Name: 個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶ 鼻腔上皮細胞スフェロイドの作製法。CFTR機能評価に用いる三次元培養モデルで、嚢胞性線維症の個別化医療研究に貢献します。少量の検体から多数のスフェロイドを迅速に生成可能です。

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この作品は、嚢胞性線維症財団治療によって支えられた、数 CLANCY14XX0 を付与し、嚢胞性線維症財団を通じて付与数 CLANCY15R0。患者の募集と規制監督で彼女の援助のクリスティーナ レイを感謝致します。また、著者は HNE ワーキング グループは、嚢胞性線維症財団、HNE 文化機能の世代の支援者に支えを感謝したい: プレストン Bratcher カルバン綿、マルティナ ・ Gentzsch、エリザベス Joseloff、マイケル ・ Myerburg、デイブ ・ ニコルズスコット ・ ランデル、スティーブ Rowe、G. マーティ ソロモン、キャサリン Tuggle。

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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、患者由来鼻細胞スフェロイド培養「CFTR 機能個別の特定モデルを生成することができるの生成について説明します。難しさを避けるために密接に出席する必要がありますプロセスでいくつか重要な手順があります。まずは患者さんの鼻から良いサンプル集録です。良いサンプルがあるはず > 50,000 セルは、粘液/破片の限定および 4 時間以内 (ただし、成功は、一晩氷で送料も簡単に達成) を処理するために準備ができています。研究スタッフがブラシやキュレット検体身につける練習は彼らの慰めを最大にする 1 つまたは 2 つのプロバイダーの手に初期サンプルの取得に焦点を当て、促進が必要です。ティッシュ文化のすべての手順の 2 番目、良いクリーン/生殖不能の技術は不可欠です。すべて HNE 文化のため、我々 の経験で、障害が発生したプライマリ ・ モードは、主なサンプルとインキュベーターの他の成長の文化の両方を複雑にすることができます細菌や真菌の汚染です。このリスクの慢性感染症 (例えばCF) 被験者の文化とだけ増加、したがって成功ヒンジ主かつ独立した文化を維持する能力。私達の練習は不注意な汚染から成功した、古い文化を保護...

嚢胞性線維症 (CF) は、約 7万人の世界1に影響を与える致命的な常染色体性劣性遺伝性疾患です。この人生短縮遺伝病は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ蛋白質 (CFTR)2で突然変異によって引き起こされます。CFTR 胃腸、汗腺を含む複数の偏光上皮細胞の頂端膜を渡る塩化物、重炭酸塩の動きを許容するイオン チャネルとして機能や、アデノシン三リン酸結合カセット家族のメンバーであります。・呼吸器病3,4の木の他の中で。など、「CFTR 機能不全は呼吸器疾患1から生じるほとんどの死亡率と多臓器の上皮障害につながります。CFTR 駆動気道表面液体 (ASL) 規制と粘液のリリースにつながる厚く粘液、気道閉塞、慢性感染症、進行性気道リモデリングと肺機能1、5の損失は、CF の肺。
病気の原因として「CFTR 機能障害の識別、にもかかわらず CF 療法は、伝統的症状 (例えば、膵酵素補充療法、気道クリアランス療法)1軽減焦点を当てた。このアプローチは、最近「CFTR 変調」「CFTR 機能不全を直接対象すると呼ばれる新規の治療法の出現によって革命化されました。このアプローチは、疾患修飾に症状マネジメントから臨床の風景をシフトしている気が、いくつかの制限6,7,8,9,10を運ぶ。変調器の活動は各 CFTR の突然変異に伴うタンパク質の欠陥に特定、限られた遺伝的個体群11を選択します。この制限は、まれな突然変異グループでの臨床試験の実行によっても異種タンパク質の欠陥、性質によって駆動されます。さらに、よく研究遺伝子多型 (例えばF508del/F508del CFTR CFTR の最も一般的な突然変異)、被験者の間ではばらつきが大きく、疾病負担と変調器応答6,7,8 ,9,11。
両方のこれらの問題を克服するため、捜査官は前臨床試験12のパーソナライズされたモデルの使用を提案している.この概念は、パーソナライズされた方法で治療する生体内で件名応答予測複合テスト、個別前のヴィヴォモデル システムを生成する患者特有の組織を利用しています。されましたら、臨床医が患者の基になる CFTR 遺伝子型に関係なくドライブ精度療法はこのようなモデルを使用可能性があります。
人間の肺移植の時に植組織から得られた気管支の上皮 (HBE) 細胞は、CF13,14のためのようなモデルの可能性を設立しました。HBEs 気液界面 (アリ) で成長して電気生理学的検査から直接または間接的 ASL 恒常性13,15の措置を通じて機能の CFTR の定量化を可能にします。このモデルは CFTR の生物学を理解するための重要なている、CFTR 変調器16の開発の重要なドライバーだった。残念ながら、HBE モデルはこれらのまれな変異や軽度の病気 (肺移植または気管支擦過) 買収の侵襲的な性質とサンプルの不足のためのパーソナライズされたモデルとして理不尽ではありません。個別「CFTR 機能17,18,を勉強する腸内電流測定 (ICM) または腫れベースにおけるアッセイの腸組織、直腸または十二指腸生検標本から得られたを使用ことができます逆に、19. Organoid 試金、特に、CFTR 活動20,21,22の非常に機密性の高いモデルであります。両方のモデルは、組織ソース (腸組織、ほとんどの病は呼吸器) と半侵襲的買収法によって制限されます。また、いくつか調査官はモデル CFTR 復元23,24,25に人間の鼻粘膜上皮 (HNE) の細胞を研究しています。HNEs はブラシまたはあらゆる年齢層の被験者で掻爬によって安全に収穫できるし、アリで培養した場合 HBEs25,26,27,28の多くの特徴を要約するでしょう。HNE 単層培養は扁平上皮の変換と成熟度29に長い時間によって伝統的に制限されています。また、報告されて短絡 HNEs で電流の測定が治療効果の25を検出する小さいウィンドウを示唆している HBEs のそれらより小さい。
「CFTR 機能のパーソナライズされた、非侵襲的呼吸器の組織培養モデルの必要性を考える我々 は HNEs の非侵襲的・呼吸器病の自然と腫れベースにおけるアッセイの感度をマージしようとしました。ここでは、腫れを用いた測定30個別 CFTR の研究のための HNEs の 3 次元「回転楕円体」文化を生成する手法について述べる。HNE スフェロイド二極化確実に球の中心、または内腔に向かって上皮の頂点。このモデルは、下気道上皮の多数の特徴を繰り返す、アリの文化よりも早く成熟します。機能アッセイとして HNE 回転楕円体は確実に範囲の「CFTR 機能としてよく研究の突然変異のグループ (例えば、F508del CFTR) で変調を定量化します。この腫れベースの試金を直接測定されない流体流入回転楕円体に水が根尖部の塩排出を通り CFTR のイオン/塩の輸送特性における大文字します。この方法で機能的 CFTR の誘導回転楕円体膨らむ頑健、CFTR 機能不全とのそれら、うねりの少ない縮小中。これは事前のイメージ分析を通して定量化され、1 h 後刺激の回転楕円体、内腔領域を測定し、割合の決定を変更します。この測定は、患者特異的薬物活性のスクリーニング実験群間で比較できます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tube</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>150 mLフィルターフラスコ</td><td>ミッドサイエンス&nbsp;</td><td>TP99150</td><td>メディア</td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>ミッドサイエンスをろ過するには&nbsp;</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>1Lフィルターフラスコ</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99950</td><td>メディアをろ過するには</td></tr><tr><td>35 mm ガラス底皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td>オプション</td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>1 mLのDMSOに22.0 mgの100 mMストック溶液を調製</td></tr>します<tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>ミッドサイエンス&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td></td>TP91050</tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>・イノベーティブ・セル・テクノロジーズ(株)</td><td>AT-104</td><td>細胞剥離液</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>表1参照</td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>表1参照</td></tr><tr><td>ウシ脳抽出物(9mg/mL)</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>表2参照</td></tr><tr><td>セフタジジム水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>表1参照</td></tr><tr><td>セルスクレーパー 20cm&nbsp;</td><td>ミッドサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td> DMSOコレラ毒素B(コレラ菌由来)シグマアルドリッチC8052-.5MGの<td>1mLに4.0mgの10mMのストック溶液を調製</td></tr>します 表<tr><td></td><td></td><td></td><td>1を参照してください</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>メディカルパッケージングコーポレーション</td><td>CYB-1</td>細胞<td>学ブラシ</td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルメディア(DMEM)/F12ヘペス&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>ベースミディアム;表1および表2を参照してください</td></tr><tr><td>上皮成長因子(組換えヒトタンパク質、動物由来フリー)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHG6045</td>表<td>1を参照してください</td></tr><tr><td>エピネフリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>E4250-1G</td><td>表2を参照してください</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16.6 mM溶液;表2エ</td></tr><tr><td>チレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>TCIアメリカ&nbspを参照してください。</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(高性能FBS)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10082147</td><td>表1を参照</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td> DMSO Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 1 <td>mL に 4.1 mg の 10 mM ストック溶液を調製</td></tr>します<tr><td></td><td>。</td><td>356231</td><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix、フェノールレッドフリー、LDEVフリー、10 mL。</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Collagen solution</td></tr><tr><td>HyClone (aka FetalClone II)&nbsp;</td><td>GEヘルスケア&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>表2参照</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>StemCell Technologies</td><td>07904</td><td>表1および2参照</td></tr><tr><td>インスリン、ヒト組換え、亜鉛溶液</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12585014</td><td>4 mg/mL 溶液; 表 2</td></tr><tr><td>IVF 4 ウェル ディッシュ、未処理</td><td>NUNC (フィッシャー サイエンティフィック経由)</td><td>12566350</td><td>スフェロイド用 4 ウェル プレートを参照; 24 ウェル プレートと同様のウェル サイズ</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>照射マウス胚性線維芽細胞</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>分析ソフトウェア;引用 https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software</td></tr><tr><td>オリンパスIX51倒立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>イメージング顕微鏡を廃止</td><td>しました。交換:オリンパスIX53、https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp;引用については</td></tr><tr><td>、Strep</td><td>Life Technologiesのペン&nbsp;</td><td>15140122</td><td>表2を参照</td></tr><tr><td>フソフリルレテアノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>表2を参照</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>表2を参照</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>鼻用キュレット</td></tr><tr><td>Slidebook 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td>Discontinued</td><td>Imaging Software.交換: スライドブック 6、見積もりの https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td></tr><tr><td>滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 100</td><td>テクノプラスチック製品</td><td>93100</td><td>拡張用組織培養皿</td></tr><tr><td>トブラマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>表1参照</td></tr><tr><td>トランスフェリン(ヒトトランスフェリン0.5mL)</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>表</td></tr><tr><td>2 トリヨードスリョニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-thyronine ナトリウム塩&nbsp;[T3];表2を参照してください</td></tr>:<tr><td>ブタのトリプシン、ブタ、膵臓、</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>、Ultroser-G</td><td>、Crescent Chemical(Fisher Scientific経由)</td><td>NC0393024</td><td>20mLのリポフィリゼ粉末。表2参照</td></tr><tr><td>Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td>由来の塩酸バンコマイシン <td>表1参照</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>DMSO 1 mLに0.4 mgの1 mMの原液を調製</td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td> DMSO Y-27632 二塩酸塩<td>1 mLに4.5 mgの10 mM原液を購入または調製</td></tr>する<tr><td>。ROCK阻害剤&nbsp;</td><td>エンツォ・ライフサイエンス&nbsp;</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>表 1 を参照してください</td></tr></tbody></table>

個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

一方、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) 変調器薬の導入ケア嚢胞性線維症 (CF) に革命をもたらしました、現在使用している遺伝子型指向療法モデルはいくつかの制限を持っています。最初、稀なまたは流変異グループは、決定的な臨床試験から除外されます。また、追加の変調器薬市場に参入、個々 の主題の変調器の選択を最適化することは困難になります。両方のこれらの問題は「CFTR 機能変調の患者由来、個別の前臨床モデル システムを使って解決されます。ひと鼻粘膜上皮細胞 (HNEs) は、このようなモデルのための呼吸器組織の簡単にアクセス可能なソースです。ここで、「CFTR 機能と主な HNEs を用いた変調方式の三次元回転楕円体モデルの生成について述べる.HNEs は、低侵襲のファッション、条件付きのリプログラミング条件に拡大し、回転楕円体の文化にシードの被験者から分離されています。種まきの 2 週間以内に回転楕円体の文化生成 3', 5'-環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を刺激することができます HNE スフェロイド-アゴニスト「CFTR 機能アクティブするを生成します。回転楕円体の腫れは CFTR の活性のプロキシとして、定量化されます。HNE 回転楕円体は、低侵襲、まだ呼吸疾患の罹患率と死亡率を反映した上皮に関連するアクセス可能なパーソナライズされたモデルを生成する鼻の細胞の起源を活用します。気液界面 HNE 文化に比べると、回転楕円体は、成熟する比較的簡単な汚染率を減らします。現在の形態でモデルは組織の買収の相対的な容易さは相殺されて、低スループットによって制限されます。確実に定量化し、個々 のレベルで「CFTR 活動を特徴付ける HNE 回転楕円体を使用できます。CFTR 変調に対する患者の反応の真の臨床予測かどうか HNE 回転楕円体は、生体内で薬剤応答にこの数量を結ぶ継続的な研究を決定します。

HNEs が培養皿に添付し、細胞播種; の 72 時間以内の小さな島々 を形成それぞれ図 1 a 1 b、1 週間で良いと貧しい島形成の例のとおりです。これらの島々 を 15-30 日のコース料理をカバーするため展開する必要があります。小規模または次善のサンプルは、かかることがあり、しばしば便利な回転楕円体は得られません。感染性病原体による汚染は、深い黄色/曇りメディア、培養皿にアタッチする細胞の障害および/または菌類・細菌の直接可視化によって証明されます。任意の汚染された文化は、クロス汚染を避けるために直ちに破棄しなければなりません。
基底膜マトリックスにおける文化の最初の 3-4 日内小嚢胞構造はマトリックス内のフォームが開始されます。これらは、薄い壁と内腔表面を示すそのまま回転楕円体に約 10 日間で成熟します。前述の電力密度でメッキ、成功した文化にマト...

ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR 機能のプロキシとして回転楕円体内腔サイズ変化を定量化します。

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

この手順の全体的な目的は、最終的に機能的CFTR研究のアッセイとして使用できるヒト鼻細胞スフェロイドを作製することです。この方法は、ex vivoモデルシステムでCFTR変更薬に対する個々の被験者の反応を評価するなど、嚢胞性線維症分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小さな鼻細胞サンプルから比較的短い時間枠で多数のスフェロイドが生成され、広範な試験が可能になることです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLauren StreckerとJessica Moncivaizです。テキストプロトコルに従ってフィーダー線維芽細胞上のヒト鼻上皮またはHNE細胞を処理および拡大した後、以前に調製した拡張培地、分化培地、0.1%トリプシンEDTA溶液、および滅菌PBSを30分以上室温に持ってきます。次に、70%エタノールを使用して容器を洗浄し、清潔なバイオセーフティキャビネットに移します。バイオセーフティキャビネットで、真空ラインに取り付けられたパスツールピペットを使用して、HNE培養から培地を吸引して廃棄します。次に、清潔な血清ピペットで、5ミリリットルのPBSを使用して、バッファーを追加、旋回、吸引して皿を洗います。5ミリリットルの0.1%トリプシンEDTA溶液を培養物に加え、摂氏37度と5%二酸化炭素で5分間インキュベーターに戻します。次に、4〜10倍の倒立顕微鏡で、細胞が皿から離れ、丸くなって浮くことを確認します。培養皿の側面を軽くたたいて細胞を取り除き、必要に応じて、ほとんどの細胞が剥離するまでさらに5分間皿を再インキュベートします。次に、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、5ミリリットルの拡張培地を皿に加え、すべての液体をラベル付きの滅菌50ミリリットルの円錐管に集めます。トリプシン処理を3ラウンド行った後も細胞が培養皿に付着している場合は、滅菌細胞スクレーパーを使用して残りの細胞を穏やかに放出し、5ミリリットルの膨張培地でスクレーパーと皿を洗浄し、内容物を同じラベル付き円錐管に集めます。チューブを摂氏4度で360gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの膨張培地を使用して細胞ペレットを再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。製造元の指示に従って、基底膜マトリックスを氷の上で解凍します。適切な数の差次トリプシン処理細胞を分離し、マトリックスのミリリットルあたり500, 000細胞の最終濃度にします。4ウェルプレートの場合、200, 000個の細胞を使用し、それらを1.5ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞混合物を360倍g以下で5分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、培地を完全かつ慎重に吸引して廃棄します。細胞のチューブを積極的に取り扱わないときは、氷の上に置いてください。1ミリリットルのピペットチップを使用して、計画されたウェルごとに100マイクロリットルの基底膜マトリックスを細胞に加えます。気泡の混入を避けるためにピペットチップを完全に空にするのではなく、ピペットを上下させて細胞を慎重かつ完全に再懸濁します。マトリックスの固化を避けるために素早く動きます。100ミリリットルのマトリックスアリコートを4ウェルIVF培養プレートの各ウェルに播種するには、清潔なハサミを使用して、200マイクロリットルのピペットチップから遠位3〜4ミリメートルを切り取ります。100マイクロリットルの細胞マトリックス混合物を各ウェルの中央に慎重にゆっくりとピペットで移し、液滴が球形のままでウェルの側面に触れないようにします。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。次に、マトリックスの滴下を妨げないように注意しながら、500マイクロリットルの分化培地を各ウェルに慎重にピペットで移します。メディウムがドロップを覆うだけであることを確認し、必要に応じてさらに追加します。HNEスフェロイドを培養するには、1ミリリットルのピペットチップを使用して、スフェロイドを破壊するマトリックスを避けながら、ウェルからすべての培地を穏やかに吸引します。次に、新しい1ミリリットルのピペットチップで、マトリックスに触れたり邪魔したりしないようにしながら、マトリックスの周りのウェルに500マイクロリットルの分化培地を静かに加えます。スフェロイドのインキュベーションを続け、示したように分化培地を週3回交換します。20倍の倍率の倒立顕微鏡で、スフェロイドの形態を毎日評価します。スフェロイドは、めっき後3〜5日以内に形成され、約10日以内に成熟します。HNEは、播種から72時間以内に培養皿に付着し、小さな島を形成する必要があります。1週間での島の形成が良い例と悪い例をここに示します。島は15〜30日かけて料理を覆うように拡大する必要があります。培養の最初の3〜4日以内に、マトリックス内に小さな嚢胞性構造が形成され始め、約10日で成熟するはずです。記載された密度で播種した場合、成功した培養物には、マトリックス滴あたり50〜100個のスフェロイドが含まれます。内腔は、野生型CFTRのように比較的明瞭な場合もあれば、CFスフェロイドのように細胞の破片や粘液で満たされている場合もあります。スフェロイドの管腔領域を描写するためのマスキングは、これら2つのパネルで実証されています。ここに示されているのは、形成が不十分な失敗した回転楕円体培養の例です。これらの機能アッセイのグラフに示されているように、野生型CFTRの被験者のスフェロイドは、刺激を受けると1時間以上膨らむはずであり、CFTR阻害剤inh-172の存在下で刺激されると膨潤が少なくなるか縮小するはずです。F508del-CFTRのホモ接合体である被験者由来のスフェロイドは、CFTRモジュレーターVX809およびVX770で薬理学的に補正すると、膨潤の増加または縮小を伴って非常にわずかに膨らむか、または縮小が少なくなるはずです。一度習得すると、鼻細胞スフェロイドの播種は、適切に行われれば15〜20分で行うことができます。この手順を試行する際は、サンプルの汚染リスクを最小限に抑え、自分の健康へのリスクを回避するために、バイオセーフティキャビネット内のクリーンな操作手順を維持することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、固定、染色、顕微鏡検査などの他の方法を実行して、細胞の形態と組成に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、CFTR機能の個別化アッセイとして利用できる初代ヒト鼻細胞スフェロイドの作製方法について十分に理解できるはずです。主要な人間の組織を扱うことは危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切な個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

generation-human-nasal-epithelial-cell-spheroids-for-individualized

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JoVE Journal

Medicine

医学

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呼吸リハビリテーションに運動アドヒアランスを研究する継続的なデータ追跡技術を使用して

学ぶ 鼻腔上皮細胞スフェロイドの作製法。CFTR機能評価に用いる三次元培養モデルで、嚢胞性線維症の個別化医療研究に貢献します。少量の検体から多数のスフェロイドを迅速に生成可能です。

個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンスレギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

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