Name: マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶマイクロインジェクション法によるWestern Corn Rootwormの胚操作とCRISPR/Cas9ゲノム編集技術。Diabrotica virgifera virgiferaの遺伝子機能解析と害虫防除戦略の基礎研究に応用可能です。

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この作品は、モンサント社のトウモロコシ Rootworm 知識研究プログラムからの助成金によって支えられた、NCSU から MDL に番号 AG/1005 (MDL と YC) してスタートアップ資金を与えます。(MDL) に番号 MCB 1244772 を付与する FC は、モンサント社のトウモロコシ Rootworm 知識研究プログラム (AG/1005)、全米科学財団からの助成金によって支えられました。著者は競争の興味を宣言しません。FC と MDL の考案設計実験;FC、PW、SP で行う実験。FC と MDL の分析結果FC、NG、MDL は原稿を書いていた。WCR のスクリーニングでの専門的な支援、テレサ o ' leary、ウィリアム Klobasa とステファニーと感謝します。我々 はまた飼育プロトコルを提供するラボのコロニーを確立する卵の出荷のため博士のウェイドのフランス語 (農務省、北中央農業研究所、ブルッキングズ, サウスダコタ) を感謝します。

1. コロニー レベル WCR 大人の飼育
<ol><li>WCR 大人の十分な量を取得 (500-1,000) 信頼性の高い会社や研究所から (例のための参照材料表) し、30 cm3ケージに配置。 注: 非休眠株の使用は強くお勧めします。</li>
	<li>WCR 人工飼料メーカーのプロトコル、次を準備し、38 オンスの容器に 1 cm 厚層を注ぐ (材料の表を参照してください)。混合した後、2 ヶ月未使用ダイエット 4 ° C で保存します。</li>
	<li>大人の食事 (10-15 g) とペトリ皿 (100 × 15 mm) を 30 cm3ケージに入れます。低または乾燥食品より多くの食事を追加します。</li>
	<li>水の源として水、コットン ロール (6"x 3/8")、提供する場所に保持するために使用する綿球で覆われているとフラスコ (300 mL) を置きます。低実行するときは、水を変更します。</li>
	<li>26 ° C 湿度 60% で WCR を維持し、14:10 光インキュベーターを飼育昆虫のサイクルします。</li>
</ol>2. 胚のコレクションおよび配置
<ol><li>シャーレの滅菌 100 × 15 mm2水 1% 寒天を用いた卵コレクション区域を作る。寒天が固化した後、4 ° C で保存します。</li>
	<li>最近置かれた卵を収集するには、(図 1 a) 寒天培地の表面に寒冷紗 (サイズへのカットそれぞれ) の 4 層に続いて、フィルター ペーパーの単一の層を配置します。 メモ: 寒冷紗を使用できます、漂白剤で洗浄し、オートクレーブ養生した後、初めて使用するためこれを行う必要はありません。フィルター紙は再利用されないことし、滅菌する必要はありません。</li>
	<li>できるだけ (仕事日の終わり) の日に遅く WCR ケージに卵コレクション プレートを置き、アルミ箔のテントで覆います。一晩おきます。 ケージに夜遅くコレクション区域を配置するラボのスタッフを必要とせずマイクロインジェクションの若い卵のコレクションを進め注: しなくてもライト 10 から 12 時 (14 時間) 遅れ産卵。</li>
	<li>卵コレクション区域約 8 または 9 を削除します。</li>
	<li>鉗子を使用すると、時間と水のビーカー (500 mL) の場所で寒冷紗の 1 層を拾います。(図 1 b と 1 C) を優しく攪拌によってチーズの卵を洗います。</li>
	<li>電球ピペットを使用して卵を水の別のビーカー (500 mL) に転送。卵をきれいにする 2 〜 3 倍を繰り返します。</li>
	<li>水繰越額を最小限に抑えながら、フィルター紙 (図 1) の上に卵を転送するのに電球ピペットを使用します。</li>
	<li>しっかりと確認するスライドにスライド ガラスとテープと同じ幅の短冊状に黒濾紙をカット紙産むフラット (図 2 a)。 注: 黒濾紙は、反射する光の量を減らすことによって顕微鏡下で可視性を向上させるのに役立ちます。</li>
	<li>非毒性接着剤の適用 (例えば材料の表を参照) 細い線 (図 2 b) でろ過紙。接着剤でコーティングされた卵を避けるために卵の直径よりも薄く、接着をしてください。</li>
	<li>軽く接着剤のラインに彼らのフィルター ペーパーから WCR 卵 1 つずつを移動するのに細かいブラシを使用します。接着剤で産卵を乾く前にしようし、それぞれの卵の間に少なくとも 1 つの卵の距離を保ちます。</li>
	<li>1 ろ紙スライド (図 3) に複数行の卵を置くことによって注入効率を最大化します。</li>
	<li>すべての卵をフィルター紙の上にレイアウト後のインジェクションの前にすべての接着剤が乾くまで待ちます。 注: 生殖変換と編集 CRISPR/Cas9 を介したゲノム、注入すべて胚正午 (12) 19 h 以上古い最古の胚があるよう。しかし、RNAi のため制限はありません時間、WCR で dsRNA セル間を移動することができます。実際には、RNAi のため高齢化胚がよりよい生存率で可能性があります。</li>
</ol>3. 保有するプラスミド Dna と注射針の準備
<ol><li>エンドトキシン フリーの商業を使用して高品質スーパー プラスミッド DNA の準備キット (例については材料の表を参照してください)。</li>
	<li>注射液の準備するには、各プラスミドの濃度をチェックし、ヘルパー プラスミド (250 ng/μ L 最終濃度)、ドナー プラスミド (750 ng/μ L 最終濃度)、フェノールレッド バッファー (最終濃度 20%)、結合します。渦ソリューションを簡単に、針を詰まらせることができる粒子の沈殿物に最大速度で 3 分間遠心します。</li>
	<li>ホウケイ酸ガラスの針 (外径内径 0.58 mm、10 cm 長さ 1 mm) を引く炎/ブラウン タイプのマイクロ ピペットの引き手を使用して。ストレージ、シャーレなどの明確なコンテナーの両面粘着テープで引っ張ら針を固定します。 注: マイクロ ピペットの引き手システムの使用設定があった: 熱 335、フィルを = = 4、ヴェル = 40、デル = 200、PUL = 100。</li>
	<li>バックフィル マイクロ ローダーを使用して、注射針ヒント (材料の表を参照) をピペット 0.5 - 1.0 μ L をテーパー エンドの近くの針の内部。発生した場合は、針の先端から泡を削除します。</li>
	<li>持針器に注射針を挿入します。</li>
	<li>優しく、鉗子の罰金ペアを破壊または優しく触れる/ドラッグ coverslip またはガラス スライドの先端の針の先端を開きます。 注: まだ出てくる注射ミックスを可能にする最小の開口部を持っていること (小さな開口部は一般的に高い注入圧力を必要と)。ベベル針は、彼らは既に開いているのでこの手順を必要としません。</li>
</ol>4. マイクロインジェクションと投与後のケア
<ol><li>細かいペイント ブラシを使用して、慎重に滅菌水で 1-3 個の卵の表面を湿らせる針を挿入、薬液を注入します。表面が乾く前に、それぞれの卵を注入します。成功のインジェクションを示す注入中に卵中の赤い色の少量を外観を探します。クラッシュまたは破損、空を見て、またはそれ以外の場合、注入することはできませんのすべての卵を削除します。 注: 射出圧力によって異なりますが針穴のサイズに基づいて、10-13 psi は良い出発点です。</li>
	<li>すべての卵が注入された後は、スライド ガラスからフィルター用紙を取り除きます。</li>
	<li>(上記) 1% 寒天料理の表面にフィルター紙を置きます。</li>
	<li>料理を密封し、12 日間インキュベーターを飼育 26 ° C 昆虫を置くプラスチック パラフィン フィルムを使用します。 注: パラフィン フィルムの料理の間に金型のクロス汚染を防ぐ助け。しかし、カビや細菌の増殖を防ぐために他の治療法は、注入された胚の生存率を減らすことができます。</li>
</ol>5. 培養と胚の孵化
<ol><li>孵化胚 12 日後注入をチェックを開始し、次の 2 週間毎日続けてください。</li>
	<li>発芽トウモロコシと土飼育箱に細かいブラシを使用して、幼虫を転送します。 注: 金型は、寒天料理で成長可能性がありますが、ほとんどの場合幼虫が孵化まだ。それらすべてをキャッチする金型内で慎重に幼虫を探します。いくつか幼虫は皿の蓋に移動可能性があり、結露にはまり込む可能性があります。</li>
	<li>26 ° C 以下の飼育方法25標準 WCR で幼虫を育てます。</li>
</ol>

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</ol>

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これはマイクロインジェクション precellular WCR 胚生殖細胞への変換を行うための重要なプロセスのためのベストプラクティスを確立する最初のプロトコルで RNAi を目的として二本の WCR のマイクロインジェクション報告9がずっと、および/またはこの種の編集 CRISPR/Cas9 ゲノム。WCR 胚の正常なマイクロインジェクションは、変換効率は、多くの要因に依存しています。後述はいくつかの主要な問題に影響を与えるこのカブトムシの生殖細胞の変形のためのプロトコルを使用しての結果。
Precellular 胚を取得 前述のように、DNA は方法 dsRNA が細胞膜を交差させない。つまりは重要な重要性の DNA、mRNA やタンパク質が前に cellularization を注入します。射出のタイミングが重要なので nondiapausing WCR ひずみ30胚形成を完了するのにかかる時間に基づく成功のインジェクションの可能性があります...

西部のトウモロコシ rootworm (WCR)、Diabrotica virgifera virgifera、トウモロコシ1の重要な害虫であります。興味深いことに、WCR のコントロールを克服するよう措置最も農業害虫よりも急速に以来、彼らだけでなく適応だけでなく、生理学的行動2,3,4,5, 6. 過去 10 年間、RNA 干渉 (RNAi) 強力な機能ゲノム ツール WCR7、8、潜在的な制御法として研究されている、遺伝子機能9を研究手段としても使用されています。しかし、RNAi は頻繁に他の種における二本鎖 rna (dsRNA) によって実行される、インジェクション ベース RNAi は WCR にまれであります。実際、dsRNA の WCR9にマイクロインジェクションによるRNAi の報告は少ないがあります。理由は母11に dsRNA を供給することにより胚性効果の研究を許しさえ WCR が dsRNA7,10の遺伝子ノックダウンを介して摂取の高レベルに得ることができます。このメソッドには、WCR 機能ゲノム解析によるRNAi 優秀な主題が、それはこの種の胚のインジェクションの方法論の開発の進捗状況を鈍化しています。
RNAi のパワーにもかかわらず、いくつかの欠点があります。たとえば、すべての遺伝子は RNAi に均等に対応します。この変動より困難なゲノム機能アッセイの結果を解釈することができます。また、RNAi は一時的なもの、遺伝的突然変異を生成しません。その一方で、生殖細胞変換、機能ゲノムの他のツールはマーク付きの転位因子のゲノム12,13にを介して挿入変異を生成できます。これは生殖細胞変換を長期的な遺伝学的研究で使用するため突然変異系統を作成するための優れたツールになります。変換は、変異ゲノム14遺伝子の機能的なコピーを提供することにより、突然変異を救出するも使用できます。さらに、生殖細胞変換はさまざまな分子遺伝学的手法の礎です。ノックアウトや遺伝子機能を救出、に加えてエンハンサー トラップ15、遺伝子トラップ16、Gal4 ベースの異所性発現17、およびゲノム変異18の生殖細胞への変換を使用できます。
最近では、高度なゲノムの編集を有効にするツールが開発されています。これらのツールでは、転写 Activator-Like エフェクター核酸 (TALEN) CRISPR/Cas9-ヌクレアーゼ システム19,20をご利用など。これらの新しいツールの利点は、彼らは研究者のほぼすべてのゲノム内のほぼすべての場所で二本鎖 DNA 切断を誘導する能力を提供することです。どちらか非相同末端結合、削除、または目標とされた遺伝子の挿入を導入することができます、通したり、相同性監督の修理エンジニア リング構造が存在することができますを触媒する誘導、一度これらの壊れ目を修理すること、全体の遺伝子や遺伝領域21,22の交換。ただし、これらのメソッドには、DNA、RNA および蛋白質の非常に若い胚へのマイクロインジェクションが必要があります。
重要なは、RNAi、生殖のために使用される蛋白質や核酸用二本とは異なり、変換およびゲノムの編集が、細胞膜を容易に越えることはできません。したがって、プラスミド Dna や Mrna、タンパク質のマイクロインジェクションは胞胚期 (すなわち昆虫胚 cellularizes 前に) 行われなければなりません。これは注射のタイミングを重要な要因になります。たとえば、キイロショウジョウバエ胚は卵を産む12後 2 時間以内に注入する必要があります。したがって、WCR の正常胚マイクロインジェクションのプロトコルの開発は、precellular 胚の十分な量を収集するための最良の方法だけでなく、女性の卵が産卵に最適な条件に考慮に入れなければなりません。
WCR 生物学を分子遺伝学的ツールの広い範囲をもたらすべく収集と precellular WCR 胚マイクロインジェクション法の開発が必要です。ここで我々 は WCR 研究に変換ベースの技術を使用して他人を助けるためのヒントとトリックの詳細な手順を提供します。これらのテクニックには WCR 機能ゲノム研究用トランスジェニック技術を拡張すると、に加えて、遺伝子ドライブ23,24経済的に重要なこれでテストするなど強力な新しい害虫対策も有効にします。害虫。

<table><tbody><tr><td>定性的濾紙(ブラック)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>卵マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>1オンス容器&nbsp;</td><td>Anny's プラスチック食器</td><td>ASET101</td><td>卵容器</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ寒天 II 型</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>WCR 産卵皿用基板</td></tr><tr><td>フェザーウェイト鉗子&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td>幼<td>虫と蛹の取り扱い&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロックスレギュラーブリーチ1</td><td>クロロックス</td><td>44600-30770</td><td>ウォッシュコーンと皿</td></tr>トラッカー<tr><td>のお気に入りのイエロー</td><td>クアファームサプライ</td><td>502</td>を供給し<td>ますWCR</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシステム(自家製)</td><td>NA</td><td>部品&説明書ご要望に応じて利用可能な</td><td>制御注入圧力(0-20 psi)</td></tr><tr><td>エルマーの非毒性接着剤</td><td>エルマーズプロダクツ株式会社</td><td>E304</td><td>濾紙に卵のり</td></tr><tr><td>epTIPS マイクロローダー</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>埋め戻し針 ローディングのヒント</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>発芽トウモロコシ /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;定量的グレードの濾紙サークル</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S47576C</td><td>卵産卵用の寒天皿を作る/9cm</td></tr><tr><td>スパークリーン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>04-320-4</td><td>ウォッシュディッシュ</td></tr><tr><td>プレーン顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-549-3</td><td>マイクロインジェクション用の濾紙と卵の保持</td></tr><tr><td>ウエスタンコーン 根虫 花粉なし 代替</td><td>フロンティア 農業科学&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR大人の人工ダイエット</td></tr><tr><td>コットンボール、大型</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>51-101</td>フラ<td>スコを閉じる</td></tr><tr><td>グローブサイエンティフィック3.0mL小型電球トランスファーピペットグローブ</td><td>サイエンティフィ</td><td>ック137035</td>卵<td>を収集して転送ライ</td></tr><tr><td>カM165FC蛍光実体顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>WCR上映</td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡用DsRedフィルターセット</td><td>ライカ</td><td>DSR</td><td>励起フィルター:510-560 nm、蛍光フィルター:590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFPフィルター</td><td>ライカ</td><td>GFP2</td>励<td>起フィルター:440&ndash;520 nm、発光フィルター:510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView 成</td><td>体コロニー用</td>科学<td>DP1000_5P</td>ケージ</tr><tr><td>ミニチュアペイントブラシ</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>ライナー 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>ジョイスティックマイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MN-151</td><td>マイクロマニピュレーター&ニードルホルダー</td></tr><tr><td>顕微鏡XYステージ</td><td>オリンパス</td><td>265515</td><td>顕微鏡ステージ(ステレオスコープ使用に適応)</td></tr><tr><td>グレード90 チーズクロス</td><td>オンラインファブリックストア</td><td>CHEE90</td><td>卵産用</td></tr><tr><td>プラスチックパラフィンフィルム&nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>マイクロインジェクション後の寒天皿を密封/ロール サイズ 4 インチ x 125 フィート</td></tr><tr><td>パーシバル インキュベーター</td><td>パーシバル&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR成長チャンバー(昆虫飼育インキュベーター)</td></tr><tr><td>ナローマウス三角フラスコVWR</td><td></td><td>4980-300-PK</td><td>成体コロニー用水容器&nbsp;</td></tr><tr><td>グリフィンローフォームビー</td><td>カーVWR</td><td>1000-600-PK</td><td>卵洗浄編</td></tr><tr><td>組コットンロールス</td>用リッチ<td>モンドデンタルコットン株式会社</td><td>605-3599</td><td>成体コロニーの給水での使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>ダイエットプレート用</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td>143-78-8</td><td>マイクロインジェクションバッファー</td></tr><tr><td>レーザーベースマイクロピピエットプーラー</td><td>サッター器具</td><td>P-2000/G</td><td>ニードルプーラー/熱=335、FIL=4、VEL=40、DEL=200、PUL=100</td></tr><tr><td>プレミアム表土</td><td>スコッツ社</td><td>71130758</td><td>クロン栽培</td></tr><tr><td>用土壌Relocジップピット2ミルジッパーバッグ</td><td>米国プラスチックコーポレーション</td><td>48342</td><td>バッグ寒天皿マイクロインジェクション/ 5x7</td></tr><tr><td>ペトリ皿(100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>卵産卵用寒天皿/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6オンスコンテナ</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCRシングルペア嵌合チャンバー&nbsp;</td></tr><tr><td>38オンスコンテナ</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td>幼<td>虫飼育ボックス/38オン</td></tr><tr><td>スChoiceHD 16オンス電子レンジ対応半透明プラスチックデリコンテナ</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td>幼<td>虫飼育ボックス/16オン</td></tr>ス<tr><td>マイクロインジェクションスコープ&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>XYステージを装備したマイクロインジェクションスコープ</td></tr><tr><td>標準ガラスキャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B100F-4</td><td>マイクロインジェクション針</td></tr><tr><td>大人のウエスタンコーン 根虫</td><td>ノースセンターアクリカルチャー研究 研究室</td><td>非ジアパーゼ株</td><td>ブライアン・ウェイド博士からのリクエスト フレンチの研究室</td></tr><tr><td>プラスミドDNA MIDIキット</td><td>キアゲン</td><td>12143</td><td>注射用プラスミドDNAの精製</td></tr></tbody></table>

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ rootworm、 diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または crispr/cas9 ゲノム編集

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

西部のトウモロコシ rootworm (WCR) トウモロコシの重要害虫であり害虫管理戦略に迅速に適応する能力があることが知られています。RNA 干渉 (RNAi) WCR 生物学を勉強するための強力なツールであることを証明している、それはその限界を持っています。具体的には、RNAi 自体は一時的なもの (すなわちわけで関連する表現型の長期的なメンデル遺伝)、それはターゲット遺伝子の DNA 順序を知る必要があり、。後者ために制限があります興味の表現型が悪い、節約またはも新規の遺伝子によって制御される場合便利なターゲットの識別に挑戦するが、不可能ではない場合。WCR のゲノム] ツールボックスのツールの数は、安定した突然変異系統を作成し、WCR ゲノムのシーケンスに依存しない調査を有効にするために使用できる手法の開発が拡大する必要があります。ここで、収集し、核酸 precellular WCR 胚を microinject するために使用方法を詳しく説明します。ここ記載されているプロトコルは、トランスジェニック WCR の創出を目指したが、一方 CRISPR/Cas9-ゲノム編集も実行でした唯一の違いは、胚に注入液の組成と同じプロトコルを使用しています。

このプロトコルを開発するときの重要な考慮事項は、マイクロインジェクションの時に萌芽期の開発の段階をだった。具体的には、生殖細胞系列変換は萌芽期の cellularization の前に dna マイクロインジェクションを必要です。これは、Dna が細胞膜を容易に通過できないためにです。WCR 胚の dechorionation は本質的にすべての胚の完全性に責任がある保護膜を溶解するため、WCR 核染色を使用して萌芽期の開発の段階を視覚化する試みは成功しなかった。ただし、このラインの問い合わせは、タイムリーに胚の十分な量を取得 – 別の難しさに取って代わられました。フィールドに、WCR 女性は土に卵を産む、従ってそれ驚きべきである、演習では、女性のみ卵を産む暗闇の中。これは短い昼間コレクション (2-4 h) を困難になります。この問題を克服するために単一の一晩卵レイは行ったし、胚の大量をもたらすことがわかった。(図 1) を収集し、インジェクションのため (図 2</s...

ここで rootworm 胚生殖細胞変換や CRISPR/Cas9-ゲノム編集など機能ゲノム試金の実行の目的のため収集、マイクロインジェクション precellular 西部のトウモロコシのためのプロトコルは提示します。

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

このマイクロインジェクションプロトコルの全体的な目標は、Western Corn Rootwormのゲノムを改変することです。この方法は、西洋トウモロコシ根虫の生物学と、BT毒素やRANIなどの害虫駆除方法を迅速に克服する能力に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。Western Corn Rootworms以外にも、この方法はSouthern RootwormsやNorthern Rootwormsなどの類似種にも適用できます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、90年代にWestern Corn Rootwormの注射ベースのRANIを手伝うように頼まれたときです。一般的に、この方法に不慣れな人は苦労するでしょう。実験室で西洋トウモロコシの根虫を飼育することは労働集約的だからです。また、現在の技術では生存率は低いままです。信頼できる会社または研究所から500〜1, 000匹の非休眠性根虫の成虫を入手してください。そして、30立方センチメートルのケージにそれらを収容します。標準的な根虫人工食を深さ約1センチの食品保存容器に保管します。未使用の食事は、摂氏4度で最大2か月間保存できます。根虫に餌をやるには、100センチのペトリ皿に10〜15グラムの食事を入れます。各根虫ケージに1皿の餌を入れます。そして、供給が少なくなったり、食事が乾いたりしたときにそれを補充します。また、各ケージには、綿球で覆われた300ミリリットルの貯水池を水源として保管してください。水が少なくなったら交換してください。ケージに入れられた根虫を摂氏26度、湿度60%、昆虫飼育インキュベーターで14/10の光サイクルに維持します。深夜など、一日の遅い時間に照明を消す時間を設定して、朝の勤務時間前に卵を産むようにします。まず、胚を採取します。採卵面の場合は、100ミリメートルのシャーレに30ミリリットルの1%寒天と水をロードします。次に、寒天の上に濾紙を1枚重ね、続いてチーズクロスを4枚重ねます。各レイヤーはサイズに合わせてカットする必要があります。次に、できるだけ遅く、採卵プレートを根虫ケージに入れ、アルミホイルテントで覆います。その後、翌朝、採卵室を取り外します。鉗子を使用して、一度に1層のチーズクロスを拾い上げ、水を入れた500ミリリットルのビーカーに入れます。水の中で渦を巻いてチーズクロスから卵を洗い流します。次に、球根ピペットを使用して、卵を別のビーカーの水に移し、洗浄ステップとしてします。この方法で2〜3回の洗浄を行います。次に、きれいにした卵をできるだけ水を入れない濾紙に置きます。次に、コントラストを改善するために、黒い濾紙をスライドに平らにテープで留めてスライドを準備します。次に、卵を固定するために使用される紙に無毒の接着剤の細い線を振りかけます。接着剤を卵の周囲の下に保管します。のりが濡れている間に、細いブラシを使用して卵をのりのラインに置きます。各卵の間に少なくとも1つの卵の距離を保ちます。スライドごとに複数の卵のラインを準備します。卵子は30分以内に注入する必要があります。次に、ヘルパープラスミド、ドナープラスミド、およびフェノールレッドバッファーを組み合わせます。エンドトキシンフリーの市販キットで作られた高品質のスーパーコイルプラスミドを使用してください。Fortexを少し混ぜます。そして、微粒子を最高速度で3分間回転させます。次に、0.5〜1マイクロリットルの注射液で引っ張ったホウケイ酸ガラス針を埋め戻します。気泡が発生した場合は、必ず取り除いてください。次に、注射針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、必要に応じて顕微鏡下で、細い鉗子を使用するか、先端をガラスバリアにそっと触れて、密封された針先をそっと折ります。注入液を放出する開口部をできるだけ小さくするようにしてください。根虫の卵を注入する前に、細かい絵筆を使用して、準備した卵1〜3個の表面を滅菌水で慎重に濡らします。次に、接液した胚を注入します。針を胚の中央にそっと挿入し、少量の溶液を注入します。10〜13psiの圧力を使用することから始めて、必要に応じて圧力を調整します。乾燥胚は独特の丸い形をしており、各胚を水で事前に濡らすと、その形状が変わり、卵殻が柔らかくなり、針が容易に浸透できるようになります。成功した注入された胚は、少量の赤い色をしています。卵が損傷していたり、特異なように見えたり、注入できない場合は、卵をつぶすかスライドから取り出します。すべての卵が注入されたら、卵を載せた濾紙を1%寒天皿に移します。次に、皿をパラフィンフィルムで密封し、幼虫が孵化するまで摂氏26度でインキュベートします。注射の12日後、次の2週間は毎日幼虫のチェックを開始します。幼虫を細いブラシを使用して、発芽したトウモロコシと土を入れた飼育ボックスに移し、標準的な条件下で飼育します。根虫の生殖細胞系形質転換は、プラスミドを運ぶトランスポゼースとプラスミドを運ぶトランスポゾンを前細胞胚に同時注入することによって試みられました。生存者26人では、各EFP発現がドナー要素の挿入をスクリーニングするために使用された。胸部の子孫は特定されましたが、強い光源で根虫の胚をスクリーニングすることは致命的であることが証明されました。次の生殖細胞系形質転換では、Drosophila melanogaster由来の構成活性プロモーターによって駆動される赤色蛍光タンパク質遺伝子を利用しました。生存率は改善しましたが、DSレッド陽性の幼虫は1匹しか記録されませんでした。次に、胚にバッファーのみ、またはヘルパーおよびトーレセントマークされたドナーDNAプラスミドをマイクロインジェクションしました。プラスミドまたはバッファーのみを注入した場合に孵化した胚の比率は同程度です。そして興味深いことに、注入されていない胚の約半分しか孵化しませんでした。これにより、注射のために胚を操作することの致死性は、注射を行うことと同じくらい高くなりました。このビデオを見た後、Western Corn Rootwall胚をマイクロインジェクションする方法をよく理解しているはずです。一度習得すると、この技術を使用して1時間に2〜300個の胚を注入できます。この方法は、ショウジョウバエの生殖細胞系変換のために開発された技術に負うところが大きく、これは他の多くの種に適用可能なテンプレートとして機能します。この手順に続いて、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集などの他の方法を実行して、Western Corn Rootwallのゲノムに標的変異を作成することができます。ゲノム機能に関する具体的な疑問にお答えするため。

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

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