Name: 回転楕円体、コロニー形成アッセイとゼブラフィッシュ異種移植片による抗癌性クマリン OT48 の生物活性の臨床評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ 3D培養とゼブラフィッシュ異種移植を用いた抗癌性クマリンOT48の評価法。A549細胞のコロニー形成アッセイとin vivoモデルで薬理効果を検証し、創薬研究における化合物スクリーニングの信頼性を向上させる。

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ソウル大学での研究、腫瘍微小環境グローバル コア研究センター (画する) 助成、[許可番号 2011 0030001]; 韓国の MEST 国立研究財団 (NRF) によってサポートされてソウル国立大学研究助成、頭脳韓国 (bk 21) プログラム プラス。

1. コロニー形成アッセイ
<ol><li>20,000 セル/cm2 RPMI1640 の 15 mL の濃度で培養 A549 細胞 10 添加培養液中の細胞 %fbs (ウシ胎児血清)、37 ° C、5% CO2で CO2インキュベーターで 75 cm2フラスコで 1% の抗生物質。</li>
	<li>実験の日、診断を使用して、セルの濃度を決定します。1.5 mL 遠心チューブに 7 分間 400 × gで遠心分離によって 50,000 の細胞を収集し、再 1 x 滅菌 PBS (リン酸緩衝生理食塩水) 1.5 mL チューブの 100 μ L のセルを中断します。</li>
	<li>15 mL チューブ、multipipette の半固体セルロース ベースの中型 (MCBM) の 1.1 mL を調剤します。条件ごとに 1 つの管を準備します。</li>
	<li>1.1 mL MCBM P200 ピペットを使用してに FBS の 110 μ L を追加します。</li>
	<li>種細胞 1,000 セル/mL。原液 (100 μ L の 1x PBS で 50,000 セル) から細胞懸濁液の 2.4 μ L を収集 P2 マイクロ ピペットを使用して、10% を添加した MCBM 1.1 mL を加える FBS。</li>
	<li>セルを追加した後渦 MCBM と細胞をよく混ぜるために最高速度で垂直方向にそれらを保持している 1 分の管。</li>
	<li>試験化合物 (A1210477 と OT48 単独または組み合わせ) を追加します。コントロールとしての別々 のチューブの準備使用される溶媒のため (ここでジメチルスルホキシド (DMSO))。化合物や条件ごとに追加ボリュームの濃度に応じて溶剤コントロール テスト混合物の希釈液の溶媒によって引き起こされる副作用を評価するために使用される溶剤の最高濃度が含まれます。</li>
	<li>1分間ボルテックス チューブ。</li>
	<li>それぞれの試金のため 12 ウェルの細胞培養プレートのセンターに P1000 ピペットとの混合物の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>空井戸 1 ml の滅菌水または湿度を安定させるために 1x PBS で塗りつぶします。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 10 日間の培養皿を孵化させなさい。</li>
	<li>培養 10 日後を最終濃度 1 mg/mL に到達する各ウェル MTT (methylthiazolyldiphenyl テトラゾリウム ブロマイド) 貯蔵液 (5 mg/mL) 200 μ L を追加します。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 10 分間インキュベートします。実行可能なコロニーになる紫。</li>
	<li>ホワイト バック グラウンド プレート (ラス白ダイヤ トレイ) を使用してデジタル カメラを使用してイメージをキャプチャします。次の設定を使用: 方法、デジタル化。露出型、精密;露出時間、マニュアル、1 秒。感度・解像度、高解像度。Tiff 形式で画像を保存します。</li>
	<li>ImageJ のソフトウェアを使用して実行可能なコロニーを定量化します。[選択] メニュー「画像 |種類 |8 ビット」。[選択] メニュー"調整 |しきい値"。コントロールに閾値を設定、すべての条件を一定に保つ[選択] メニュー"分析 |「粒子をを分析します。データを保存し、グラフィカルな表現の統計ソフトウェアで分析します。</li>
</ol>2. スフェロイド形成アッセイ
<ol><li>15 ml の 10 %fbs および 1% 抗生物質 RPMI 1640 培の 75 cm2フラスコで 20,000 セル/cm2の濃度で培養 A549 細胞。</li>
	<li>実験の日、準備、96 ウェル U 底プレート。</li>
	<li>すでに興味 (OT48 のここ 50 μ M) および/または A1210477 の 20 μ M の化合物が含まれている井戸に 10,000 のセルをプレートします。細胞培養液を 100 μ l 添加する最終的な音量を調整します。そのまま外側境界と均一な回転楕円体を形成する細胞の数は、フォーム回転楕円体に十分に考えられます。</li>
	<li>3 日間は、37 ° C、5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>培養 3 日後回転楕円体の 4 倍の倍率を用いた光顕微鏡の画像をキャプチャします。</li>
</ol>3. ゼブラフィッシュ異種アッセイ
注: この技術的なアプローチは、概略図 (図 1) として視覚化です。
<ol><li>
ストック試薬の調製
	<ol>
<li>30 x Danieau の液 1 L を準備: 1740 mM の NaCl、21 mM KCl、12 mM MgSO4∙7H2O、18 mM Ca (3)2、および 150 mM HEPES。7.6 pH メーターを使用するバッファーの pH を調整します。</li>
		<li>1% (50 x) tricaine ソリューションを準備: エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸 (tricaine) 2 mL の蒸留水で 20 mg を溶解します。</li>
		<li>1% フェノールレッド PBS 溶液を準備: 追加 2 μ L の滅菌 PBS 溶液 1.5 μ 管の 198 μ L にフェノールレッド ナトリウム塩溶液。</li>
		<li>3% セルロースを準備: 100 x Danieau の液 1 mL にセルロースの 3 g を追加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ゼブラフィッシュの産卵と孵化
	<ol>
<li>別の一人の女性とパーティションのタンクの 1 つの男性ゼブラフィッシュ暗闇の中 28.5 ° C で UV 殺菌し、フィルター処理された水道水でいっぱい。分離の 24 h の後男女交尾を開始するための魚をミックスします。新鮮な Danieau の溶液 5 mL を含むペトリ皿に合うタンクから受精卵を転送します。</li>
		<li>Danieau の溶液 5 mL で 3 回卵を洗います。洗濯、ピペットと新鮮な溶液 5 mL に転送卵を吸い出しなさい慎重に。28.5 ° C で 8 時間インキュベートします。<ol>
<li>Danieau のソリューションのインキュベーションの 8 h 後 0.03 %1-フェニル-2-チオ色素沈着を抑制する (PTU) を含む Danieau のソリューションに変更します。汚染を防ぐために不透明な卵 (未受精または含む未開発胚) を整理します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
胚 dechorionation
	<ol>
<li>24 h はシャープな鉗子を用いた dechorionate ゼブラフィッシュ胚受精 (hpf) を投稿します。0.03% と Danieau のソリューションで孵化胚の孵化 48 まで 28.5 ° C で PTU hpf。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
化合物処理セル準備
	<ol>
<li>20,000 セル/cm2で 25 cm2培養フラスコ種子 A549 細胞。播種の 24 h 後追加化合物 (50 μ M でここ OT48 と 20 μ M で A1210477 および/または) 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 24 時間。細胞死へそれらをコミットするが、細胞の生存を維持するために、各化合物の治療時間を設定します。今回はポイント個別に設定する必要がありますは、細胞生存率、形態と分子マーカーに基づいています。</li>
		<li>治療の終わりの前に 2 h は、染色細胞蛍光細胞の追跡の 4 μ m は、37 ° C、5% CO2で CM Dil を染めます。孵化の 2 h は後の 0.05% トリプシン-EDTA、細胞を trypsinize し、射出前にフェノールレッド PBS 溶液 50 μ L の 10 の6セルを希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
異種移植腫瘍の形成のための癌細胞のマイクロ射出成形
	<ol>
<li>彼らは寒天プレートに落ち着くまで 5 分 0.02 %tricaine 溶液ゼブラフィッシュを麻酔します。</li>
		<li>マイクロ ピペットの引き手で 1.0 mm (外径 (OD) ガラス管) の外を引っ張る (番組の設定: p: 300、熱: 260、プル: 60、ヴェル: 50、および時間: 200)。シャープなエッジを生成する注射器、マイクロキャピ ラリーをカットします。セル/フェノール赤の 20 μ L で microcapillaries をロード-PBS ソリューション。射出圧力を設定し、2 を調剤する時注射あたり nL。</li>
		<li>100-200 セル卵黄嚢を注入注入 6 に 10 nL 3 に 5 注射を介して。注入後、魚の PTU ソリューションを含む新鮮な Danieau の溶液の 5 mL の 10 から 30 分を回復することができます。PTU ソリューションを含む Danieau の溶液の 1 mL を 24 ウェルプレートでディスパッチ魚と 28.5 ° C で 72 時間インキュベート</li>
		<li>培養 72 時間後 0.02 %tricaine 溶液で魚を麻酔し、3% セルロースのドロップでスライド ガラスに固定します。620 に 750 の波長の蛍光顕微鏡による 5 x 写真を撮る nm。</li>
		<li>ImageJ ソフトウェアによって蛍光腫瘍の大きさを定量化します。[選択] メニュー"分析 |メジャー"。蛍光信号に対応する値を保存し、グラフィカルな表現の統計ソフトウェアで分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

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MCBM で得られたコロニー形成率はセルの種類によって異なります。通常、非付着細胞のコロニー数は付着細胞へと比較してはるかに高い。A549 細胞が 10 日後 30 に 40 コロニーを形成したことがわかった。以前、コロニーの数は 200 に 2509の間別の白血病細胞で報告しています。私たちの結果は、OT48 だけが単独でコロニー数の大幅な減少を作り出さなかった。ただし、BH3 と組み合わせて A549 細胞の擬態 A1210477 コロニー形成能は、相乗的減少しました。以前の別 hydroxycoumarin の派生物 A549 細胞のコロニー形成能を抑制する BH3 模倣とも早晩 OT52 を報告しました。推奨播種濃度は 1.5 x 10 1 x 103から異なる場合があります3。CFA MethoCult を使用して、定期的に様々 な癌細胞の腫瘍形成を測定するために使用される貴重なテクニックがいくつかの制限があります。多くの場合実験は便利ですし、細胞が一度も成長しない実行可能な植民地の回復 MCBM から分離され、RPMI1640 培地に...

がんは細胞の突然変異によって引き起こされ、生化学的なシグナル伝達経路が中断された結果として制御されていない細胞分裂および細胞死への抵抗をトリガーします。腫瘍は、消化器系、神経系、循環系、その後隣接組織1の生理機能を妨げます。広範な研究努力にもかかわらず癌世界2の最も一般的な命にかかわる病気のままです。精密医学は、今後のがん治療の基盤として認識されています。新しい分子の実体は、臨床結果を改善するために既存の薬剤との組み合わせで定期的にテストされます。
ただし、新しい効率的なターゲットを絞った治療法の開発に関連する重要な制限の 1 つは薬物暴露3の正確な生物学的結果をシミュレートするために一般的に使用される試金の失敗です。ガン創はまだほとんど臨床試験4で検証することは困難である 2次元単層培養で培養したがん細胞株における治療薬の有効性のテストに依存しています。したがってより体内の腫瘍5のネイティブの機能を模倣するより良いがんモデルを開発する関心の高まりがあります。近年、3次元培養モデルに対する注目が高まって結果 3 D 腫瘍モデル5を生成する改善された方法論の開発。
深さ体内アッセイにより前に BH3 模倣との組み合わせで hydroxycoumarin OT486の力の理解を改善することができます 3 つの異なった 3 D 細胞培養の技術と手法を紹介します。本論文では、生体内で腫瘍形成テストでさらに肺癌細胞 OT48、BH3 オノマトペの併用の有効性を検証し、生活で癌の進行を監視するゼブラフィッシュ モデルに基づく植民地と SFAs を組み合わせた生物。
コロニー形成法は、日常的に両方の固体だけでなく、造血の癌に対する抗癌剤の有効性を評価するために使用されます。アッセイは、無限に増殖し、コロニー7を形成する細胞の能力を決定します。コロニー形成細胞の能力に及ぼす抗悪性腫瘍剤は、数の減少および/またはコロニーのサイズによって決定されます。
回転楕円体体外腫瘍モデルを表し、抗がん剤のスクリーニング低コストのプラットフォームとして。回転楕円体は、懸濁液中の成長の細胞の集合体をまたは 3 D マトリックスに埋め込まれています。このアプローチは、薬剤のスクリーニングおよび腫瘍の成長、増殖と免疫の相互作用のための8の研究に広く使用されます。
完全に新しい薬物の特性を理解して、齧歯動物の生体内で実験を行うことが不可欠です。しかし、この従来の方法は高価で時間がかかるです。近年、ゼブラフィッシュ (動脈分布) が安くかつ迅速に高めるために広く研究所生物になった。ゼブラフィッシュ表す 3 D セル文化アプローチ、9の脊椎動物の体内の設定の中で腫瘍を開発しました。
完全に、我々 はここで使用 Cfa、SFAs ゼブラフィッシュ生体内で腫瘍形成など 3 つの異なる 3 D 文化アプローチ BH3 模倣との組み合わせで肺がんがん A549 細胞モデルによる hydroxycoumarin OT48 の抗がん能力を発揮します。

<table><tbody><tr><td>コロニー形成アッセイに必要な材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ロンザ</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>バイオウエスト</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS 溶液</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml チューブ</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 ウェルプレート</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>チアゾリルブルー臭化テトラゾリウム(MTT粉末)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GEヘルスケアテクノロジー</td><td></td>ズ <td>RT</td></tr><<tr><td>strong>スフェロイド形成アッセイに必要な材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ロンザ</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>バイオウエスト</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS 溶液</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>コーニング共演者超低アタッチ96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス TS100</td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>ゼブラフィッシュ異種移植に必要な材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ロンザ</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>バイオウエスト</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml チューブ</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS ソリューション</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgSO4.7H2O)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>硝酸カルシウム四水和物 (Ca(NO3)2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸(トリカイン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>フェノールレッド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil色素</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>シャッター機器、米国</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>ワールド精密機器</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>マリエンフェルト</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

回転楕円体、コロニー形成アッセイとゼブラフィッシュ異種移植片による抗癌性クマリン ot48 の生物活性の臨床評価

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

新規治療薬のin vitroとin vivoの前臨床スクリーニングは、がん創薬における重要なツールです。ひと癌細胞株は、2 D (二次元) 単層細胞培養治療化合物に対応がもっと生理学的に関連するモデルの薬剤の有効性を理解する 3 D 培養システムが開発されました。近年、パラダイム シフトは、3次元培養システム、腫瘍微小環境をより正確に模倣の新規分子の効力を検証するための前臨床研究で観察されました。これらのシステムはもっと生理学的に関連する方法で病気の状態を特徴付けるし、より良い機械論的洞察力と与えられた分子の薬理学的力の理解を得るを助けます。また、生体内で癌モデルの改良で現在の傾向とゼブラフィッシュは、生体内で腫瘍形成を評価し、治療薬の効果を研究する重要な脊椎動物モデルとして浮上しています。ここでは、調べた hydroxycoumarin OT48 の治療効果単独または肺がん細胞株 A549 BH3 オノマトペとの組み合わせでコロニー形成アッセイ (CFA)、スフェロイド形成アッセイ (SFA) を含む 3 つの異なる 3次元培養システムを用いた、ゼブラフィッシュ異種生体内で。

図 2肺癌細胞株 A549 でシードだった MCBM コロニーを形成する OT48 治療後単独で、または指定された濃度で綴じられた BH3 擬態 A1210477 との組み合わせでの。その結果、組み合わせを大幅に削減数、サイズおよび植民地の総面積 10 日間の培養後。
図 3、A549 細胞 BH3 擬態 A1210477 と OT48 を単独または組み合わせで治療され、U 底プレートによるフォーム回転楕円体を許されました。培養 3 日後回転楕円体の画像が撮影されました。スフェロイドの定量化が行われた画像 J と 3 D を使用してイメージを生成しました。
図 4</str...

三次元培養とゼブラフィッシュを用いた抗癌剤のクマリンの前臨床スクリーニングを紹介します。

回転楕円体、コロニー形成アッセイとゼブラフィッシュ異種移植片による抗癌性クマリン OT48 の生物活性の臨床評価

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

この方法は、創薬の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、抗がん効果を特定し、in vitroおよびin vivo 3D培養システムを使用して新規分子のメカニズムに関するより優れた洞察を得ることができます。この技術の主な利点は、より生理学的に関連性のあるin vivoモデルにおける化合物の薬理学的効果の多様性です。まず、15 mmのRPMI 1640細胞培養培地に15 mmリットルの RPMI 1640 細胞培養培地に 20, 000 個の A549 細胞を 105 平方センチメートルのフラスコでプレートします。培養物を摂氏37度、CO2 5%でインキュベートします。実験当日は、血球計算盤を用いて細胞濃度を測定します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブに50, 000個の細胞を400gで7分間遠心分離し、100マイクロリットルの滅菌1x PBSに細胞を再懸濁します。マルチピペットを使用して、1.1ミリリットルの半固体メチルセルロースベースの培地(MCBM)をチューブに分注し、各条件に1本のチューブを準備します。次に、各チューブに110マイクロリットルのFBSを追加します。次に、ミリリットルあたり1000個の細胞を保存します。次に、ストックセル溶液の2.4マイクロリットルをMCBMおよびFBSのチューブにピペットで移します。細胞を添加した後、チューブを垂直に保持し、最高速度で1分間ボルテックスして、MCBMと細胞を完全に混合します。次に、試験化合物OT48を単独で、またはA1210477と組み合わせてサンプルに加えます。使用する溶媒のコントロールとして、DMSOなどの別のチューブを準備します。次に、サンプルを1分間ボルテックスします。各アッセイについて、混合物の1ミリリットルを12ウェル細胞培養プレートの中央ウェルにピペットで移します。次に、1ミリリットルの滅菌水またはPBSを使用して、空の井戸を満たします。プレートを摂氏37度、CO25%で10日間インキュベートします。次に、各ウェルに5ミリグラム/ミリグラムのMTTストック溶液を200マイクロリットル加えます。プレートを10分間インキュベートした後、紫色に変わる生存可能なコロニーを確認します。白い背景プレートを使用して、次の設定を使用して画像をキャプチャします:方法については、デジタル化を選択します。露出タイプには、精度を選択します。露光時間には、手動と1秒を選択します。感度と解像度については、高解像度を選択します。次に、キャプチャした画像をTIFF形式で保存します。ImageJソフトウェアでは、メニュー画像、タイプ、8ビットを選択して生存コロニーを定量化します。メニュー調整としきい値を選択します。しきい値を制御し、すべての条件で一定に保ちます。次に、メニュー分析、粒子の分析を選択します。データを保存し、統計ソフトウェアでグラフィカルに表示します。テキストプロトコールに従ってストック試薬を調製した後、28.5°CのUV殺菌ろ過水道水で満たされた仕切り水槽にメスとオスのゼブラフィッシュ1匹を分離し、暗所に置きます。分離の24時間後、パーティションを取り外して嵌合を開始します。受精卵を交配タンクから5ミリリットルの新鮮なダニオス溶液が入ったシャーレに移します。5ミリリットルのダニオス溶液を使用して卵を3回洗い、ピペットを使用して卵を慎重に吸引し、5ミリリットルの新鮮な溶液に移します。次に、卵を摂氏28.5度で8時間孵化させます。0.03%PTUを含むダニオス溶液に変更して色素沈着を抑制し、不透明な未受精卵を選別して汚染を防ぎます。受精後24時間で、鋭い鉗子を使用して胚を脱毛します。次に、受精後最大48時間で、PTUを含むダニオス溶液で胚をインキュベートします。A549細胞を播種し、テキストプロトコールに従って化合物とインキュベートした後、処理終了の24時間前に、蛍光セルトラッカー色素であるCM-Dilの4マイクロモルを添加して細胞を染色し、2時間インキュベートします。インキュベーション後、0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞をトリプシン化します。次に、注射前に10〜6番目の細胞を50マイクロリットルのフェノールレッドPBS溶液で希釈します。がん細胞のマイクロインジェクションを行うには、次のプログラム設定を使用して1.0ミリメートルのガラスキャピラリーを引っ張ります:シリンジを使用してキャピラリーを切断し、鋭いエッジを生成します。次に、マイクロキャピラリーに20マイクロリットルの細胞フェノール赤色溶液をロードします。テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュを麻酔した後、3〜5回の注入で6〜10ナノリットルを注入することにより、100〜200個の細胞を卵黄袋に注入します。マイクロインジェクションは、細胞の正しい量が注入され、注入による損傷が最小限に抑えられ、二酸化炭素圧力が横方向の亀裂を避けるために最適であることを確認するために、非常に慎重かつ正確に行う必要があります。注射後、PTUを含む5ミリリットルの新鮮なダニオス溶液で魚を10〜30分間回復させます。魚を1ミリリットルのDanios PTU溶液で24ウェルプレートに移し、摂氏28.5度で72時間インキュベートします。インキュベーション後、テキストプロトコルに従って魚を麻酔した後、3%メチルセルロースを滴下したスライドガラス上に魚を固定します。620〜750ナノメートルの波長で5倍蛍光画像を撮影します。ImageJソフトウェアを使用して、分析と測定を選択することにより、蛍光腫瘍のサイズを定量化します。次に、蛍光値を保存し、統計ソフトウェアで分析してグラフ化します。この実験では、肺がん細胞株A549をMCBMに播種し、OT48単独またはBH3模倣体A1210477と組み合わせてここで見られる濃度で処理した後、コロニーを形成しました。その結果、この組み合わせにより、10日間のインキュベーション後にコロニーの数、サイズ、および総表面積が大幅に減少したことが示されました。ここでは、OT48単独またはBH3模倣物との併用で処理した後、A1210477、細胞をUボトムプレート技術を用いてスフェロイドを形成することを許可した。3日間のインキュベーションの後、スフェロイドを画像化して定量し、3D画像を生成しました。この図は、処理された細胞をゼブラフィッシュの卵黄袋に注入したときに生成された蛍光腫瘍の定量化から、OT48および/または腫瘍形成に対するA1210477の阻害可能性を示しています。この手順を試行する際は、データの統計的評価に影響を与える重要な変動を避けるために、各条件の魚の数を約 10 個以上に保つことを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ゼブラフィッシュ異種移植片における標的タンパク質発現を評価するために、組織学的分析などの他の方法を実行することができます。この技術は、創薬分野の研究者がゼブラフィッシュ異種移植片のin vivo微小環境における化合物の有効性を探求する道を開くものです。このビデオを見れば、3D培養環境で薬効を検証する方法について十分に理解できるはずです。

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、ゼブラフィッシュ患者由来の異種移植モデルを作成する手法について説明しています。サンプルプロトコルでは、膵臓腫瘍異種移植モデルに対する薬剤ゲムシタビンとナビトクラクスの効率を評価します。...

ゼブラフィッシュ患者由来異種移植片(zPDX):がんモデル

このビデオでは、肺がん細胞が無限に増殖し、個々のコロニーを形成する能力を決定するのに役立つコロニー形成アッセイについて説明しています。コロニー形成細胞に対する抗がん剤の効果は、コロニー形成細胞の数や大きさの変化を解析することで解析できます。...

コロニー形成アッセイ:コロニー形成肺がん細胞に対する抗がん剤の有効性の評価

ゼブラフィッシュ異種移植糸アッセイ:ゼブラフィッシュの腫瘍原性に対する治療薬の抗がん効果をIn vivoで評価する方法

このビデオでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ腫瘍モデルを使用してメラノーマ修飾遺伝子をスクリーニングする方法について説明しています。メラノーマを誘発するminiCoopRベクターを注射すると、ゼブラフィッシュはメラノーマを発症するため、ゼブラフィッシュの腫瘍発生に影響を与える遺伝的要因の研究に使用できます。...

miniCoopRベクターベーストランスジェネシス:ゼブラフィッシュ腫瘍モデルにおける黒色腫誘導遺伝子をスクリーニングする技術

ゼブラフィッシュ土着腫瘍モデルを用いてメラノーマ修飾するための画面への迅速な方法が提示される。これは、メラノサイト内の候補メラノーマの遺伝子の発現を可能にminiCoopRベクトルを利用しています。メラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイ、スケールメラノサイトおよびメラノーマ移植アッセイの抗体染色のためのプロトコルを取得するための方法が記載されている。...

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

この方法は、効果的に癌細胞の血管の浸潤能をテストするためにゼブラフィッシュ胚を利用します。蛍光性の癌細胞は、心臓前方の洞または胚の開発の卵黄嚢に注入されます。癌細胞血管浸潤と血管外漏出は、24から96時間後に尾部領域の蛍光顕微鏡によって評価します。...

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）

ゼブラフィッシュ異種移植片モデルは、生体内微小環境におけるヒト癌細胞のハイスループット薬物スクリーニングおよび蛍光イメージングを可能にする。当社は、自動蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットを用いて、ゼブラフィッシュにおける患者由来白血病サンプルに対する大規模な自動薬物スクリーニングのワークフローを開発しました。...

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。...

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

前臨床モデルは、がん生物学の知識を進歩させ、治療効果を予測することを目的としています。この論文では、腫瘍組織断片を用いたゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)の生成について説明します。zPDXを化学療法で治療し、その治療効果を移植組織の細胞アポトーシスに関して評価した。...

化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

このプロトコルは、受精後3〜7日のゼブラフィッシュの幼生における薬物スクリーニング手順と、それに続く形態学的評価を説明しています。...

初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

学ぶ 3D培養とゼブラフィッシュ異種移植を用いた抗癌性クマリンOT48の評価法。A549細胞のコロニー形成アッセイとin vivoモデルで薬理効果を検証し、創薬研究における化合物スクリーニングの信頼性を向上させる。

回転楕円体、コロニー形成アッセイとゼブラフィッシュ異種移植片による抗癌性クマリン OT48 の生物活性の臨床評価

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