Name: 分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶ 分裂酵母におけるランダム変異導入法で、ヘテロクロマチン不安定化変異をスクリーニングする手法です。rpt4+遺伝子を標的とし、エピジェネティクス制御機構の解明に貢献します。

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このプロジェクトの支援の資金調達は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (2016R1A2B2006354) によって資金を供給によって提供されました。

1. 媒体の作製
<ol><li>準備酵母エキス サプリメント (はい)、はいアデニン (はい低 Ade)、酵母のグルタミン酸媒体 (PMG12) および PMG なしアデニン (PMG Ade) なしの表 1に示すようにコンポーネントを混合することによって。はいエイド (低 Ade) と PMG Ade プレートがすべての同じコンポーネント、アデニンを後者から省略すると。<ol>
<li>次の塩 (50 x) ストックを使用: 52.5 g/L MgCl2·6H2O、2 グラム/L の CaCl2·2H2O、50 g/L 塩化カリウム、2 グラム/L の Na24蒸留水です。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存</li>
		<li>次のビタミンを使用して (1、000 x) 在庫: 1 g/L パントテン酸 10 g/L ニコチン酸、イノシトール 10 g/L、蒸留水で 10 mg/L ビオチン。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存</li>
		<li>次の鉱物を使用 (10, 000 x) 在庫: ホウ酸 5 g/L、4 g/L MnSO4、4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L した FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L KI、0.4 g/L CuSO4·5H2O、蒸留水の 10 g/L のクエン酸。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存 注: はい液体培地を寒天を省略することで可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オートクレーブ中 200 rpm の速度での攪拌棒で攪拌しながら 60 ° C 以下に冷却します。</li>
	<li>はい + G418 (ジェネティシン) プレートはい中 1 mL/L G418 原液を追加します。<ol>
<li>次の G418 を使用 (1、000 x) 在庫: 100 mg/mL G418 蒸留水で。フィルター滅菌-20 ° C で 0.22 μ m の細孔径のフィルター、およびストアの 1.5 mL 遠心チューブに分注を使用して</li>
	</ol>
</li>
	<li>90 mm シャーレ (約 40 シャーレ中の因数の 1 L に別の 5-10 分、因数のメディアをかき混ぜる.4 ° C でプレートを保存します。</li>
</ol>2. クローンのrpt4 +とその 5/3' UTRs
<ol><li>プライマー p1 と p2 で PCR を行う (図 1 a) (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとしてゲノム DNA (gDNA) を酵母分裂を使用して、3,315 ベースを増幅して表 2に示す反応サイクルを適用します。ペア (bp) のフラグメントは、 rpt4 +とその 5/3' UTRs で構成されます。PCR の製品の浄化キット13を使用して (図 1 a) の製造元の指示に従ってを浄化します。</li>
	<li>PBlueScript KS(-) ベクトル14と 16-18 の水浴の 37 ° C でrpt4 +とその 5/3' BamH1とXho1 UTRs 20 μ L (〜 1 μ g の DNA、20 U 酵素、1 x 消化バッファー) の総量を含む増幅された DNA 断片をダイジェストします。h (図 1 b)。</li>
	<li>ゲル浄化消化ベクトル (1.2% の agarose のゲル)、DNA を挿入 TAE を用いたアガロース電気泳動 (100 V、1 h) を実行する、任意の大きさの DNA バンドを切除し、ゲル抽出キット15で DNA を分離することです。</li>
	<li>ベクトルとベクトル DNA の 50-100 ng を含む 20 μ L の ligation の反作用を実行することによって T4 DNA リガーゼを使って DNA 挿入を縛る、~ 3 倍モル過剰挿入 DNA、400 U T4 DNA リガーゼと結紮バッファー × 1。16-18 h の 18 ° C でこの混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>70 の熱ショックを適用することによって大腸菌DH5α の 100 μ L に結紮の DNA を変換 42 ° C で sポンドの 1 つの mL を追加し、回復の 37 ° C で 1 時間インキュベートします。遠心分離 (13,800 x g) を実行、変換されたエシェリヒア属大腸菌のすべてが LB アンピシリン (ラ) プレート細胞培養上清、, 16 h の 37 ° C で板を破棄します。</li>
	<li>つまようじで 4-8 コロニーをピックアップし、37 ° c 3 mL ラ中で一晩成長します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って使用されるプラスミド精製キット16で、プラスミドを分離し、孤立したプラスミド (BamH1と各制限酵素の 5 U の 5 μ L で分析の制限の酵素の消化力を実行Xho1) と制限バッファー × 1。3 h 候補プラスミドを配列することによってクローニング確認の水浴の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
</ol>3. サイレント突然変異 (Xho1制限サイト) の導入
<ol><li>それ以外の場合補足シーケンスの望ましい突然変異を含む 33 bp プライマー (p3 および p4) のペアを設計します。</li>
	<li>25 μ L の総ボリューム内の忠実度の高いポリメラーゼ17 (図 1) と PCR を行う (10 複製プラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng) サイクリングのパラメーターを使用して表 3に記載されています。</li>
	<li>Dpnを 1 時間水に 37 ° C で 20 μ L (20 U 酵素, 1 x 消化バッファー) の容量でお風呂が付いているテンプレート プラスミッドを消化します。</li>
	<li>変換、伝達、分離、および 2.5 2.7 の手順に記載されている、サイレント突然変異を含んでいるプラスミッドをシーケンスします。 注:18の単一の反作用の複数の DNA のフラグメントの結合に関することができますクローンの作成方法を使用しても、サイレント突然変異を導入できます。</li>
</ol>4 rpt4 +エラーを起こしやすい PCR によるランダム変異導入
<ol><li>テンプレート、プライマー p5、p6、50 μ L (4.1.1 10 pmol プライマー ミックス、2.5 U 酵素、1 x 反作用バッファーの 2 μ L のステップで定義したテンプレートの量) の総量と、プラスミドを用いたサイレント突然変異 (Xho1サイト)、エラーを起こしやすい PCR を実行します。、高いエラーを生成するために設計されている特別なポリメラーゼ率19 (図 1)。表 2に説明されているように、PCR を実行します。<ol>
<li>4-5 μ g のプラスミド テンプレートを使用して、1 bp/kb (プラスミド) に突然変異の頻度を制御します。 注:高濃度 (> 500 ng/μ L) プラスミド ミニ準備キット20を使用して入手することが、必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動を使用して 2670 bp (1.2% の agarose のゲル) の PCR の製品を確認します。ゲルは、2.5 の手順で説明されているようにこの PCR の製品を浄化します。</li>
</ol>5. フュージョン PCR のフラグメント (菅、3' UTR) の準備
<ol><li>テンプレート、プライマー p7 と p8, pFA6a KANMX621を使用して PCR を行い、マーカー (菅) フラグメントを取得する表 4 に記載されている条件。ゲルは、2.5 (図 1E) の手順で説明するように結果 1,480 bp のフラグメントを浄化します。<ol>
<li>突然変異とその隣接遺伝子のコーディングの地域を対象とする遺伝子の終止コドンが 500 以上で区切られたかどうかチェックしてください bp。この地域が 500 未満の場合は、内因性のターミネータを使用できません bp;むしろ、内因性のターミネーターではなくADHターミネータを使用ください。ADHの終端文字を使用するために必要なプロトコルの変更は、表 5に掲載されています。 注:これらの変更は、内因性のターミネーターではなく pFA6a 3HA KANMX6 プラスミドであり、 ADHの終端記号を使用する場合にのみ適用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クローンとrpt4 +PCR を実行-テンプレートとプライマー p9、p10 の総量が 50 μ L のベクターを含む (20 クローンのプラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng)、表 6に提示条件を使用して。ゲルは、得られた 506 bp 3' UTR フラグメント (図 1E) を浄化します。</li>
</ol>6. 融合 PCR (図 1E) による変換のコンス トラクターの生成
<ol><li>50 ng/μ L で 3 フラグメント (人為rpt4 +菅、および 3' UTR) を準備します。</li>
	<li>表 7 に記載されている 3 つの PCR プライマー p11 と p12 を使用して片融合を実行します。(フュージョン PCR のためのプロトコルは元プロトコル22の変更) です。主要な 4,398 bp の PCR の製品を浄化します。<ol>
<li>Rpt4 +を使用: KAN:3'UTR の 1 の割合で断片: 3:1 最適な結果を得るのため。 注:挿入 DNA の総量が 500 を超えない ng。Rpt4 +の推奨量: KAN:3'UTR は 50 ng:150 ng:50 ng。人為の領域は、他の 3 つに変異が各拠点のすべての可能な組み合わせを占めるイースト コロニーの最小数は 1,600 x 3 = 4,800 約 1.6 kb の植民地。変換反応の 1 つは通常 400-500 コロニーを生成、ため融合 PCR を構築の価値が少なくとも 10 の反応が必要です。10 の要因によって単に反応量 (すなわち、 PCR チューブの数) を増やすことによってこの必要性を満たすことが。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 電気穿孔法 (図 1 f) による分裂酵母の変換
<ol><li>16 時間以上インキュベートし飽和する [はい] 媒体の 10 mL には、酵母を接種します。</li>
	<li>600 の光学濃度に細胞を希釈はい中の 0.2 で 200 mL の nm (外径600), 外径600 5-6 時間振とうしながら 30 ° C で、= 0.6 - 0.8。</li>
	<li>外径600細胞を集中 = 30、4 つの 50 mL の円錐管に省略し、10 分間氷で冷やします。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 1,050 × g で遠心分離を行い、細胞を収穫します。チューブと 10 電気キュベットを氷の上に配置します。氷上 7.3 7.8 の手順に従います。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1.2 M ソルビトールの 15 mL を加えます。細胞を再懸濁しますチューブを軽く振る。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 1050 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>7.4 と 7.5 の手順を繰り返します。上清を捨てます。各管に 1.2 M ソルビトールの 500 μ L を追加、細胞を再懸濁します、1 つ 15 ml の円錐管の細胞のすべてを収集します。</li>
	<li>1.2 M ソルビトールを追加 2.4 mL (外径600 = 0.2 mL あたり 10)。氷の上の管を保ちます。</li>
	<li>(彼らは十分に中断された確認) ソルビトール中断セルを 200 μ l 添加フュージョン PCR を含む EP 管の構築、ミックスも、および電気キュベットにサンプルを転送します。</li>
	<li>Electroporate 次のオプションを持つセル: 菌類、ShS (2.00kV、1 パルス)。</li>
	<li>800 μ L の総ボリュームの場合は、各電気キュベットに 1.2 M ソルビトール 600 μ L を追加し、広がる 4 つはいプレート (200 μ L/プレート) のセル。10 電気キュベットをはいプレート 40 に分配されます。</li>
	<li>30 ° C 24 時間で版を孵化させなさい。</li>
	<li>はい + G418 レプリカ メッキを行い、3 日間の 30 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>8. 各種ヘテロクロマチン不安定変異体や偽陽性を確認
<ol><li>各はい + G418 プレート レプリカ メッキはいエイド (低 Ade) と PMG エイド (いいえ Ade) プレートを実行します。はい Ade プレート上の植民地のいくつかは赤い着色 (図 1) を示すまで 30 の ° C で 1-2 日のレプリカ版を孵化させなさい。</li>
	<li>比較はい Ade と PMG Ade のプレート地図はい Ade プレートにピンクや白、PMG Ade プレートでも育つセルを選択します。彼らは偽陽性 (例えば、菅カセットがゲノムの他の非ターゲット ・ サイトで統合されていることを反映して)、PMG エイドに成長せずコロニーを選択しないでください。</li>
	<li>各植民地から約 1 x 10 の5セルを選ぶし、SPZ 溶液 2.5 mg/mL ザイモリエイス 100 T コロニー PCR (図 1 H) の開始テンプレートとしてを実行するこのソリューションの少なくとも 30 分使用 1 μ L の 37 ° C で 10 μ L で孵化させなさい。<ol>
<li>15 mL の蒸留水 (最終 pH 7.5) 0.95 mL NaH2PO4 1 M Na2HPO44.05 mL 2 M ソルビトール 30 mL を混合することによって SPZ (50 mL) を作る。サンプル (5 mL) をザイモリエイスを補充し、使用するまで 500 μ 因数-20 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動 (1.2% の agarose のゲル、180 v、20 分) の結果 + コロニー PCR を視覚化するを実行します。適切なサイズの PCR バンドを展示、 Xhoと各反応生成物の 5 μ L を消化反応を選択 (4 U 酵素、1 x 消化バッファー、37 ° C の水浴、1 h) 偽陽性 (図 1 H) を選別する私。</li>
	<li>XhoIダイジェスト (1.2% の Agarose のゲル、180 V、20 分) を視覚化するゲルの電気泳動を行います。コロニー PCR 製品XhoI、によってカットされ、はい + G418 プレート (図 1I) それらをパッチをマークします。</li>
	<li>分裂酵母細胞から gDNA を分離し、PCR の製品23のシーケンスを実行します。(図 1I) の突然変異を識別するために野生型シーケンスで得られたシーケンスを比較します。</li>
	<li>直接融合構造変異細胞23から PCR によって増幅にそれらを変換することによって野生型細胞に遺伝を再導入します。スポッティング スコープを使用すると、新しく作られた突然変異体の細胞 (図 1 j) の表現型を確認できます。<ol>
<li>プライマー p1 と p10 簡単に融合変換コンス トラクター PCR によって増幅することができます (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとして変異体のゲノム DNA を使用し、表 2 に記載されている反応サイクルを適用.コンス トラクターの変換は、7.1 7.13 の手順で行うことができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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エラーを起こしやすい PCR によってランダムな突然変異は、特定の地域の突然変異体の多様なプールを生成するための強力なツールです。この手法は、特定の状況下でのタンパク質の機能を査定しようとする研究の場合に特に便利です。たとえば、我々 はここヘテロクロマチン メンテナンスで、Rpt4、19 秒プロテアソーム サブユニットの機能を評価するためにエラーを起こしやすい PCR を使用しました。変化させることによりエラーが発生しやすい PCR の対象となる地域、関心と所望の表現型のためのスクリーンのゲノム領域で細胞を変異させるができた、スクリーニング条件を調整すること。最近では、同様のメソッドは、スピンドル極体コンポーネント25の遺伝子変異分裂酵母細胞を分離する使用されました。
ランダムな突然変異の主な利点は、非本質的な必要不可欠な遺伝子に適用される可能性です。必須遺伝子のランダムな変異は、細胞生存率を維持することができる微妙なおよび/または部分の機能的な欠陥を持つものなど、多様な変異体またはその関数は特定の条件下でのみ影響を受ける変異をもたら...

順遺伝学は、研究者が特定の表現型を表示する自然発生する突然変異体を求めるし、遺伝学的解析を行う古典的な方法です。逆遺伝学の興味の遺伝子に突然変異を導入し、表現型を検討します。後者の場合、ターゲット遺伝子のランダムな変異は突然変異体感温性などの所望の表現型を選択、その後または酵素活性の変更のプールを生成するよく使用されます。エラーを起こしやすい PCR1を含むランダムな突然変異の誘発を達成するために様々 な方法を使用する場合があります。UV 照射2;亜硝酸3; メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学変異原物質mutD5 4の発現などの一時的なミューテーター系統の使用DNA シャフリング5。
ここでは、分裂酵母のターゲット遺伝子の突然変異体のプールを生成するエラーを起こしやすい PCR を利用逆遺伝学的方法をについて説明します。1 つは、その名前から推測かもしれない、この方法意図的に PCR の間にエラーが発生して突然変異を生成します。他の突然変異誘発の方法とは異なりエラーを起こしやすい PCR はある突然変異誘発する領域を定義するユーザーをことができます。これにより、目的のタンパク質/ドメインの機能を勉強する努力に特に役立ちます。
このランダム変異導入手順を示すためには、我々 ここrpt4 +を使用分 19 秒プロテアソームのサブユニットをエンコードし、例として。Rpt4 分裂酵母6,7,8,9, 以外の生物のタンパク質分解に依存しない機能を持っている示されている、タンパク質分解の欠陥の原因タンパク質を変えることによって間接効果レベル。我々 は、したがって、ヘテロクロマチンのプロテアソームの機能の調査の目標の分解に依存しない変更を引き起こした突然変異体のスクリーニングします。
エラーを起こしやすい PCR プライマーのバインド場所をチューニングすることによって遺伝子領域に適用できます。目的の表現型変更を示す変異体は、適切な記者と識別できます。ここでは、我々 は挿入、 ade6 +記者を利用、セントロメア 1 外側を繰り返す (otr) 地域10。11この地域では、構成のヘテロクロマチンを形成すると、野生型条件でade6 +記者を黙らせたのでこれは、赤色のコロニー10で示されます。動原体で構成のヘテロクロマチンを不安定化突然変異は、白人の植民地として可視化ade6 +記者、発現に します。

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>アデニン硫酸塩</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>ウラシル&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>フタル酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>イノシトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull;7H2O&nbsp;</td><td>純正</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull;4H2O</td><td>関東</td><td>CB8943686</td><td></td></tr>モ<tr><td>リブデン酸ナトリウム二水和物</td><td>薬栗</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>木</td><td>純正</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull;5H2O</td><td>薬久里</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-ミオイノシトール</td><td>MP バイオメディカル</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>パントテン酸</td><td>薬栗</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>ニコチン酸</td><td>Σ-アルドリッチ</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>生体塩基性</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418、遺伝性</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>2。Enzyme reactions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>部位特異的突然変異導入用</td></tr><tr><td>GeneMorphII ランダム突然変異導入キット</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>エラーを起こしやすいPCR</td></tr><tr><td>用 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp;DNAポリメラーゼ</td><td>タカラ</td><td>RR001b</td><td>一般PCR用</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>DPN1</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3.設備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen正方形、黒</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>レプリカ用</td></tr>レプリカ<tr><td>メッキツール</td><td></td>VWR25395-380<td></td><td>レプリカ</td></tr><tr><td>MicroPulserエレクトロポ</td><td>レーターBiorad</td><td>1652100&nbsp;</td><td>分裂酵母の形質転換に</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット、0.2 cmギャップ</td>バイオ<td>ラッド</td><td>1652086&nbsp;</td><td>分裂酵母の形質転換に</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>融合PCRランプ反応用&nbsp;</td></tr></tbody></table>

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

ターゲット遺伝子のランダムな変異は、所望の表現型をもたらす突然変異を識別するために使用されます。ランダム変異導入を達成するために使用できるメソッドのエラーを起こしやすい PCR は突然変異体の多様なプールを生成するための便利で効率的な戦略 (すなわち。、変異ライブラリー)。エラーを起こしやすい PCR は、影響を受けない他のゲノム領域を残しながら遺伝子のコーディングの地域などの定義済みの領域の変異するように努める研究者選択の方法です。変異ライブラリーは、エラーを起こしやすい PCR によって増幅は後、に適切なプラスミド複製する必要があります。エラーを起こしやすい PCR によって生成されたライブラリのサイズは、クローン作成のステップの効率によって制限されます。ただし、分裂酵母、分裂酵母、クローン作成のステップは非常に効率的なワンステップ融合変換の構成要素を生成する PCR を使用して置き換えることができます。所望の表現型の変異体は、適切な記者を使用して選択できます。ここでは、我々 例、動原体ヘテロクロマチンに挿入されるレポーターとしてこの戦略を詳細をについて説明します。

以下の図 1に示した手順で取得した Rpt4 変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。コロニーの色が図 2の細胞数の減少に関連するプレートに斑点を付けます。異質染色質領域に挿入ade6 +記者は、野生型の沈黙し、はい Ade プレートで赤色のコロニーを示しています。Ade6 +記者の表現をヘテロクロマチンを不安定にして、一度、 clr4Δ変異体のようにはい Ade プレートで白人の植民地を観察できます。スクリーンの Rpt4 変異体では、とおりです。rpt4 1の変異体は、ヘテロクロマチンの最も深刻な不安定化を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57...

この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

このランダム突然変異の全体的な目標は、ヘテロクロマチンを不安定化する突然変異をスクリーニングすることです。この方法は、ヘテロクロマチンの形成と維持を調節する因子など、ヘテロクロマチン分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子が必須であっても、突然変異誘発のために目的の遺伝子を特異的に標的にできることです。まず、この表に示すように成分を混合することにより、サプリメントを含む酵母抽出物、またはアデニンを含まない酵母抽出物、またはアデニンを含まないPombe Glutamate Medium、またはPMG、およびPMGを準備します。オートクレーブし、必要に応じてG418を追加した後、培地をさらに5〜10分間攪拌します。次に、メディアを90ミリリットルのペトリ皿に分注し、プレートを摂氏4度で保存します。クローニングされたrpt4陽性は、5つのプライムUTRと3つのプライムUTRとサイレント変異、プライマーp5とp6、および高いエラー率を生成するように設計された特別なポリメラーゼを使用して、合計50マイクロリットルのエラーが発生しやすいPCRを実行します。形質転換融合コンストラクトを生成した後、テキストプロトコルに従って、10ミリリットルのYES培地に酵母を接種し、飽和するまで16時間以上インキュベートします。200ミリリットルのYES培地を使用して細胞をOD600 0.2に希釈し、培養物を摂氏30度でインキュベートし、5〜6時間振とうしてOD600を0.6〜0.8にします。合計がOD600の30になるセルの体積を計算します。次に、細胞を4本の50ミリリットルの円錐管に分注し、氷上で10分間冷却します。1050 G、摂氏4度で3分間遠心分離することにより、細胞を回収します。次に、カセットDNAと10個の電気キュベットを入れたマイクロチューブを氷の上に置きます。氷の上に置いたまま、上清を捨て、1.2モルソルビトール15ミリリットルを加え、チューブを静かに振って細胞を再懸濁し、細胞を1050Gおよび摂氏4度で3分間遠心分離します。上清を捨て、2回目のソルビトール洗浄を行います。.遠心分離後、上清を捨てます。次に、細胞を再懸濁し、15ミリリットルの円錐管にすべてを集めます。次に、1.2モルソルビトールを2.4ミリリットルまで追加します。細胞のチューブを氷の上に保ちます。次に、200マイクロリットルのソルビトール懸濁細胞を融合PCRコンストラクトを含むチューブに加え、よく混合し、サンプルを電気キュベットに移します。PCRカセットを過剰に使用しないことが重要です。次のオプションを使用してセルをエレクトロポレートします:各エレクトロキュベットに600マイクロリットルの1.2モルソルビトールを追加して、合計量を800マイクロリットルにします。次に、細胞を4つのYESプレートに広げます。プレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。次に、YESとG418でレプリカプレーティングを行い、プレートをさらに3日間インキュベートします。YESとG418プレートを併用するごとに、アデニンなしのYESとアデニンプレートなしのPMGにレプリカめっきを行います。レプリカプレートを摂氏30度で1〜2日間インキュベートし、アデニンプレートのないYESのコロニーの一部が白色を示すまでインキュベートします。アデニンなしのYESとアデニンプレートなしのPMGを比較し、アデニンプレートなしのYESでピンク色または白色を示す細胞を選択し、アデニンプレートなしのPMGでも増殖する細胞を選択します。アデニンを含まないPMGで増殖しないコロニーは偽陽性であるため、選択しないでください。各コロニーを選び、それをザイモリアーゼ100Tのミリリットルあたり2.5ミリグラムを含むSPZ溶液の10マイクロリットルに加えます。次に、コロニーを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。インキュベーション後、この溶液の1マイクロリットルをコロニーPCRの開始テンプレートとして使用します。選択したコロニーを消化し、テキストプロトコルに従ってゲル電気泳動を行った後、XHO1によってPCR産物が切断されたコロニーをマークし、YESとG418プレートにパッチします。分裂酵母細胞からのgDNAの単離、およびテキストプロトコールに従ってPCR産物のシーケンシングを行った後、得られた配列を野生型配列と比較して変異を同定します。突然変異が野生型細胞に再導入されたら、スポッティングを使用して、新しく作成された突然変異細胞の表現型を確認します。このビデオで示されているプロトコルを使用して生成されたrpt4変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。この図に示すように、コロニーは関連するプレート上に発見され、細胞数は減少しています。ヘテロクロマチン領域に挿入されたアデニンレポーターは、野生型細胞でサイレンシングされ、アデニンプレートのないYES上に赤色のコロニーを産生します。ヘテロクロマチンが不安定化し、アデニンレポーターが発現すると、clr4-delta変異体で見られるように、アデニンプレートのないYES上に白いコロニーが観察されます。スクリーニングされたrpt4変異体は、rpt4-1変異体が最も深刻なヘテロクロマチンの不安定化を示すことを示すことが示されています。このテクニックを習得すれば、2週間で目的のミュータントを手に入れることができます。この手順を試行する際は、誤検知が予想よりも頻繁に発生するため、誤検知を排除することが重要です。この手順に続いて、タンパク質の性質などの追加の質問に答えるために、タンパク質精製や酵素活性試験などの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、目的の表現型を持つ標的遺伝子の変異体を生成する方法についてよく理解できるはずです。

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、特定の標的配列のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、大腸菌の中で、生体内で行われるこの方法は、、新たな酵素活性を進化させ、機能の選択と結合することができる方法を示します。...

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学ぶ 分裂酵母におけるランダム変異導入法で、ヘテロクロマチン不安定化変異をスクリーニングする手法です。rpt4+遺伝子を標的とし、エピジェネティクス制御機構の解明に貢献します。

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

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