個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

この手順の全体的な目的は、最終的に機能的CFTR研究のアッセイとして使用できるヒト鼻細胞スフェロイドを作製することです。この方法は、ex vivoモデルシステムでCFTR変更薬に対する個々の被験者の反応を評価するなど、嚢胞性線維症分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小さな鼻細胞サンプルから比較的短い時間枠で多数のスフェロイドが生成され、広範な試験が可能になることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLauren StreckerとJessica Moncivaizです。テキストプロトコルに従ってフィーダー線維芽細胞上のヒト鼻上皮またはHNE細胞を処理および拡大した後、以前に調製した拡張培地、分化培地、0.1%トリプシンEDTA溶液、および滅菌PBSを30分以上室温に持ってきます。次に、70%エタノールを使用して容器を洗浄し、清潔なバイオセーフティキャビネットに移します。

バイオセーフティキャビネットで、真空ラインに取り付けられたパスツールピペットを使用して、HNE培養から培地を吸引して廃棄します。次に、清潔な血清ピペットで、5ミリリットルのPBSを使用して、バッファーを追加、旋回、吸引して皿を洗います。5ミリリットルの0.1%トリプシンEDTA溶液を培養物に加え、摂氏37度と5%二酸化炭素で5分間インキュベーターに戻します。

次に、4〜10倍の倒立顕微鏡で、細胞が皿から離れ、丸くなって浮くことを確認します。培養皿の側面を軽くたたいて細胞を取り除き、必要に応じて、ほとんどの細胞が剥離するまでさらに5分間皿を再インキュベートします。次に、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、5ミリリットルの拡張培地を皿に加え、すべての液体をラベル付きの滅菌50ミリリットルの円錐管に集めます。

トリプシン処理を3ラウンド行った後も細胞が培養皿に付着している場合は、滅菌細胞スクレーパーを使用して残りの細胞を穏やかに放出し、5ミリリットルの膨張培地でスクレーパーと皿を洗浄し、内容物を同じラベル付き円錐管に集めます。チューブを摂氏4度で360gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの膨張培地を使用して細胞ペレットを再懸濁します。

次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。製造元の指示に従って、基底膜マトリックスを氷の上で解凍します。適切な数の差次トリプシン処理細胞を分離し、マトリックスのミリリットルあたり500, 000細胞の最終濃度にします。

4ウェルプレートの場合、200, 000個の細胞を使用し、それらを1.5ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞混合物を360倍g以下で5分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、培地を完全かつ慎重に吸引して廃棄します。

細胞のチューブを積極的に取り扱わないときは、氷の上に置いてください。1ミリリットルのピペットチップを使用して、計画されたウェルごとに100マイクロリットルの基底膜マトリックスを細胞に加えます。気泡の混入を避けるためにピペットチップを完全に空にするのではなく、ピペットを上下させて細胞を慎重かつ完全に再懸濁します。

マトリックスの固化を避けるために素早く動きます。100ミリリットルのマトリックスアリコートを4ウェルIVF培養プレートの各ウェルに播種するには、清潔なハサミを使用して、200マイクロリットルのピペットチップから遠位3〜4ミリメートルを切り取ります。100マイクロリットルの細胞マトリックス混合物を各ウェルの中央に慎重にゆっくりとピペットで移し、液滴が球形のままでウェルの側面に触れないようにします。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。次に、マトリックスの滴下を妨げないように注意しながら、500マイクロリットルの分化培地を各ウェルに慎重にピペットで移します。メディウムがドロップを覆うだけであることを確認し、必要に応じてさらに追加します。

HNEスフェロイドを培養するには、1ミリリットルのピペットチップを使用して、スフェロイドを破壊するマトリックスを避けながら、ウェルからすべての培地を穏やかに吸引します。次に、新しい1ミリリットルのピペットチップで、マトリックスに触れたり邪魔したりしないようにしながら、マトリックスの周りのウェルに500マイクロリットルの分化培地を静かに加えます。スフェロイドのインキュベーションを続け、示したように分化培地を週3回交換します。

20倍の倍率の倒立顕微鏡で、スフェロイドの形態を毎日評価します。スフェロイドは、めっき後3〜5日以内に形成され、約10日以内に成熟します。HNEは、播種から72時間以内に培養皿に付着し、小さな島を形成する必要があります。

1週間での島の形成が良い例と悪い例をここに示します。島は15〜30日かけて料理を覆うように拡大する必要があります。培養の最初の3〜4日以内に、マトリックス内に小さな嚢胞性構造が形成され始め、約10日で成熟するはずです。

記載された密度で播種した場合、成功した培養物には、マトリックス滴あたり50〜100個のスフェロイドが含まれます。内腔は、野生型CFTRのように比較的明瞭な場合もあれば、CFスフェロイドのように細胞の破片や粘液で満たされている場合もあります。スフェロイドの管腔領域を描写するためのマスキングは、これら2つのパネルで実証されています。

ここに示されているのは、形成が不十分な失敗した回転楕円体培養の例です。これらの機能アッセイのグラフに示されているように、野生型CFTRの被験者のスフェロイドは、刺激を受けると1時間以上膨らむはずであり、CFTR阻害剤inh-172の存在下で刺激されると膨潤が少なくなるか縮小するはずです。F508del-CFTRのホモ接合体である被験者由来のスフェロイドは、CFTRモジュレーターVX809およびVX770で薬理学的に補正すると、膨潤の増加または縮小を伴って非常にわずかに膨らむか、または縮小が少なくなるはずです。

一度習得すると、鼻細胞スフェロイドの播種は、適切に行われれば15〜20分で行うことができます。この手順を試行する際は、サンプルの汚染リスクを最小限に抑え、自分の健康へのリスクを回避するために、バイオセーフティキャビネット内のクリーンな操作手順を維持することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、固定、染色、顕微鏡検査などの他の方法を実行して、細胞の形態と組成に関する追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、CFTR機能の個別化アッセイとして利用できる初代ヒト鼻細胞スフェロイドの作製方法について十分に理解できるはずです。主要な人間の組織を扱うことは危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切な個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。