためのスペースを作ります。チャンバーにシステム水を静かに注いで、残留アガロースを慎重に取り除きます。次に、記録室にゾウリムシを1つ入れて、視覚刺激として働きます。次に、科学用CMOSカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡の下に記録チャンバーを置き、2.5倍の対物レンズを選択します。搭載カメラの画像取得アプリケーションを起動します。[シーケンスペイン]をクリックし、ペインでハードディスクレコードを選択します。スキャン設定セクションで、フレーム数を900またはその他の必要な合計フレーム数に設定します。キャプチャ ウィンドウで、露出時間を 30 ミリ秒に設定し、ビニングを 2 x 2 に設定します。キャプチャ ペインの [live] をクリックして、カメラ ビューとフォーカスで幼虫を特定し、[Stop live] をクリックして [start] ボタンをクリックします。ムービーをcxd形式で保存し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。行動記録システムを設定し、テキストプロトコルに従って幼虫を記録チャンバーに入れた後、マイクロピペットを使用して50匹のゾウリムシを採取し、記録チャンバーに入れます。記録チャンバーの上にカバースリップを置くには、記録チャンバーの水面に置く前に、カバースリップに小さな水滴を置き、チャンバー内に空気が入らないようにします。記録チャンバーを照明システムに配置します。次に、毎秒10フレームでタイムラプス録画を11分間開始します。最後に、テキストプロトコルに従って解析を実行します。この実験では、前蓋領域の核と嗅球ニューロンの亜集団を標識するGal4ラインを使用しています。前蓋ニューロンは両側にレーザーアブレーションされました。嗅覚ニューロンをコントロールとしてアブレーションした。結果は、2つの光子レーザーが、隣接する神経突起に影響を与えずに標的細胞を切除できることを示しています。この実験では、軸索をILH同側に投影する前置ニューロンの機能的結合性を調査しました。pretectumとILHの両方が、獲物の近位存在下でニューロン活動を示し、両方のニューロン活動が視覚的に駆動されていることを示唆しています。カルシウムイメージングは、前蓋ニューロンアブレーション幼虫のpretectumおよびILHのニューロン活動を観察するためにも使用されました。レーザーアブレーションされた左プレテクタムは、ニューロン活動が残存しないか、まったくないことを示しました。さらに、同側ILHは劇的に変位したニューロン活動を示し、ILHへの主要な入力が同側前蓋から来ていることを示唆しています。対照的に、レーザーアブレーションされたプレテクタムの反対側のILHは、同側のプレテクタムのニューロン活動に匹敵するニューロン活動を示し、これは右のILHが右プレテクタムから入力を受け取っていることを示唆しています。一度習得すると、ゼブラフィッシュの幼生1匹につき約1時間でレーザーアブレーションを行うことができます。この手順を試みるときは、レーザーによる熱損傷を避けるために、適切なレーザー照射で標的ニューロンのみをアブレーションすることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、前脳や後脳などの他の脳領域のニューロンのアブレーションを実行して、これらのニューロンが認知機能や運動機能にどのように関与しているかなどの追加の質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、行動神経科学の分野の研究者がゼブラフィッシュモデルの機能神経回路を探求する道を開きました。このビデオを見た後、ゼブラフィッシュの幼生の脳のニューロンを特異的にレーザーアブレーションする方法と、機能的および行動的影響を評価する方法について十分に理解できるはずです。レーザーでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に製造元の指示に従っていることを忘れないでください。

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。...

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

このビデオでは、獲物捕獲アッセイについて説明しています。このビデオでは、特定のニューロンをレーザーアブレーションした後のゼブラフィッシュの幼生の獲物捕獲行動を研究する方法について説明しています。...

Prey Capture Assay:ゼブラフィッシュ幼生の獲物捕獲行動を研究する方法

このビデオでは、2光子レーザー軸切開術を使用してゼブラフィッシュの胚の軸索を損傷し、損傷からの軸索の回復を観察する方法を説明しています。...

2光子レーザー軸索切開術:ゼブラフィッシュ胚の軸索を損傷し、軸索の回復を観察する方法

このビデオでは、蛍光カルシウム指示複合体を発現するニューロンを用いたカルシウム指示薬ベースの蛍光イメージングを使用して、トランスジェニックゼブラフィッシュの幼生における視覚的な獲物検出を研究する方法を示します。...

トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発神経活動の解析

出典: Morsch, M.,  et.al., 従来のUVレーザー共焦点顕微鏡法による細胞ストレスと死のトリガー. J. Vis. Exp. (2017)...

共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生における選択的単一ニューロンレーザーアブレーション

出典:武藤、A.、他.ゼブラフィッシュ幼生におけるカルシウムイメージングと行動記録を用いた2光子レーザーを用いた神経集団のアブレーションとその評価 J. Vis. Exp. (2018) }このビデオでは、...

ゼブラフィッシュララバにおける2光子顕微鏡を用いた標的ニューロンアブレーション

末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。...

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

レーザーアブレーションは、生物系の再生を研究するための広く応用できる技術です。提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ横線で神経間細胞を再生するレーザーアブレーションとその後のタイムラプスイメージングのための標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡の使用を記述する。...

ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ

ここでは、成体のゼブラフィッシュの背側前脳で2光子カルシウムイメージングを行うためのプロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュ成魚の行動性における前脳活動の2光子カルシウムイメージング

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション...

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

ここでは、共焦点顕微鏡を用いて、GCaMPカルシウム指標を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの脳領域における神経活動を調べるための詳細なプロトコルを紹介します。...

インビボ 部分的に拘束されたゼブラフィッシュ幼魚における感覚刺激により誘発される神経活動の共焦点蛍光イメージング

学ぶ ゼブラフィッシュ幼虫における二光子レーザーによるニューロンアブレーション法。遺伝的標識と高解像度イメージングを用いて、神経回路活動と捕食行動の関係を解析する技術を習得できます。

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウムイメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

さらに動画を探す

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

さらに動画を探す

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウムイメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション