脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

この実験の全体的な目標は、化学誘導剤テブフェノジドの投与によって導入遺伝子の発現を調節することです。この方法は、目的の遺伝子の発現を目的の時間に目的の強度で刺激する必要がある場合など、細胞生物学および分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、導入遺伝子発現に必要なすべての要素を単一のベクター内で組み合わせることにより、化学誘導剤テブフェノジドの投与によって導入遺伝子発現を刺激できることです。

テキストプロトコルに従ってEGFPまたはANKRD13A導入遺伝子をサブクローニングした後、5〜10%FBSおよび抗生物質を添加した5ミリリットルのDMEMに新たに継代したHEK293細胞を含む4つの細胞培養皿を調製します。これらは以下、培地と呼ばれます。セルを摂氏37度に保ちます。細胞が50〜60%の密度に達したら、DNAを含む200マイクロリットルの希釈液に3マイクロリットルのトランスフェクション試薬を追加します。

反応液を室温で30分間インキュベートした後、混合物をHEK 293細胞に加えます。トランスフェクションには2つのディッシュを使用し、他の2つはコントロールとして未処理のままにします。細胞を摂氏37度で12〜24時間インキュベー

インキュベーション後、トランスフェクションしたサンプルの1つとトランスフェクションしていないコントロールの1つにTebを添加します。他の 2 つのサンプルは、実験コントロールとして未処理のままにします。プレートを12〜48時間インキュベートします。

EGFPインサートを使用する場合は、蛍光顕微鏡でEGFP発現を解析します。それ以外の場合、イムノブロッティングのために細胞を回収するには、氷冷PBSを使用して細胞を2回すすぎます。次に、セルスクレーパーを使用してプレートからそれらを取り出し、15ミリリットルの円錐管に移します。

次に、チューブを21,000倍g、摂氏18〜25度で2分間回転させます。次に、PBSを廃棄した後、0.5ミリリットルの氷冷哺乳類タンパク質抽出試薬(M-PER)とプロテアーゼ阻害剤をペレットに加えます。数回のピペッティングで細胞を再懸濁します。

次に、細胞懸濁液を摂氏18〜25度、室温で15分間インキュベートします。細胞ライセートを21,000倍のgおよび摂氏4度で10分間回転させる。次に、水性上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、適切な抗体で免疫ブロッティングして分析します。

Teb刺激を消光するには、Tebを含む培地を細胞から取り出し、予め加温したPBSを使用して細胞を2回すすぎます。次に、0.25%トリプシン/ EDTAを1ミリリットル加え、細胞を摂氏37度で1分間インキュベートします。10ミリリットルの温めたTebフリーの培地を細胞に加え、セルスクレーパーを使用して細胞を回収します。

細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を21,000倍g、摂氏18〜25度で2分間回転させます。細胞を50ミリリットルの予熱したTebフリー培地に再懸濁し、5ミリリットルの細胞を3つの60ミリメートルの新鮮細胞培養皿に移します。

細胞を摂氏37度でそれぞれ24時間、48時間、72時間インキュベートします。最後に、異なる時点で細胞を採取し、イムノブロッティングを使用して導入遺伝子の発現レベルを測定します。pEUI-plus-EGFPの活性とリーキ性を評価したこの実験では、Teb処理の有無にかかわらず、模擬ベクタートランスフェクタントは蛍光シグナルを示さなかった。

しかし、pEUI-plus-EGFPトランスフェクタントは、Tebの量の増加に対して徐々に感作されるようになりました。さらに重要なことに、Tebで処理されていないpEUI-plus-EGFPトランスフェクタントは、検出可能なEGFPシグナルを誘発しませんでした。FLAGタグ付きANKRD13Aは、Tebに対するpEUI-plusの応答性をさらに検証するために使用されました。

抗FLAG抗体を用いたこのウェスタンブロットで示されたように、トランスフェクションしたHEK 293細胞は、Tebによる24時間処理後に強いANKRD13A発現を示しました。さらに、Tebの枯渇は、Tebなしで培養した細胞ではANKRD13Aが検出されなくなったため、pEUI-plus遺伝子スイッチの可逆性を示しました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了します。

この手順を試みる際には、ほとんどすべての実験を無菌条件下で実施することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、Tet-OnまたはTet-Offシステムなどの他の方法を適用して、2つの異なる導入遺伝子を差次的に発現させることができます。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者が細胞レベルで分子生理学を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、pEUI-plus遺伝子スイッチベクターを使用して、必要な時間に、必要な強度で導入遺伝子発現を誘導する方法をよく理解できるはずです。テブフェノジドでの作業は危険である可能性があり、この手順を実行する際には、白衣を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。