分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

このランダム突然変異の全体的な目標は、ヘテロクロマチンを不安定化する突然変異をスクリーニングすることです。この方法は、ヘテロクロマチンの形成と維持を調節する因子など、ヘテロクロマチン分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子が必須であっても、突然変異誘発のために目的の遺伝子を特異的に標的にできることです。

まず、この表に示すように成分を混合することにより、サプリメントを含む酵母抽出物、またはアデニンを含まない酵母抽出物、またはアデニンを含まないPombe Glutamate Medium、またはPMG、およびPMGを準備します。オートクレーブし、必要に応じてG418を追加した後、培地をさらに5〜10分間攪拌します。次に、メディアを90ミリリットルのペトリ皿に分注し、プレートを摂氏4度で保存します。

クローニングされたrpt4陽性は、5つのプライムUTRと3つのプライムUTRとサイレント変異、プライマーp5とp6、および高いエラー率を生成するように設計された特別なポリメラーゼを使用して、合計50マイクロリットルのエラーが発生しやすいPCRを実行します。形質転換融合コンストラクトを生成した後、テキストプロトコルに従って、10ミリリットルのYES培地に酵母を接種し、飽和するまで16時間以上インキュベートします。200ミリリットルのYES培地を使用して細胞をOD600 0.2に希釈し、培養物を摂氏30度でインキュベートし、5〜6時間振とうしてOD600を0.6〜0.8にします。

合計がOD600の30になるセルの体積を計算します。次に、細胞を4本の50ミリリットルの円錐管に分注し、氷上で10分間冷却します。1050 G、摂氏4度で3分間遠心分離することにより、細胞を回収します。

次に、カセットDNAと10個の電気キュベットを入れたマイクロチューブを氷の上に置きます。氷の上に置いたまま、上清を捨て、1.2モルソルビトール15ミリリットルを加え、チューブを静かに振って細胞を再懸濁し、細胞を1050Gおよび摂氏4度で3分間遠心分離します。上清を捨て、2回目のソルビトール洗浄を行います。.

遠心分離後、上清を捨てます。次に、細胞を再懸濁し、15ミリリットルの円錐管にすべてを集めます。次に、1.2モルソルビトールを2.4ミリリットルまで追加します。

細胞のチューブを氷の上に保ちます。次に、200マイクロリットルのソルビトール懸濁細胞を融合PCRコンストラクトを含むチューブに加え、よく混合し、サンプルを電気キュベットに移します。PCRカセットを過剰に使用しないことが重要です。

次のオプションを使用してセルをエレクトロポレートします:各エレクトロキュベットに600マイクロリットルの1.2モルソルビトールを追加して、合計量を800マイクロリットルにします。次に、細胞を4つのYESプレートに広げます。プレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。

次に、YESとG418でレプリカプレーティングを行い、プレートをさらに3日間インキュベートします。YESとG418プレートを併用するごとに、アデニンなしのYESとアデニンプレートなしのPMGにレプリカめっきを行います。レプリカプレートを摂氏30度で1〜2日間インキュベートし、アデニンプレートのないYESのコロニーの一部が白色を示すまでインキュベートします。

アデニンなしのYESとアデニンプレートなしのPMGを比較し、アデニンプレートなしのYESでピンク色または白色を示す細胞を選択し、アデニンプレートなしのPMGでも増殖する細胞を選択します。アデニンを含まないPMGで増殖しないコロニーは偽陽性であるため、選択しないでください。各コロニーを選び、それをザイモリアーゼ100Tのミリリットルあたり2.5ミリグラムを含むSPZ溶液の10マイクロリットルに加えます。

次に、コロニーを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。インキュベーション後、この溶液の1マイクロリットルをコロニーPCRの開始テンプレートとして使用します。選択したコロニーを消化し、テキストプロトコルに従ってゲル電気泳動を行った後、XHO1によってPCR産物が切断されたコロニーをマークし、YESとG418プレートにパッチします。

分裂酵母細胞からのgDNAの単離、およびテキストプロトコールに従ってPCR産物のシーケンシングを行った後、得られた配列を野生型配列と比較して変異を同定します。突然変異が野生型細胞に再導入されたら、スポッティングを使用して、新しく作成された突然変異細胞の表現型を確認します。このビデオで示されているプロトコルを使用して生成されたrpt4変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。

この図に示すように、コロニーは関連するプレート上に発見され、細胞数は減少しています。ヘテロクロマチン領域に挿入されたアデニンレポーターは、野生型細胞でサイレンシングされ、アデニンプレートのないYES上に赤色のコロニーを産生します。ヘテロクロマチンが不安定化し、アデニンレポーターが発現すると、clr4-delta変異体で見られるように、アデニンプレートのないYES上に白いコロニーが観察されます。

スクリーニングされたrpt4変異体は、rpt4-1変異体が最も深刻なヘテロクロマチンの不安定化を示すことを示すことが示されています。このテクニックを習得すれば、2週間で目的のミュータントを手に入れることができます。この手順を試行する際は、誤検知が予想よりも頻繁に発生するため、誤検知を排除することが重要です。

この手順に続いて、タンパク質の性質などの追加の質問に答えるために、タンパク質精製や酵素活性試験などの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、目的の表現型を持つ標的遺伝子の変異体を生成する方法についてよく理解できるはずです。